圣草酚通過(guò)miR-128-3p/MAPK 軸對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

高建朝，張志生，張京力，李曉霞，馬科，馮志林，周海豐，王展海（.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科，河北 張家口 075000；.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 張家口 075000）

癌癥是21 世紀(jì)人類的主要死因，也是提高人類預(yù)期壽命的主要障礙[1]?；熓寝D(zhuǎn)移癌的有效治療方法之一。然而，不加區(qū)別地殺死正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的化療藥物的嚴(yán)重副作用以及癌細(xì)胞逃避凋亡的能力仍然是成功化療的重大障礙[2]。例如，長(zhǎng)春瑞濱、紫杉醇和蒽環(huán)類藥物被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌（Breast cancer，BC）多藥耐藥性有關(guān)[3-4]。因此，揭示其抗癌機(jī)制，篩選新的化療藥物以規(guī)避耐藥性，有可能改善化療效果。

圣草酚是一種天然類黃酮化合物，普遍存在于水果、蔬菜和多種藥用植物中[5]。據(jù)報(bào)道[6-7]，圣草酚具有抗癌活性，在許多類型癌癥（如膠質(zhì)瘤、肺癌）中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期停滯和增殖抑制。除了抗癌活性外，圣草酚還可抑制Akt/NF-κB通路并減少氧化應(yīng)激，抑制促炎因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的釋放[8]。然而，不精確的作用機(jī)制和未知的直接靶點(diǎn)極大地阻礙了其在癌癥治療中的臨床應(yīng)用。

以往研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）在不同腫瘤的發(fā)生過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)各種信號(hào)通路參與癌癥發(fā)生、發(fā)展的不同過(guò)程。已有研究[9]證實(shí)，miR-128-3p 在人乳腺癌患者中低表達(dá)，它的高表達(dá)預(yù)示著人乳腺癌預(yù)后較好。另外，據(jù)報(bào)道[11]，激活MAPK通路可在體內(nèi)和體外促進(jìn)人乳腺癌的生長(zhǎng)。因此，miR-128-3p 和MAPK 通路可能是人乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

基于此，假設(shè)圣草酚可以通過(guò)調(diào)控miR-128-3p/MAPK 軸在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 細(xì)胞中發(fā)揮抗癌功效。為了證實(shí)此假設(shè)，本研究擬通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估圣草酚對(duì)人乳腺癌的影響，并闡述miR-128-3p/MAPK軸在此過(guò)程中可能發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動(dòng)物MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞（批號(hào)：CE10222）、FR2 人乳腺上皮細(xì)胞（批號(hào)：CE21257），購(gòu)自北京CRISPRBIO 公司。25 只SPF 級(jí)雌性BALB/c裸鼠，3～4周齡，體質(zhì)量12～16 g，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021- 0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44002100016450。飼養(yǎng)在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院特定的無(wú)病原體實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2019-004，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：IACUC-101087，符合3R原則。

1.2 藥物及主要試劑圣草酚（HPLC≥95.0%，批號(hào)：94258），購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；紫杉醇（99.96%，批號(hào)：HY-B0015）、MAPK 通路抑制劑（SB203580，SB，批號(hào)：HY-10256），購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress 公司；Annexin V FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A211-01），購(gòu)自南京Vazyme 公司；線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：CA1310），購(gòu)自北京Solarbio 公司；RNA 提取試劑盒（DP420），購(gòu)自北京TIANGEN 公司； All- in- One First- Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR（批號(hào)：abx098023），購(gòu)自英國(guó)Abbexa公司；qPCR SYBR?Green Master Mix（批號(hào)：1120ES），購(gòu)自上海Yeasen 公司；高效組織/細(xì)胞RIPA裂解液（批號(hào)：AR0010），購(gòu)自上海Acmec公司；一抗p-p38 MAPK（批號(hào)：4511T）、p38 MAPK（批號(hào)：8690T）、p-HSP27（批號(hào)：9709T）、HSP27（批號(hào)：95357S）和GAPDH（批號(hào)：5174T），均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1089）、DAPI 染色液（C1005），購(gòu)自上海Beyotime 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基（批號(hào)：R8758）、胎牛血清（批號(hào)：SV30160.03）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號(hào)：SV30010），均購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；MTT 溶液（5 mg·mL-1），批號(hào)：RC87133，購(gòu)自上海AMEKO公司；miR-128-3p抑制物（anti miR-128-3p）與其陰性對(duì)照（anti miR-NC）、引物，均由廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 儀器HeracellTM150i CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific 公司；SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī)，美國(guó)Molecular Devices 公司；DMi8 倒置熒光顯微鏡，德國(guó)徠卡公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；伯樂(lè)CFX96 熒光PCR 儀、ChemiDoc化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞和FR2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，并保持在含有5%CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中。

