UPLC-MS/MS 法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析萬氏牛黃清心丸中14 種膽汁酸成分

陳濤，林詩鈴，林逸凡，陳雪婷，鄭燕芳，黃鳴清（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

萬氏牛黃清心丸是由牛黃、黃連、朱砂、梔子、郁金、黃芩共6 味中藥材制備而成的中藥復(fù)方制劑，現(xiàn)收載于《中國藥典》（2020年版一部）[1]，具有清熱解毒，鎮(zhèn)驚安神的功效。臨床上用于熱入心包、熱盛動風(fēng)證，癥見高熱煩躁、神昏譫語及小兒高熱驚厥。方中的牛黃清心解毒、豁痰開竅，黃連清熱燥濕、瀉火解毒，為君藥。萬氏牛黃清心丸以牛黃為君藥，決定其質(zhì)量控制的重點是牛黃及其代用品的質(zhì)量[2]，牛黃中的膽酸類成分是其主要活性成分，因此對萬氏牛黃清心丸中的膽汁酸成分進(jìn)行定量研究具有重要意義。牛黃含有甘氨膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、鵝去氧膽酸等多種膽汁酸[3-5]。藥理研究[6-9]表明，膽汁酸類成分具有保肝、利膽、降壓、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛等作用。萬氏牛黃清心丸現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對牛黃質(zhì)控只規(guī)定其膽紅素含量的測定[1]，相關(guān)報道[10]也僅對膽紅素含量進(jìn)行測定。因此建立萬氏牛黃清心丸中膽汁酸成分的含量測定方法對評價其質(zhì)量具有重要意義。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）具有分析速度快、效率高、檢測靈敏度高等特點，在中藥分析以及質(zhì)量控制領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多[11-12]。故本實驗采用UPLC-MS/MS 法同時測定萬氏牛黃清心丸中牛磺膽酸、7-酮脫氧膽酸、甘氨膽酸、3-氧代脫氧膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、?；敲撗跄懰徕c、膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、牛磺石膽酸鈉、甘氨石膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸的含量，同時以化學(xué)模式識別法對其含量測定結(jié)果進(jìn)行評價，以期為萬氏牛黃清心丸的質(zhì)量控制提供新的依據(jù)。

1 材料與試藥

1.1 儀器DIONEX UITIMATE 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)四級桿-靜電軌道肼質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾公司），配備加熱電噴霧離子源（HESI）；MILLI-Q Direct16 超純水制備儀（美國Millipore 公司）；CPA225D 十萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；XM-400UHP 小美靜音超聲儀（昆山小美超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑甘氨膽酸（批號：Y08A9E57765）、3-氧代脫氧膽酸（批號：N07GY167164）、牛磺鵝去氧膽酸（批號：Y09S8K43540）、膽酸（批號：T16J8Q28663）、甘氨鵝脫氧膽酸（ 批號：Y29M9K57235）、甘氨脫氧膽酸（批號 ：Y27M9E56969）、鵝去氧膽酸（批號：Z01011LA14）、甘氨石膽酸（批號：B29J11K119775）、去氧膽酸（批號：S05N6I5476）、石膽酸（批號：B24S10J98701）、脫氫膽酸（批號：S30J9I64022）、7-酮脫氧膽酸（批號N30GB169735），經(jīng)HPLC 測定，純度均大于98%，?；悄懰幔兌取?5%，批號：B15J11J118403）、?；鞘懰徕c（純度≥97%，批號：Y06N9K74072），以上對照品均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；?；敲撗跄懰徕c（批號：B26J9J53831），美國Sigma-Aldrich 公司，經(jīng)HPLC 測定，純度≥95%。質(zhì)譜甲醇為LC-MS級（美國賽默飛世爾公司），甲酸為HPLC級（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），其余試劑均為分析純。萬氏牛黃清心丸[S1，批號：200002；S2，批號：190006；S3，批號：200003，S4，批號：210001；S5，批號：210002；S6，批號：201005；S7，批號：210006；S8，批號：210007；S9，批號：220002；S10，批號：220003，S11，批號：210005；S12，批號：210008；S13，批號：190008；S14，批號：210003；S15，批號：210004，國藥集團(tuán)馮了性（佛山）藥業(yè)有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

2.1.1色譜條件 Thermo Fisher Scientfic Bremen Hypersil GOLD 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～0.5 min，20%A；0.5～1.5 min，20%A～70%A；7～8 min，70%A～61%A；8～14 min，61%A～80%A；14～15 min，80%A～85%A；15～16 min，85%A～90%A；16～17.5 min，90%A～20%A；17.5～19 min，20%A）；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2質(zhì)譜條件 采用加熱電噴霧離子源（HESI）負(fù)離子模式，噴霧電壓：-3.0 kV，毛細(xì)管溫度：325 ℃，輔助氣加熱溫度：350 ℃，鞘氣流速：45 Arb，輔助氣流速：10 Arb，質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)采用平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）掃描模式，各待測成分及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見表1，對照品溶液及供試品溶液中各成分的色譜圖見圖1。

