中藥治療慢性心力衰竭用藥規(guī)律及可能機制的研究

鞠春曉，李逸雯，趙俊男，翁家俊，梅俊，王碧晴，劉玥，2，徐鳳芹，3（.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 0009；2.國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學研究中心，北京 0009；3.中國中醫(yī)科學院老年醫(yī)學研究所，北京 0009）

心力衰竭（heart failure，HF）是由心臟結(jié)構(gòu)性或功能性損害引起的心室充盈或射血功能受損所導致的復雜的臨床綜合征[1]。慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是心血管疾病的終末期階段和最主要死因[2]。國內(nèi)調(diào)查[3]發(fā)現(xiàn)，在≥35歲的成年人中，加權(quán)后HF的患病率為1.3%，較2000年增加了44%?，F(xiàn)代醫(yī)學在CHF 的藥物治療方面取得了一定突破，但住院率和生存率的改善仍不理想。中醫(yī)藥在防治CHF 方面，從氣血出發(fā)，病證結(jié)合，調(diào)整陰陽，在提高心功能的同時，可改善患者的生活質(zhì)量，取得了一定的臨床療效，值得深入研究。近年來，中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院在中藥治療CHF 的臨床研究方面取得了一定的成果。心衰1號方能夠提高氣虛血瘀證CHF患者的左室射血分數(shù)[4]；益氣活血利水方能顯著延長氣虛血瘀水停證CHF患者的6 min步行距離及改善心功能[5]。本研究采用數(shù)據(jù)挖掘的方法對中藥治療CHF的用藥規(guī)律進行分析歸納，對得到的核心藥物組合進行網(wǎng)絡藥理學分析，初步探討其治療CHF 可能的作用機制，以期為今后的臨床用藥、基礎研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床數(shù)據(jù)挖掘

1.1.1病例來源 全部病例均來源于2014 年1 月至2021年6月中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院第一診斷為CHF的住院患者。

1.1.2診斷標準 心力衰竭診斷參照中華醫(yī)學會心血管病學分會制定的《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》[6]。①病史：冠心病、高血壓病、心力衰竭高危因素、使用利尿劑、端坐呼吸/夜間陣發(fā)性呼吸困難；②體格檢查：肺部啰音、雙下肢水腫、心臟雜音、頸靜脈充盈、心尖搏動側(cè)移或彌散；③心電圖：任意異常；④胸片：肺淤血、肺水腫、心臟擴大；⑤利鈉肽水平：N 末端B 型利鈉肽原（Nterminal pro-BNP，NT-proBNP）≥125 ng·L-1或B型利鈉肽（B-type natriuretic peptide，BNP）≥5 ng·L-1；⑥超聲心動圖檢查：心臟結(jié)構(gòu)和/或功能異常。

1.1.3納入標準 ①醫(yī)院信息系統(tǒng)（HIS）中第一診斷為CHF 且使用過中藥治療的住院患者；②病例治療時間為2014 年1 月至2021 年6 月；③患者的一般情況、診斷信息、醫(yī)囑記錄完整。

1.1.4排除標準 ①病例資料中包含的一般情況、診斷信息、醫(yī)囑記錄不完整者；②同時合并血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全及精神類疾病等不以CHF 為治療重點的患者；③病例資料信息不符合數(shù)據(jù)標準化要求的患者。

1.1.5數(shù)據(jù)采集與提取 由醫(yī)院信息科人員和臨床專業(yè)人員負責HIS 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)采集時重點核查患者的一般信息、診斷信息和中藥醫(yī)囑信息的完整性。由專業(yè)數(shù)據(jù)處理人員對原始數(shù)據(jù)進行清洗和整理，并將處理好的數(shù)據(jù)導入“中國中醫(yī)循證中心心血管項目組”數(shù)據(jù)平臺。利用平臺導出功能，將CHF 患者的一般信息、所有中西醫(yī)診斷及中藥處方以Excel表的形式導出備用。

1.1.6中藥名稱規(guī)范化 參照《中華人民共和國藥典》[7]統(tǒng)一處方中的中藥名稱，如醋香附統(tǒng)一為香附，蜜桑白皮統(tǒng)一為桑白皮，鹽車前子統(tǒng)一為車前子，黑順片統(tǒng)一為附子，醋五味子統(tǒng)一為五味子，醋龜甲統(tǒng)一為龜甲，生龍骨統(tǒng)一為龍骨等。

