退熱方中苷類成分的含量測(cè)定及其作用機(jī)制研究

尚子慧，劉清泉，圖雅，蘇芮，吳明俠（.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院感染性疾病科，北京 0000；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 00700；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥發(fā)展中心，北京 00700）

退熱方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院劉清泉教授結(jié)合多年臨床治療經(jīng)驗(yàn)自擬。該方由荊芥穗、梔子、牛蒡子、生麻黃、杏仁、柴胡、青蒿、玄參8 味藥組成，具有解表散風(fēng)、宣肺涼血的功效，臨床多用于治療流行性感冒，且療效顯著[1]。本課題組前期[2-4]采用UHPLC-Q-Orbitrap Fusion HRMS技術(shù)對(duì)退熱方湯劑中所含成分進(jìn)行了解析，并發(fā)現(xiàn)退熱方中多種苷類成分均具有抗流感和抗炎作用。該方化學(xué)成分復(fù)雜，組方藥材產(chǎn)地分布廣泛，質(zhì)量控制有一定難度。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法，建立退熱方中6 種苷類成分同時(shí)測(cè)定的方法，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與體外實(shí)驗(yàn)，挖掘6種成分抗流感、抗炎作用的信號(hào)通路，探求退熱方發(fā)揮藥理活性的潛在作用機(jī)制，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試劑與試藥退熱方處方中藥（荊芥穗、牛蒡子、梔子、生麻黃、苦杏仁、青蒿、玄參、柴胡）購(gòu)于鄭州張仲景大藥房順河路店，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊晶凡副教授鑒定，荊芥穗為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗，牛蒡子為菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實(shí)；梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實(shí)；生麻黃為麻黃科植物草麻黃EphedrasinicaStapf 的干燥草質(zhì)莖；苦杏仁為杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟種子；青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分；玄參為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根。牛蒡子苷對(duì)照品（批號(hào)：RFS-N00411812016，純度＞98%）、哈巴俄苷對(duì)照品（批號(hào)：RFS-H02001911019，純度＞98%）、苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：RFSK00111812016，純度＞98%）、西紅花苷Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)：RFS-X00202010023，純度＞98%），成都瑞芬思生物科技有限公司；木犀草苷（批號(hào)：MUST-17030405，純度＞99.77%），成都曼思特生物科技有限公司；梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：drk-0541-960529，純度＞98%），成都德銳可生物科技有限公司；甲醇、甲酸均為色譜純；試驗(yàn)用水為自制超純水。

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清，美國(guó)GIBCO 公司；噻唑蘭（MTT，批號(hào)：917Q0511）、PBS 緩沖液、PBST 緩沖液、小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、NO 檢測(cè)試劑盒、牛血清白蛋白，北京Solarbio 科技有限公司；單組分TMB 顯色液和終止液，武漢伊萊瑞特公司；二甲基亞砜（DMSO）和脂多糖（LPS），美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器WatersE2695 型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；METTLER 十萬(wàn)分之一分析天平，梅特勒—托利多儀器有限公司；SB-1100型水浴鍋，上海愛(ài)郎儀器有限公司；KQ-50B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；超純水機(jī)，杭州澤南科技有限公司；N-1100 減壓旋蒸儀，上海愛(ài)郎儀器有限公司；高效液相色譜C18柱，Agela天津博納艾杰爾科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；IC1000 Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司；ECLIPSETS100LED-FMV顯微鏡，日本東京尼康公司；TDZ4-WS 臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Venusil MP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，95%→65%B；10～25 min，65%→50%B；25～50 min，50%→25%B；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃，流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備精密稱取苦杏仁苷、梔子苷、木犀草苷、牛蒡子苷、哈巴俄苷、西紅花苷Ⅰ對(duì)照品，用甲醇定容于容量瓶中，搖勻，經(jīng)稀釋后，得質(zhì)量濃度分別為苦杏仁苷2.02 mg·mL-1、梔子苷2.00 mg·mL-1、木犀草苷2.01 mg·mL-1、牛蒡子苷1.49 mg·mL-1、哈巴俄苷0.25 mg·mL-1、西紅花苷Ⅰ0.25 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備按照處方量稱取荊芥穗、牛蒡子、梔子、生麻黃、苦杏仁、青蒿、玄參及柴胡，根據(jù)本課題組前期優(yōu)化的最佳水提工藝，10 倍量水浸泡30 min，武火煮開(kāi)后轉(zhuǎn)用文火煎煮20 min，過(guò)濾。濾渣加10 倍量水后繼續(xù)煎煮過(guò)濾，合并濾液。然后精密量取25.00 mL 低溫水浴蒸干，用60%甲醇定容至10 mL容量瓶中，用0.22 μm濾膜過(guò)濾即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示供試品分離效果較好，且在254 nm 波長(zhǎng)下，各對(duì)照品與供試品保留時(shí)間一致，具有較好的專屬性，理論塔板數(shù)均不低于5 000。