1.4.2抗增殖實(shí)驗(yàn) MTT用于確定圣草酚對(duì)人MCF-7細(xì)胞和人乳腺上皮細(xì)胞FR2 的抗增殖活性。將細(xì)胞以3×103個(gè)·mL-1的密度種植在96 孔板中，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基并添加不同濃度的圣草酚（0～200 μmol·L-1）[7]。48 h后，加入20 μL MTT溶液孵育4 h。之后去除培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO，在490 nm處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度，以與對(duì)照組吸光度的比值作為細(xì)胞活力（%）。

1.4.3細(xì)胞分組 將MCF-7 細(xì)胞分為以下5 組：對(duì)照組、圣草酚組、圣草酚+anti miR-NC 組、圣草酚+anti miR-128-3p 組和圣草酚+anti miR-128-3p+SB（SB203580）組。對(duì)照組細(xì)胞不做處理；圣草酚組細(xì)胞使用50 μmol·L-1圣草酚處理；圣草酚+anti miRNC 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti miR-NC 后使用50 μmol·L-1圣草酚處理；圣草酚+anti miR-128-3p 組細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti miR-128-3p 后使用50 μmol·L-1圣草酚處理；圣草酚+anti miR-128-3p+SB組細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti miR-128-3p后使用50 μmol·L-1圣草酚和0.5 μmol·L-1SB203580[12]處理。所有細(xì)胞均培養(yǎng)48 h，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑方法轉(zhuǎn)染。參照“1.4.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞增殖活力。

1.4.4集落形成分析 MCF-7 細(xì)胞接種在6 孔板中（500 個(gè)/孔）。讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)12 h 后，按照“1.4.3”項(xiàng)下分組處理細(xì)胞，每3 d 換1 次培養(yǎng)基。12 d 后，去除培養(yǎng)基，使用PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min。洗去多余的結(jié)晶紫，干燥后觀察集落。用ImageJ 軟件分析超過(guò)50 個(gè)細(xì)胞的集落。

1.4.5細(xì)胞凋亡分析 MCF-7細(xì)胞接種在6孔板中（2×105個(gè)/孔），按照“1.4.3”項(xiàng)下分組進(jìn)行處理，48 h后收集細(xì)胞，PBS 洗滌后并懸浮在100 μL 1×結(jié)合緩沖液中，然后加入5 μL Annexin V FITC和5 μL PI黑暗培養(yǎng)10 min。最后加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.4.6MMP檢測(cè) 將MCF-7細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，并按照“1.4.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞48 h，隨后按照MMP 檢測(cè)試劑盒方法添加適量的JC-10染色緩沖液懸浮后，使用流式細(xì)胞儀立即分析樣品。

1.4.7RT-qPCR 反應(yīng) 各組MCF-7 細(xì)胞的總RNA 根據(jù)RNA 提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)獲取，并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后根據(jù)使用說(shuō)明進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。將miR-128-3p基因表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化為U6的表達(dá)。本研究中使用的引物序列如下：miR-128-3p：5'-GGTC ACAGTGAACCGGTC-3'（正向）、5'-GTGCAGGGTCC GAGGT-3'（反向）；U6：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'（正向）、5'-AACGCTTACGAATTTGCGT-3'（反向）。