1.1.7數(shù)據(jù)錄入 根據(jù)納入和排除標準，最終納入625 例患者、787 張中藥處方。將患者的姓名、性別、西醫(yī)診斷、中醫(yī)病名及證候診斷、中藥處方等參照“ 中醫(yī)傳承計算平臺（Traditional Chinese Medicine Inheritance Computer System，TCMICS）V3.0”提供的導入數(shù)據(jù)Excel 模板進行整理匯總。將整理完畢的Excel表格直接上傳至TCMICS。

1.1.8數(shù)據(jù)分析 ①在TCMICS“統(tǒng)計分析”一欄中選擇性別、證候、四氣、五味及歸經(jīng)統(tǒng)計，將各項結(jié)果導出Excel 表格；②在“方劑分析”一欄中選擇藥物頻次統(tǒng)計，將結(jié)果導出Excel 表格；③關(guān)聯(lián)規(guī)則：在“方劑分析”一欄中選擇關(guān)聯(lián)規(guī)則，對上傳的處方進行藥物組合分析，支持度個數(shù)設置為120，置信度設置為0.75，將結(jié)果導出Excel 表格；④聚類分析：在“方劑分析”一欄中選擇聚類分析，根據(jù)錄入處方特點，將聚類個數(shù)（即k 值）設置為8，然后將核心藥物組合的結(jié)果導出Excel表格。

1.2 網(wǎng)絡藥理學研究

1.2.1數(shù)據(jù)庫及軟件 ①中藥成分和潛在靶點數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）[8]、PubChem[9]、SwissTargetPrediction[10]、Similarity Ensemble Approach（SEA）[11]； ②疾病潛在靶點數(shù)據(jù)庫：GeneCards[12]、DisGeNET[13]、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）[14]；③靶點名稱標準化數(shù)據(jù)庫：Uniprot[15]；④GO 功能注釋和KEGG 通路分析平臺及在線作圖軟件：Metascape[16]、微生信（https://www.bioinformatics.com.cn/）；⑤網(wǎng)絡構(gòu)建軟件及數(shù)據(jù)庫：Cytoscape 3.7.1[17]、STRING 11.5[18]。

1.2.2核心藥物組合活性成分及靶點的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，對核心藥物組合中包含的7味藥分別進行活性成分的初步篩選，設置篩選條件為：口服生物利用度（oral bioavailabitity，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，將結(jié)果復制到Excel表格建立活性成分數(shù)據(jù)庫。

根據(jù)初步篩選出藥物活性成分的分子名稱在PubChem 數(shù)據(jù)庫中進行檢索，將其2D 結(jié)構(gòu)文件或SMILES 編碼分別輸入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（Probability*值設置為0.7）和SEA數(shù)據(jù)庫（MaxTC值設置為0.7），物種選擇人類（homo sapiens/HUMAN），結(jié)果取兩個數(shù)據(jù)庫的并集。篩選完畢后，用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進行統(tǒng)一規(guī)范化處理，Organism設置為“Homo sapiens（Human）”，最終得到中藥活性成分的潛在靶點。

1.2.3CHF 潛在作用靶點的預測 以“Chronic heart failure”為關(guān)鍵詞，分別檢索GeneCards、DisGeNET和OMIM 數(shù)據(jù)庫。GeneCards 數(shù)據(jù)庫中的靶點按Relevance score 中位數(shù)的2 倍進行篩選。合并3 個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，刪除重復靶點，得到CHF 最終的潛在靶點。將中藥成分靶點與疾病靶點取交集，對核心藥物組合治療CHF 的潛在作用靶點進行初步預測，并將結(jié)果繪制成Venn圖。

目前，木蘭溪在建設階段，上游段以及城區(qū)部分堤段都在加快建設的速度，但是各個施工項目之間缺乏一定的溝通與交流，在建設以及管理等方面，各自管理各自的項目，缺乏統(tǒng)一協(xié)調(diào)性。木蘭溪全線總長105km，在對其進行建設管理的過程中，尚未達成一直的共識，對建設速度造成了一定的影響。

1.2.4相關(guān)網(wǎng)絡構(gòu)建 ①將“1.2.2”中的結(jié)果輸入到Cytoscape 3.7.1 軟件中，構(gòu)建核心藥物組合中各味中藥的“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖。②為明確中藥與CHF 靶點之間的相互作用關(guān)系，將二者取交集的結(jié)果輸入到STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫中并構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖。

1.2.5GO 功能注釋和KEGG 富集分析 將中藥治療CHF 的潛在靶點輸入Metascape 分析平臺，進行GO功能注釋下的生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular funtion，MF）和KEGG 通路富集分析，對靶點基因的生物學功能進行進一步的挖掘。