圖1 萬氏牛黃清心丸中14 種膽汁酸成分UPLC-MS/MS 色譜圖Figure 1 UPLC-MS/MS chromatogram of 14 cholic acids in Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

表1 萬氏牛黃清心丸各待測成分及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimum parameters of mass spectrum for each component in Wanshi Niuhuang Qingxin Pills and internal standard

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制 分別精密稱取14種對照品，用甲醇溶解配制為2 mg·mL-1的單一對照品母液。分別精密量取各對照品母液適量，用甲醇稀釋，即得混合對照品溶液。精密稱取脫氫膽酸對照品（內(nèi)標(biāo)）適量，用甲醇溶解配制為濃度2 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)母液，用甲醇溶液稀釋至濃度為20 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取萬氏牛黃清心丸0.1 g，加入10 mL 甲醇，超聲提取30 min 后，放冷，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取適量供試品溶液，置于棕色進(jìn)樣瓶中，按1∶1體積比加入內(nèi)標(biāo)溶液，得到含有內(nèi)標(biāo)10 ng·mL-1的供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系及定量限考察 精密量取“2.2.1”項下混合對照品母液，用甲醇稀釋制成一系列濃度的混合對照品溶液，按照1∶1體積比加入內(nèi)標(biāo)溶液，得各濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線待測對照品混合溶液。按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，考察待測物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比（Ai/As）與待測物濃度（C）的線性關(guān)系，用Ai/As 對待測物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。以信噪比S/N≈3 和S/N≈10 分別作為各對照品的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果見表2。

表2 萬氏牛黃清心丸待測成分的線性方程Table 2 Linear equation of tested components in Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

2.3.2精密度試驗 精密量取混合對照品溶液適量，制備成各成分濃度依次為640.0、40.0、414.0、5.0、31.0、141.0、1740.0、23.0、103.0、2.0、0.8、42.0、412.0、3.0 ng·mL-1的對照品混合液，對半稀釋兩次，得到低、中、高濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測定6次，測定日內(nèi)精密度，連續(xù)測定3 d，測定日間精密度。結(jié)果見表3。計算得到14 種成分的日內(nèi)精密度RSD 在1.12%～4.56%之間，日間精密度RSD 在0.59%～4.43%之間，表明儀器精密度良好。

表3 萬氏牛黃清心丸的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Test results of precision，repeatability and stability of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

2.3.3穩(wěn)定性試驗 精密稱取萬氏牛黃清心丸（S1）0.1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件，于0、2、4、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3。計算得到14種成分峰面積的RSD在1.25%～4.33%之間，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復(fù)性試驗 取同一批萬氏牛黃清心丸（S1），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到各成分濃度及其RSD。結(jié)果見表3。14 個成分RSD 在0.73%～4.50%之間，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收率試驗 精密量取已知成分含量的萬氏牛黃清心丸（S1）0.05 g，平行9 份，分別加入約相當(dāng)于供試品50%、100%、150%含量的14種成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算14 種成分的平均加樣回收率及其RSD。結(jié)果見表4。平均加樣回收率在95.6%～103.6%之間，RSD 在0.52%～4.62%之間。

表4 萬氏牛黃清心丸的加樣回收率試驗結(jié)果（±s，n=3）Table 4 Test results of recovery rate of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills（±s，n=3）

表4 萬氏牛黃清心丸的加樣回收率試驗結(jié)果（±s，n=3）Table 4 Test results of recovery rate of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills（±s，n=3）