2.4.2線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加入甲醇制成每1 mL含有苦杏仁苷2 000 μg、梔子苷2 000 μg、木犀草苷2 000 μg、牛蒡子苷1 500 μg、西紅花苷Ⅰ250 μg、哈巴俄苷250 μg 的混合對(duì)照品溶液，再逐級(jí)稀釋，共制得6個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述各個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得到各個(gè)對(duì)照品的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。見(jiàn)表1。結(jié)果表明苦杏仁苷、梔子苷、木犀草苷、牛蒡子苷、西紅花苷Ⅰ和哈巴俄苷在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜峰面積。結(jié)果苦杏仁苷、梔子苷、木犀草苷、牛蒡子苷、西紅花苷Ⅰ和哈巴俄苷峰面積的RSD 分別為1.84%、1.42%、0.96%、1.08%、1.57%和0.76%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在室溫條件下分別于0、2、6、10、16、24 h 各進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積。結(jié)果供試品溶液中苦杏仁苷、梔子苷、木犀草苷、牛蒡子苷和西紅花苷Ⅰ、哈巴俄苷峰面積的RSD 分別為2.43%、1.40%、1.76%、2.51%、2.08%和2.29%，說(shuō)明該供試品在室溫條件下24 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，可供含量測(cè)定。

2.4.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算各成分含量及平均值。結(jié)果苦杏仁苷、梔子苷、木犀草苷、牛蒡子苷、西紅花苷Ⅰ和哈巴俄苷的平均含量（n=6）分別為3.82、4.03、1.03、1.95、0.22、0.14 mg·g-1，RSD 分別為1.88%、1.91%、0.56%、0.66%、1.14%和1.20%，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.6加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的供試品溶液9份，分成3組，每組3份，每份吸取10.00 mL，分別加入相當(dāng)于供試品溶液中80%、100%、120%的牛蒡子苷、梔子苷、哈巴俄苷、苦杏仁苷、木犀草苷和西紅花苷Ⅰ含量的對(duì)照品，水浴蒸干后用60%甲醇復(fù)溶，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 退熱方中6 種苷類成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 2 Results of recovery rate of six glycoside components in the Tuire Prescription（n=9）

2.5 樣品含量測(cè)定按退熱方處方量取3份樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密量取10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 退熱方6 種苷類成分的含量測(cè)定結(jié)果（mg·g-1，n=3）Table 3 Results of content determination of six glycoside components in Tuire Prescription（mg·g-1，n=3）

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.6.1退熱方苷類成分潛在作用靶點(diǎn)的獲取 利用Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取6 個(gè)苷類成分的2D 結(jié)構(gòu)信息與SMILES 格式文件，通過(guò)SWissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)初步獲得化學(xué)成分的靶點(diǎn)信息，將靶點(diǎn)信息整合、去重，共收集潛在作用靶點(diǎn)73個(gè)。

2.6.2疾病靶點(diǎn)的獲取 以“流行性感冒（Influenza）”和“炎癥（Inflammation）”為關(guān)鍵詞，分別輸入到GeneCards、DisGenet 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，將上述數(shù)據(jù)庫(kù)所獲得的靶點(diǎn)經(jīng)中位數(shù)篩選保留相關(guān)性較強(qiáng)的疾病靶點(diǎn)，合并去重，通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行規(guī)范，共獲得疾病靶點(diǎn)6 221個(gè)。

2.6.3交集靶點(diǎn)與通路獲取 利用Venny 2.1.0在線平臺(tái)，共獲得退熱方中6個(gè)苷類成分與疾病的交集靶點(diǎn)54 個(gè)。通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析，選定物種為“Homo sapiens”，通過(guò)微生信網(wǎng)站將富集結(jié)果可視化。KEGG 通路富集分析圖見(jiàn)圖2。

圖2 退熱方苷類成分的KEGG 通路富集分析氣泡圖Figure 2 KEGG enrichment analysis bubble diagram of glycoside components in the Tuire Prescription

2.6.4退熱方“苷類成分-靶點(diǎn)-疾病-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將成分、靶點(diǎn)、疾病、通路信息匯總，利用Cytoscape 3.2.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，繪制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用圖。見(jiàn)圖3。

圖3 退熱方“苷類成分-靶點(diǎn)-疾病-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)Figure 3 The glycoside “components-targets-diseases-signaling pathways” network of Tuire Prescription