1.4.8Western Blot 分析 在含有1 mmol·L-1蛋白酶抑制劑和1 mmol·L-1磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液中裂解以上各組處理的細(xì)胞。通過(guò)12% SDS-PAGE 分離等量的蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，與一抗（pp38 MAPK、p38 MAPK、p-HSP27、HSP27和GAPDH）在4 ℃過(guò)夜。隨后，與二抗室溫孵育2 h。最后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)顯示蛋白質(zhì)條帶，蛋白表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的表達(dá)。

1.4.9裸鼠異種移植實(shí)驗(yàn) MCF-7 細(xì)胞（5×106個(gè)）注射到裸鼠皮下建立異種移植模型。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)到約60 mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分組（每組5只）：對(duì)照組、紫杉醇組及圣草酚組（50、100、200 mg·kg-1），分別腹腔注射生理鹽水或10 mg·kg-1紫杉醇[3]或50、100、200 mg·kg-1圣草酚[6]，每天1次。持續(xù)21 d后，所有裸鼠用1%戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）麻醉，頸椎脫臼法安樂(lè)死處死。切除腫瘤，稱質(zhì)量，并按照以下公式計(jì)算體積：腫瘤體積=（長(zhǎng)度×寬度2）·2-1。將腫瘤組織固定在10%多聚甲醛并包埋在石蠟中用于進(jìn)一步分析。

1.4.10TUNEL 檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將組織切片脫蠟、水化，并用20 μg·mL-1蛋白酶K 溶液滲透20 min。用PBS 洗滌后將組織切片與TUNEL 反應(yīng)混合物在黑暗中孵育1 h。細(xì)胞核使用DAPI染色。使用PBS洗滌后，將組織切片用抗褪色封固劑封固，并使用顯微鏡拍攝圖片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法符合正態(tài)分布且方差齊的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式呈現(xiàn)，Student’st檢驗(yàn)或單因素方差分析和Turkey 事后檢驗(yàn)用于組間差異比較。以GraphPad Prism 6.0版軟件（GraphPad，San Diego，CA，USA）進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 圣草酚對(duì)MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞的抗癌活性見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，當(dāng)圣草酚濃度超過(guò)12.5或25 μmol·L-1時(shí)，MCF-7 或FR2 細(xì)胞的活力隨著圣草酚濃度的增高而逐漸降低，表現(xiàn)出濃度依賴性（P＜0.05）。圣草酚對(duì)人MCF-7 細(xì)胞的IC50約為50 μmol·L-1，而對(duì)非癌性FR2細(xì)胞的IC50約為96 μmol·L-1。

圖1 圣草酚對(duì)人MCF-7 細(xì)胞和非癌性FR2 細(xì)胞活力的影響（±s，n=3）Figure 1 Effect of eriodictyol on the viability of human MCF-7 cells and non-cancerous FR2 cells（±s，n=3）

2.2 圣草酚通過(guò)miR-128-3p/MAPK 軸對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡以及MMP 的影響見(jiàn)圖2、表1。與對(duì)照組比較，圣草酚組MCF-7 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量以及MMP均下調(diào)，凋亡率增高（P＜0.05）；與圣草酚+anti miR-NC 組比較，圣草酚+anti miR-128-3p組MCF-7細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量以及MMP均上調(diào)，凋亡率降低（P＜0.05）；與圣草酚+anti miR-128-3p 組比較，圣草酚+anti miR-128-3p+SB 組MCF-7 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量以及MMP 均下調(diào)，凋亡率增高（P＜0.05）；而圣草酚+anti miR-NC 組與圣草酚組MCF-7 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量、凋亡率以及MMP的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組MCF-7 細(xì)胞增殖、凋亡及MMP 分析（±s，n=3）Table 1 Analysis of proliferation，apoptosis and MMP of MCF-7 cells in each group（±s，n=3）