化合物?；悄懰針悠泛?μg 16.01化合物甘氨鵝脫氧膽酸樣品含量/μg 0.59 7-酮脫氧膽酸1.00甘氨脫氧膽酸2.58甘氨膽酸10.36?；鞘懰徕c0.05 3-氧代脫氧膽酸0.13甘氨石膽酸0.02?；蛆Z去氧膽酸0.78鵝去氧膽酸1.06?；敲撗跄懰徕c3.52去氧膽酸10.29膽酸43.49加入量/μg 8.00 16.01 24.01 0.50 1.00 1.51 5.18 10.36 15.54 0.06 0.13 0.19 0.39 0.78 1.16 1.76 3.52 5.29 21.75 43.49 65.24測得量/μg 23.78±0.097 31.83±0.075 39.55±0.383 1.50±0.011 1.99±0.027 2.56±0.056 15.81±0.085 20.84±0.298 25.43±0.184 0.19±0.001 0.26±0.003 0.32±0.009 1.17±0.018 1.51±0.016 1.98±0.017 5.33±0.024 6.90±0.112 8.83±0.234 66.40±0.336 86.55±0.686 106.54±1.528平均回收率/%97.1±1.2 98.8±0.5 98.0±1.6 97.8±2.3 97.8±2.7 103.1±3.7 103.2±1.6 101.1±2.9 96.9±1.2 103.3±1.1 101.7±2.5 100.5±4.5 101.9±4.7 95.6±2.1 103.6±1.4 102.7±1.3 95.7±3.2 100.3±4.4 103.3±1.5 99.0±1.6 96.6±2.3 RSD/%1.21 0.52 1.64 2.35 2.73 3.64 1.64 2.81 1.22 1.11 2.41 4.54 4.62 2.21 1.41 1.34 3.38 4.49 1.55 1.64 2.47石膽酸0.07加入量/μg 0.29 0.59 0.88 1.29 2.58 3.87 0.03 0.05 0.08 0.01 0.02 0.03 0.53 1.06 1.59 5.14 10.29 15.43 0.03 0.07 0.10測得量/μg 0.87±0.015 1.16±0.024 1.46±0.048 3.90±0.049 5.21±0.094 6.20±0.098 0.07±0.001 0.10±0.002 0.13±0.003 0.03±0.001 0.04±0.001 0.05±0.001 1.58±0.016 2.08±0.011 2.62±0.029 15.59±0.268 20.23±0.327 25.81±0.602 0.10±0.001 0.14±0.003 0.18±0.003平均回收率/%97.7±5.0 98.7±4.2 99.9±5.4 102.5±3.8 102±3.6 95.7±2.5 95.6±1.6 96.6±3.1 100.6±4.0 97.9±3.5 102.3±2.4 101.3±3.2 98.5±3.0 96.4±1.1 98.3±1.8 103.1±5.2 96.7±3.2 100.6±3.9 96.0±2.5 102.1±5.0 100.8±2.5 RSD/%3.17 4.25 4.55 3.71 3.62 2.73 1.74 3.32 3.94 3.51 2.44 3.17 3.19 1.14 1.91 3.12 3.34 3.91 2.74 4.61 2.51

2.4 含量測定分別精密稱取不同批次的萬氏牛黃清心丸適量，按“2.2.2”項下的方法制備樣品，以“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算各批次萬氏牛黃清心丸中14種化合物的含量。結(jié)果見表5。

表5 15 批萬氏牛黃清心丸中14 種成分含量測定（n=3）Table 5 Determination of 14 components content in 15 batches of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills（n=3）

2.5 化學(xué)計量學(xué)分析

2.5.1聚類分析 為考察不同批次萬氏牛黃清心丸之間的成分含量差異性，采用SPSS 26.0 軟件，以所測得的15批萬氏牛黃清心丸中14種膽汁酸成分含量為變量，用瓦爾德法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果見圖2。15批藥材可聚為2 類，其中S12、S14、S15 聚為一類，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S13 聚為一類，可見不同批次樣品成分存在一定的差異。

圖2 15 批萬氏牛黃清心丸的聚類分析Figure 2 Cluster analysis of 15 batches of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

2.5.2主成分分析（PCA） 采用SPSS 26.0軟件對不同批次的萬氏牛黃清心丸中14 個膽汁酸成分含量進(jìn)行主成分分析。前3 個主成分累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到91.622%，說明3 個主成分能充分體現(xiàn)萬氏牛黃清心丸樣品的原始變量信息。以前3 個主成分進(jìn)行投影，計算不同批次的萬氏牛黃清心丸的綜合評價得分，用于分析單個樣品在整體中的分布情況，將綜合評價得分導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中，繪制主成分分析圖。見圖3。

圖3 15 批萬氏牛黃清心丸的PCA 散點得分圖Figure 3 PCA scatter scores of 15 batches of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

2.5.3正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 為分析不同批次萬氏牛黃清心丸之間各膽汁酸成分含量的相似性和差異性，篩選出其差異標(biāo)志物，采用SIMCA 14.1 軟件對14 種膽汁酸成分含量建立OPLSDA 模型。見圖4-A。該模型中自變量擬合指數(shù)（R2x）為0.909，因變量擬合指數(shù)（R2y）為0.932，模型預(yù)測指數(shù)（Q2）為0.841，R2和Q2都超過0.5，表示模型擬合結(jié)果可被接受[13]。通過置換檢驗，置換次數(shù)為200驗證該模型是否過擬合。見圖4-B。結(jié)果Q2回歸線截距小于0，說明模型不存在過擬合，表明模型有效，認(rèn)為其結(jié)果可用于分析不同批次萬氏牛黃清心丸之間的差異性。同時，計算不同成分的VIP值。見表6。