2.7 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.7.1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 9.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7.2細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠RAW264.7 單核巨噬細(xì)胞置于含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.7.3MTT 法測(cè)定細(xì)胞的增殖能力 RAW264.7 細(xì)胞按照每孔5×105個(gè)·mL-1的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜使貼壁，棄去上清。設(shè)置空白組（培養(yǎng)基）、對(duì)照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、不同濃度給藥組（5、10、20、40、100、200 μg·mL-1），每組平行6 孔。給藥組加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基100 μL，空白組及對(duì)照組加入培養(yǎng)基100 μL，避光于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入10 μL 濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄96孔板中溶液，每孔加入DMSO 150 μL；恒溫振蕩器上振蕩20 min，用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定其吸光度。細(xì)胞增殖活力=[OD（給藥組）-OD（空白組）]/[OD（對(duì)照組）-OD（空白組）]×100%。

結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，苦杏仁苷、梔子苷、西紅花苷Ⅰ和哈巴俄苷給藥組濃度在5～200 μg·mL-1范圍內(nèi)RAW264.7 細(xì)胞活力無(wú)明顯變化（P＞0.05），牛蒡子苷給藥組濃度在5～100 μg·mL-1范圍內(nèi)細(xì)胞活力無(wú)明顯變化（P＞0.05）；木犀草苷給藥組濃度在5～40 μg·mL-1范圍內(nèi)細(xì)胞活力顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖4。根據(jù)各給藥組細(xì)胞活力變化，綜合考慮選擇5、10、20 μg·mL-1的給藥濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 退熱方6 種苷類成分對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響Figure 4 Effect of six glycoside components in Tuire Prescription on RAW264.7 cell viability

2.7.4ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清TNF-α的表達(dá) RAW264.7細(xì)胞按每孔5×105個(gè)·mL-1的密度種于96 孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，設(shè)置空白組、LPS模型組和各成分低、中、高劑量給藥組（5、10、20 μg·mL-1）?？瞻捉M加入不含藥物的培養(yǎng)基，模型組和給藥組分別給予1 μg·mL-1LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清培養(yǎng)液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各成分不同劑量組對(duì)TNF-α 釋放的影響。結(jié)果見(jiàn)圖5。與空白組比較，LPS 模型組TNF-α分泌水平顯著增加（P＜0.001）；與LPS模型組比較，各成分給藥劑量組TNF-α 分泌水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），說(shuō)明退熱方中6 種苷類成分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α釋放均具有抑制作用。

圖5 退熱方6 種苷類成分對(duì)TNF-α 表達(dá)的影響Figure 5 Effects of six glycoside components in Tuire Prescription on TNF-α expression

2.7.5Griess 法檢測(cè)細(xì)胞上清NO 水平 RAW264.7 細(xì)胞按5×105個(gè)·mL-1的密度接種于96 孔板，每孔500 μL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過(guò)夜，吸棄上清，設(shè)置空白組、LPS 模型組和各成分低、中、高劑量給藥組（5、10、20 μg·mL-1），每組3 個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入不含藥物的培養(yǎng)基，模型組和給藥組分別給予1 μg·mL-1LPS 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清培養(yǎng)液。按照NO 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，取50 μL上清液，分別加入50 μL GriessⅠ和50 μL Griess Ⅱ，用亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用酶標(biāo)儀于540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組NO 水平。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 退熱方6 種苷類成分對(duì)NO 表達(dá)的影響Figure 6 Effects of six glycoside components in Tuire Prescription on NO expression

與空白組比較，LPS 模型組NO 分泌水平顯著增加（P＜0.001）；與LPS模型組比較，各成分不同劑量組NO 分泌水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），表明退熱方中6 種苷類成分對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO具有抑制作用。

3 討論

3.1 測(cè)定指標(biāo)的選擇退熱方由荊芥穗、梔子、牛蒡子、生麻黃、杏仁、柴胡、青蒿、玄參8 味藥組成，方中荊芥穗辛散微溫，具有抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛作用[5]，佐以梔子、牛蒡子宣表邪、散郁熱，生麻黃、杏仁宣肺平喘，柴胡、青蒿清熱透邪，疏肝升陽(yáng)，玄參有清熱涼血補(bǔ)益之功。諸藥配伍，達(dá)到清熱解毒、解表散風(fēng)的功效。由于中藥療效的產(chǎn)生是各成分之間協(xié)同作用的結(jié)果，只有從中醫(yī)整體觀出發(fā)，測(cè)定多種有效成分，才能更加科學(xué)、客觀地評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量。本研究通過(guò)查閱2020 年版《中國(guó)藥典》等文獻(xiàn)，探尋方中各藥味抗炎抗病毒的有效成分、特征成分，并結(jié)合前期對(duì)退熱方湯劑中所含化學(xué)成分的研究結(jié)果，初步確定退熱方中木犀草苷、牛蒡子苷、哈巴俄苷、梔子苷、西紅花苷Ⅰ和苦杏仁苷等6 種主要活性成分，并采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定其含量。