2 結(jié)果

2.1 臨床數(shù)據(jù)挖掘

2.1.1藥物頻次統(tǒng)計 在787 張中藥處方中，涉及到中藥326 味，總使用頻次為11 498 次，使用頻次≥50 次的有56味中藥。見表1。

表1 中藥治療慢性心力衰竭（CHF）文獻中使用頻次統(tǒng)計Table 1 Statistics of use frequency of TCM for chronic heart failure（CHF）

2.1.2藥物種類、性味及歸經(jīng)統(tǒng)計 中藥種類統(tǒng)計：共有11 類中藥，排前5 位的藥物種類分別是：補虛類、利水滲濕類、活血化瘀類、清熱類和解表類。見圖1。四氣五味統(tǒng)計：在787 張?zhí)幏街?，四氣以寒、溫、平性藥物使用較多；而五味以甘、苦、辛味藥物使用較多。見圖2-A 和圖2-B。歸經(jīng)統(tǒng)計：歸肺經(jīng)、脾經(jīng)和心經(jīng)藥物使用較多。見圖2-C。

圖1 治療慢性心力衰竭（CHF）的中藥類別統(tǒng)計Figure 1 Statistics of categories of TCM in the treatment of CHF

圖2 治療慢性心力衰竭（CHF）中藥四氣（A）、五味（B）和歸經(jīng)（C）的雷達圖（頻次/次）Figure 2 Radar chart of four-qi（A），five-flavor（B）and meridion tropism（C）of TCM for the treatment of CHF（Frequnency/time）

2.1.3關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 ①用藥模式：根據(jù)數(shù)據(jù)特點將支持度個數(shù)設置為120，置信度設置為0.75，得到用藥模式72條，包含中藥16味。見表2；②藥物關(guān)聯(lián)：將支持度個數(shù)設置為120，置信度設置為0.75，得到藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則31條。見表3。藥物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡見圖3。

圖3 治療慢性心力衰竭（CHF）的中藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡Figure 3 Association network of TCM in the treatment of CHF

表2 治療慢性心力衰竭（CHF）的中藥用藥模式Table 2 Medication mode of TCM in the treatment of CHF

表3 治療慢性心力衰竭（CHF）的中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則Table 3 Association rules of TCM in the treatment of CHF

2.1.4聚類分析 根據(jù)數(shù)據(jù)特點將k 值設置為8，對787 張?zhí)幏竭M行聚類分析，得到8 組常用處方。見表4。

表4 治療慢性心力衰竭（CHF）的常用處方Table 4 Common prescriptions of TCM in the treatment of CHF

2.2 網(wǎng)絡藥理學研究

2.2.1中藥活性成分及靶點篩選結(jié)果 共得到核心藥物組合的活性成分107個，包括槲皮素、山奈酚、苦參堿和谷甾醇等主要活性成分，去重后得到活性成分95個。將95個活性成分分別導入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫和SEA 數(shù)據(jù)庫中，初步篩選出活性成分可作用的疾病靶點579個，去除重復后得到可作用的疾病靶點170 個，并構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡。見圖4。

2.2.2核心藥物組合治療CHF 的潛在靶點 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中得到CHF 靶點13 645 個，設置Relevance score 為7.74（2 倍中位數(shù)）對靶點進行篩選，得到靶點1 706 個；在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中得到靶點223個，OMIM數(shù)據(jù)庫中得到靶點470個。將3個數(shù)據(jù)庫中篩選出的靶點進行合并、去重后，得到最終CHF靶點2 157個。

取中藥活性成分作用靶點與CHF 靶點的交集，得到治療CHF 的潛在靶點51 個。見圖5 和表5。將51個交集靶點反向映射回活性成分和7味中藥中，發(fā)現(xiàn)核心藥物組合中主要為槲皮素、山奈酚、異鼠李素等28個活性成分作用于51個CHF潛在靶點，利用Cytoscape 軟件建立中藥-活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡。見圖6。

圖5 治療慢性心力衰竭（CHF）的中藥-疾病交集靶點韋恩（Venn）圖Figure 5 Venn diagram of TCM-disease intersection targets for the treatment of CHF

圖6 治療慢性心力衰竭（CHF）的“中藥-活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡圖Figure 6 “herbs-active components-disease targets” network diagram for the treatment of CHF

表5 中藥治療慢性心力衰竭（CHF）的潛在靶點Table 5 Potential targets of TCM in the treatment of CHF

核心藥物組合治療CHF的潛在活性成分有28個，將關(guān)鍵網(wǎng)絡拓撲參數(shù)連接度（Degree，該值越大，說明此節(jié)點在網(wǎng)絡中越重要）設置為≥5，篩選出核心藥物組合治療CHF的核心成分10個。見表6。