表1 各組MCF-7 細(xì)胞增殖、凋亡及MMP 分析（±s，n=3）Table 1 Analysis of proliferation，apoptosis and MMP of MCF-7 cells in each group（±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與圣草酚+anti miR-NC組比較，#P＜0.05；與圣草酚+anti miR-128-3p組比較，&P＜0.05

MMP/%100.00±0.00 37.39±3.21*41.27±4.15 79.15±7.04#57.32±4.63&組別對(duì)照組圣草酚組圣草酚+anti miR-NC組圣草酚+anti miR-128-3p組圣草酚+anti miR-128-3p+SB組細(xì)胞活力/%100.00±0.00 48.78±3.85*52.24±4.09 81.15±6.81#66.54±4.73&集落形成數(shù)量/個(gè)150.29±16.18 42.69±5.82*45.62±6.74 94.55±8.69#69.27±7.15&細(xì)胞凋亡率/%8.69±0.87 47.38±5.07*43.89±3.48 15.27±1.64#28.45±2.09&

圖2 各組MCF-7 細(xì)胞集落形成能力和凋亡率情況Figure 2 The number of colony formation ability and the apoptosis rate of MCF-7 cells in each group

2.3 圣草酚對(duì)miR-128-3p/MAPK 軸的影響見(jiàn)圖3、表2。與對(duì)照組比較，圣草酚組MCF-7細(xì)胞中miR-128-3p 基因水平增高，細(xì)胞中p-p38 MAPK 和p-HSP27 蛋白水平均降低（P＜0.05）；與圣草酚+anti miR-NC 組比較，圣草酚+anti miR-128-3p 組MCF-7細(xì)胞中miR-128-3p 基因水平降低，細(xì)胞中p-p38 MAPK 和p-HSP27 蛋白水平均增高（P＜0.05）；與圣草酚+anti miR-128-3p 組比較，圣草酚+anti miR-128-3p+SB組MCF-7細(xì)胞中p-p38 MAPK和p-HSP27蛋白水平均降低（P＜0.05）；而圣草酚+anti miR-NC組與圣草酚組MCF-7 細(xì)胞中miR-128-3p 基因水平、p-p38 MAPK和p-HSP27蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組MCF-7細(xì)胞中p38 MAPK和HSP27水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組MCF-7 細(xì)胞中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-HSP27 和HSP27 的蛋白水平（±s，n=3）Table 2 Protein levels of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-HSP27 and HSP27 of MCF-7 cells of each group（±s，n=3）

表2 各組MCF-7 細(xì)胞中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-HSP27 和HSP27 的蛋白水平（±s，n=3）Table 2 Protein levels of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-HSP27 and HSP27 of MCF-7 cells of each group（±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與圣草酚+anti miR-NC組比較，#P＜0.05；與圣草酚+anti miR-128-3p組比較，&P＜0.05

HSP27 0.85±0.08 0.77±0.05 0.74±0.04 0.88±0.07 0.72±0.08組別對(duì)照組圣草酚組圣草酚+anti miR-NC組圣草酚+anti miR-128-3p組圣草酚+anti miR-128-3p+SB組miR-128-3p 1.02±0.03 2.38±0.19*2.21±0.17 1.69±0.11#1.81±0.15 p-p38 MAPK 0.87±0.07 0.25±0.03*0.27±0.04 0.68±0.06#0.45±0.04&p38 MAPK 0.95±0.08 0.87±0.09 0.85±0.10 0.91±0.07 0.88±0.06 p-HSP27 0.79±0.06 0.16±0.02*0.18±0.03 0.61±0.05#0.37±0.04&

圖3 Western Blot 法分析各組p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-HSP27 和HSP27 的蛋白水平Figure 3 Western Blot analysis of the protein levels of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-HSP27 and HSP27