荊芥穗和青蒿中所含的木犀草苷具有顯著的抗炎、抗病毒作用[6-7]，可作為退熱方測(cè)定指標(biāo)之一。牛蒡子苷和哈巴俄苷是牛蒡子和玄參中的主要藥效成分，具有抗炎、抗病毒、降血糖和增強(qiáng)免疫力等作用[8-9]。梔子主要藥效成分為梔子苷和西紅花苷Ⅰ，具有抗炎、抗氧化等作用[10，12]?？嘈尤受帐强嘈尤实奶卣鞒煞?，苦杏仁苷能顯著抑制NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子的激活，具有抗炎作用[13]，常被作為含量測(cè)定指標(biāo)[14]。故本研究以這6種苷類成分為測(cè)定指標(biāo)，建立同時(shí)測(cè)定其含量的HPLC法并進(jìn)行方法學(xué)考察。

3.2 供試品溶液制備方法的考察本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定退熱方中6 種苷類成分的含量，以6 種成分提取率為考察指標(biāo)，考察了不同加水量（6、8、10、12 倍），煎煮次數(shù)（1、2、3 次）及煎煮時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)提取率的影響，最終確定該復(fù)方最佳水提工藝為10 倍量的水，煎煮2 次，每次20 min。同時(shí)，考察了退熱方水煎液蒸干后復(fù)溶的溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用60%甲醇復(fù)溶，各組分含量較高。

3.3 色譜條件的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，并對(duì)不同濃度甲酸水（0.1%、0.2%）、磷酸水（0.1%、0.2%）以及純水進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，以甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相，色譜峰形較為對(duì)稱，出峰較好。本研究采用DAD 檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在254 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)得的各成分色譜峰值最高，峰型較好，重復(fù)性及分離效果最佳。

3.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)，篩選出與退熱方發(fā)揮抗流感和抗炎作用相關(guān)的10 條通路、54 個(gè)基因。其中與癌癥相關(guān)的通路有2 條（Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer），與病原體感染相關(guān)的通路有1 條（Hepatitis B），與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路有7 條（MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和鈣信號(hào)通路）。

大量研究表明缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）通路是重要的炎癥通路，在細(xì)菌感染和病毒感染中都已經(jīng)檢測(cè)到HIF-1α的表達(dá)。白細(xì)胞介素17（IL-17）是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，可通過(guò)MAP 激酶途徑和核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。MAPK 信號(hào)通路主要有ERK、JNK、p38/MAPK 等分支路線，與細(xì)胞炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)。木犀草苷具有抗氧化和抗炎作用，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2 表達(dá)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑抑制人口腔癌細(xì)胞的遷移和侵襲[15]；Shi 等[16]發(fā)現(xiàn)木犀草苷能通過(guò)抑制IL-1β的表達(dá)和巨噬細(xì)胞的活化發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。Zhang 等[17]發(fā)現(xiàn)梔子苷能通過(guò)降低EGFR/PI3K/AKT 通路活性和抑制鈣信號(hào)通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用。Li等[18]報(bào)道牛蒡子苷通過(guò)下調(diào)MAPK和Akt 途徑的激活，表現(xiàn)出有效的抗炎和抗過(guò)敏活性。哈巴俄苷能通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞中COX-2和iNOS的mRNA 水平以及蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB 途徑活化，發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[19]。西紅花苷Ⅰ主要通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB 通路和NF-κB p65 向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制ROS 的產(chǎn)生和促炎細(xì)胞因子的分泌，減輕炎癥反應(yīng)[20]。苦杏仁苷可下調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2因子水平起到抗炎作用。綜上所述，退熱方中6種苷類成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、干預(yù)內(nèi)分泌代謝等途徑發(fā)揮抗炎、抗流感等藥理活性。

3.5 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析本研究利用LPS誘導(dǎo)建立RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥模型，采用MTT 法考察6 種苷類成分不同給藥濃度對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示各成分組隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞存活率均有所下降，且當(dāng)給藥濃度小于20 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化。因此，選擇5、10、20 μg·mL-1的給藥濃度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與LPS 模型組比較，6 種苷類成分不同劑量給藥組TNF-α 和NO 的水平均顯著降低，且呈劑量依賴性，表明6種苷類成分具有明確的抗炎作用。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析，退熱方苷類成分可能通過(guò)MAPK、PI3K-Akt、NF-κB、IL-17等信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

本研究建立了HPLC 同時(shí)測(cè)定退熱方中木犀草苷、牛蒡子苷、哈巴俄苷、梔子苷、西紅花苷Ⅰ和苦杏仁苷6 種苷類成分的分析方法，該方法操作方便、準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好。同時(shí)，初步探討了6種苷類成分發(fā)揮抗流感、抗炎等功效的作用機(jī)制，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該復(fù)方中苷類成分具有抗炎作用，為揭示退熱方藥效作用的多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用機(jī)制提供依據(jù)，為該方的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供了理論支持。