表6 中藥治療慢性心力衰竭（CHF）的核心成分Table 6 Core components of TCM in the treatment of CHF

2.2.3PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建 將核心藥物組合治療CHF 的51 個靶點輸入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫，按照中等置信度（medium confidence）對靶點蛋白間的相互作用進行分析。共得到51個節(jié)點，249條邊。然后將導出的TSV文件導入到Cytoscape 3.7.1 軟件中，繪制PPI 網(wǎng)絡圖（見圖7）。并將Degree值設置為≥10，篩選出20個核心靶點，其前10 位分別是AKT1、EGFR、MMP9、MMP2、PPARG、ERBB2、CCND1、ESR1、IL2 和SMAD3。見表7。

圖7 中藥治療慢性心力衰竭（CHF）的靶點PPI 網(wǎng)絡Figure 7 PPI network of targets of TCM in the treatment of CHF

2.2.4GO 功能注釋和KEGG 富集分析 ①GO 功能注釋：核心藥物組合活性成分作用的潛在基因靶點主要富集在60 個細胞組成（cellular component，CC）、89種分子功能（molecular function，MF）和402個生物過程（biological process，BP）。Metascape 分析平臺最終得到顯著性較高的11 個CC、17 種MF 及20 個BP，細胞組成主要涉及細胞的受體復合物、細胞前沿等；分子功能主要為脂結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚體活性和激酶結(jié)合等；生物過程主要包括激酶活性的正調(diào)控、酶聯(lián)受體蛋白信號通路和對激素的反應等。見圖8。②KEGG 富集分析共得到113 條通路，查閱文獻后排除與心衰無關(guān)的通路，最終得到27 條信號通路，如MAPK、PI3K-Akt、HIF-1等信號通路。見圖9。

圖8 治療慢性心力衰竭（CHF）的中藥活性成分潛在基因靶點的GO 功能富集分析Figure 8 GO functional enrichment analysis of potential gene targets of active components in TCM for the treatment of CHF

圖9 治療慢性心力衰竭（CHF）的中藥活性成分潛在基因靶點的KGEE 通路富集分析Figure 9 KGEE pathway enrichment analysis of potential gene targets of active components in TCM for the treatment of CHF

3 討論

慢性心力衰竭（CHF）的發(fā)生發(fā)展過程復雜，目前尚未完全闡明其機制。其發(fā)病與交感神經(jīng)興奮性增強、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosterone system，RAAS）激活、心肌肥厚及體液因子改變等因素有關(guān)[2]。古代中醫(yī)典籍中沒有專門關(guān)于心衰病的記載，其相關(guān)內(nèi)容可歸屬為喘證、心悸、肺脹等。陳可冀院士認為，HF 的本質(zhì)病機是內(nèi)虛，虛、瘀、水總領(lǐng)病機[19]。早期為心氣、心陽虛損，或肺氣虧虛，導致運血無力，瘀血阻滯；中期脾陽受到損傷，肺水道失調(diào)，水濕內(nèi)停；后期腎陽虧虛，膀胱氣化不利，水濕泛濫。因此，中藥治療HF 常以補益心脾，活血化瘀及利水消腫為法。

本研究采用數(shù)據(jù)挖掘方法得到中藥治療CHF 的核心藥物組合（黃芪、黨參、茯苓、桂枝、益母草、川芎和赤芍）。其中黃芪為使用頻率最高的中藥，歸脾肺兩經(jīng)，為補益脾肺氣之良藥，同時能夠利水消腫；黨參味甘性平，歸脾肺兩經(jīng)，補而不燥，補益脾肺之氣；茯苓甘補淡滲，為利水消腫之要藥，《本草經(jīng)解》[20]記載其可“利小便”。益母草苦、辛，微寒，既能利水消腫，又能活血化瘀；桂枝辛、甘，溫，歸心、肺、膀胱經(jīng)，用以溫補心陽，與茯苓同用又可利水消腫；川芎味辛性溫，活血行氣，為“血中氣藥”；《滇南本草》[21]記載赤芍可“降氣行血，破淤血，散血塊”，川芎與赤芍配伍，可行氣活血祛瘀。全方共奏益氣活血利水之功，正切CHF 虛、瘀、水的核心病機，可為臨床用藥提供一定的參考。