圖4 15 批萬氏牛黃清心丸的OPLS-DA 得分圖（A）和模型交叉驗證結(jié)果（B）Figure 4 OPLS-DA score chart （A）and model cross validation results（B）of 15 batches of Wanshi Niuhuang Qingxin Pills

3 討論

3.1 色譜條件的選擇比較了Acauity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm.1.7 μm）、Themo Bremen Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）等色譜柱。結(jié)果Thermo Bremen Hypersil GOLD 對樣品中膽汁酸成分的保留和分離效果較好，峰型尖銳，能實現(xiàn)對萬氏牛黃清心丸中14種膽汁酸成分的快速、有效的分離。

本研究還比較了不同流動相體系（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水）對色譜圖峰型及各待測成分間分離的影響。用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相時，色譜圖的峰型較好，無拖尾現(xiàn)象，萬氏牛黃清心丸各成分的分離度及響應(yīng)值也較好。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化本研究內(nèi)標(biāo)物選擇脫氫膽酸，脫氫膽酸與本研究中測定的14 個膽汁酸成分具有相同的膽烷酸母核，且在萬氏牛黃清心丸樣品中未檢出該成分，與其他化合物之間不存在基質(zhì)效應(yīng)，不會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響，故選擇脫氫膽酸作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行測定。

同時，比較了在正、負(fù)離子掃描模式下，14 種膽汁酸成分的響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下各成分響應(yīng)豐度高，且在PRM 掃描模式下，通過改變碰撞能量，可篩選出響應(yīng)較高的碎片離子作為定量子離子。

3.3 化學(xué)計量學(xué)分析通過對不同批次萬氏牛黃清心丸中的14 種膽汁酸成分含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)各批次樣品之間的膽汁酸成分含量有一定的差異。聚類分析可將所有批次樣品聚為兩類，S12、S14、S15聚為一組，其他批次樣品聚為一組。進(jìn)一步對各成分含量進(jìn)行主成分分析，主成分分析散點得分圖中，不同批次樣品在圖上呈分散狀，根據(jù)樣品散點之間距離，S12、S14、S15歸為一組，其他批次樣品歸為一組。結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。采用OPLS-DA 方法，以P＜0.05，VIP ≥1 為條件篩選不同批次萬氏牛黃清心丸差異成分，獲得?；悄懰帷⒏拾蹦懰?、牛磺鵝去氧膽酸、?；敲撗跄懰徕c、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、去氧膽酸、膽酸等9 個成分。根據(jù)含量測定的結(jié)果，9 個差異性成分中?；悄懰?、甘氨膽酸、去氧膽酸、膽酸等成分的含量較高，占成分總量的89%以上，它們的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為217.08～664.53、119.79～334.06、767.89～983.58、146.32～263.03 μg·g-1。依據(jù)本次測定的萬氏牛黃清心丸樣品結(jié)果，若本品每丸含有的牛黃以牛磺膽酸、甘氨膽酸、去氧膽酸、膽酸總量計，則每丸中牛黃含量范圍為159.8～430.8 mg。藥理研究[6，14]表明，牛磺膽酸、甘氨膽酸、去氧膽酸、膽酸具有保肝、利膽、抗炎等功效。因此，其可作為差異性指標(biāo)成分對不同批次萬氏牛黃清心丸進(jìn)行區(qū)分。

本研究結(jié)果顯示，同一廠家中的不同批次產(chǎn)品在含量上存在較大差異，其原因可能是不同批次產(chǎn)品中的牛黃存在質(zhì)量差異，導(dǎo)致了最終成藥檢測時的差異。建議將差異性化合物（?；悄懰帷⒏拾蹦懰?、去氧膽酸、膽酸）作為評價指標(biāo)建立質(zhì)量控制體系，從而監(jiān)測制劑的批間質(zhì)量差異。

本研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)建立了同時測定萬氏牛黃清心丸中14 種膽汁酸成分的定量分析方法，該方法靈敏度高、專屬性好，在19 min 內(nèi)可對膽汁酸成分進(jìn)行分離，可用于萬氏牛黃清心丸的膽汁酸成分的測定，為其質(zhì)量評價提供參考。不同批間樣品膽汁酸成分含量存在一定的差異，?；悄懰?、甘氨膽酸、去氧膽酸、膽酸可作為產(chǎn)品質(zhì)量的差異性指標(biāo)成分監(jiān)控其質(zhì)量。