基于網(wǎng)絡藥理學的研究方法，對核心藥物組合的活性成分進行了篩選，對應CHF 基因靶點較多的成分有槲皮素、山奈酚、異鼠李素、鞣花酸、木犀草素等。動物實驗[22]表明，槲皮素可以降低小鼠心臟Ⅰ型和Ⅲ型膠原的mRNA 水平，并且在體外可以抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達，從而預防血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導的心臟舒張期功能障礙、纖維化、炎癥和氧化應激反應，抑制成纖維細胞的增殖和遷移，提示槲皮素可能是一種治療心肌纖維化和心功能障礙的有效藥物。有報道[23]暴露于AngⅡ的心臟成纖維細胞有利于膠原的生物合成，同時伴隨著炎癥和氧化應激水平的增加；心臟重塑小鼠的心臟組織病理學改變明顯，并伴有間質(zhì)纖維化和心功能不全。山奈酚可以通過抑制炎癥和氧化應激來緩解Ang Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞中膠原的積累，進而預防AngⅡ誘導的小鼠心臟纖維化和功能障礙[23]。異鼠李素可通過阻斷磷脂酰肌醇3-激酶-AKT 信號通路（PI3KAKT signaling pathway）的激活來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）通路以抑制AngⅡ誘導的大鼠心肌肥厚和纖維化[24-25]。上述研究提示，核心藥物組合可能通過多種中藥活性成分的協(xié)同作用，發(fā)揮抗炎、抗氧化應激、抑制心肌纖維化和心肌肥厚等作用，達到治療CHF的目的。

PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建結(jié)果顯示，核心藥物組合作用于CHF 的潛在核心靶點為AKT1、EGFR、MMP9、MMP2 和PPARG 等。動物實驗[26]表明，小鼠心臟中AKT1 短期激活（2 周）可導致完全可逆的肥厚并保持收縮能力；而AKT1 持續(xù)激活（6 周）會導致廣泛的心肌肥大、間質(zhì)纖維化和收縮功能障礙。大腦心血管調(diào)節(jié)區(qū)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1 和2（ERK1/2）可增加RAAS活性、神經(jīng)炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，參與心肌梗死所致HF的交感興奮[27]。表皮生長因子受體（EGFR）可能參與了ERK1/2信號的增加及其下游效應，以增強HF 的交感興奮。在這種情況下，RAAS 活性、炎癥和氧化應激都在大腦的心血管調(diào)節(jié)區(qū)域增加，提示EGFR 具有心肌肥厚的正向調(diào)節(jié)作用[27-28]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）是一種Zn2+依賴性內(nèi)肽酶，具有降解彈性蛋白和膠原蛋白的能力。有研究[29]顯示，CHF大鼠心臟MMP9水平和活性增加，體內(nèi)MMP9抑制藥物丹酚酸具有心臟保護作用，其機制可能是通過抑制NF-κB途徑減輕AngⅡ誘導的心臟成纖維細胞的纖維化反應。

KEGG 富集通路分析得到核心藥物組合作用于CHF的通路可能為MAPK、PI3K-Akt、HIF-1、Ra和cAMP等信號通路。AngⅡ引起的心肌重構(gòu)在HF的病理發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，神經(jīng)導向因子1（Netrin-1）是一種軸突引導信號。有研究[30]表明，抑制Netrin-1 的特異性siRNA，AngⅡ誘導的心肌重塑、纖維化和細胞凋亡的程度可以顯著減輕；抑制Netrin-1可顯著減弱蛋白激酶Cα、JNK和P38的磷酸化，從而抑制PKCα/MAPK（JNK 和P38）信號通路減輕AngⅡ誘導的心肌重構(gòu)。PI3K/Akt信號通路通過調(diào)節(jié)細胞存活、細胞凋亡或生長、心肌收縮，以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄等一系列分子參與調(diào)控心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展和病理形成[31]。動物實驗[32]顯示，心肌收縮能力調(diào)節(jié)可預防HF時的心肌纖維化，其機制可能與PI3K/Akt 信號通路的改變有關(guān)。生脈注射液通過激活AMPK信號通路減輕AngⅡ誘導的心肌細胞肥大和細胞凋亡，而且對肥大心肌細胞的線粒體功能有保護作用[33]。上述研究表明，核心藥物組合可能通過多條信號通路抑制心肌纖維化、減輕心肌重構(gòu)以治療CHF。

綜上所述，本研究采用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡藥理學的方法，系統(tǒng)梳理了中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院中藥治療CHF 的用藥規(guī)律，并對核心藥物組合可能的作用靶點和通路進行了初步預測，為臨床中的遣方用藥和今后的基礎研究提供了一定的依據(jù)和參考。