2.4 圣草酚抑制異種移植裸鼠模型中人乳腺癌生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為驗(yàn)證圣草酚體內(nèi)抗癌活性，使用MCF-7 細(xì)胞和裸鼠建立異種移植裸鼠模型，結(jié)果見(jiàn)圖4 和表3。與對(duì)照組比，圣草酚組裸鼠腫瘤體積和質(zhì)量明顯降低，TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞率增高，且呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）；但圣草酚對(duì)腫瘤組織生長(zhǎng)的抑制作用和TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞的促進(jìn)作用明顯小于紫杉醇組，即使在高劑量下也是如此（P＜0.05）。圣草酚組和紫杉醇組與對(duì)照組裸鼠質(zhì)量變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 圣草酚對(duì)異種移植裸鼠模型中腫瘤組織生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Table 3 Effects of eriodictyol on tumor tissue growth and cell apoptosis in xenograft mouse model（±s，n=3）

表3 圣草酚對(duì)異種移植裸鼠模型中腫瘤組織生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=3）Table 3 Effects of eriodictyol on tumor tissue growth and cell apoptosis in xenograft mouse model（±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與圣草酚（200 mg·kg-1）組比較，#P＜0.05

TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/%18.59±2.15 29.37±3.04*31.28±4.23*45.18±4.54*62.24±5.18#組別對(duì)照組圣草酚（50 mg·kg-1）組圣草酚（100 mg·kg-1）組圣草酚（200 mg·kg-1）組紫杉醇組腫瘤質(zhì)量/mg 17.28±1.87 13.25±1.25*12.04±1.07*10.89±0.96*7.54±0.72#腫瘤體積/mm3 287.59±22.34 224.27±19.65*191.32±16.24*161.79±14.95*110.85±10.59#體質(zhì)量/g 21.25±3.34 18.45±1.69 17.93±2.02 19.36±2.84 14.98±3.12

3 討論

在全球范圍內(nèi)，預(yù)計(jì)2023 年新增的女性乳腺癌病例約為30 萬(wàn)，占女性癌癥病例的31%。盡管自1989 年以來(lái)女性乳腺癌死亡率降低了43%，但仍有數(shù)萬(wàn)癌癥相關(guān)的死亡歸因于人乳腺癌[13]。此外，現(xiàn)有的治療方案具有嚴(yán)重的副作用，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且耐藥性的發(fā)展使癌癥非常難以治療[3-4]。已知天然產(chǎn)物具有多個(gè)靶標(biāo)，并且能夠抑制或激活復(fù)雜的信號(hào)通路以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[6-8]。本研究中，圣草酚顯示出對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 潛在的生長(zhǎng)抑制活性。從抗增殖實(shí)驗(yàn)中可以看出，圣草酚對(duì)人類非癌性FR2 細(xì)胞的IC50約為96 μmol·L-1，遠(yuǎn)低于其對(duì)MCF-7的IC50，這清楚地表明圣草酚對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。研究報(bào)告[14]表明，類黃酮對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒性，因此可能被證明是潛在的抗癌劑。圣草酚等黃酮類化合物經(jīng)常在人類的飲食中食用，并且在水果、蔬菜和其他植物衍生食品（如茶和其他飲料）均有存在，因此被認(rèn)為是無(wú)毒的[15]。

如前所述，許多藥物通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出抗增殖作用。據(jù)報(bào)道[16]，現(xiàn)有的幾種抗癌藥物均可以調(diào)控凋亡信號(hào)通路。此外，耐藥性部分也可以通過(guò)癌細(xì)胞逃逸細(xì)胞凋亡的潛力來(lái)揭示[17]。本研究觀察到圣草酚可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，線粒體外膜通透性是參與細(xì)胞凋亡途徑的重要過(guò)程。本研究中，觀察到圣草酚可顯著降低MMP，研究結(jié)果與之前的研究[18]一致。因此，本研究結(jié)果表明圣草酚可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)MMP 的累積減少來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而表現(xiàn)出抗增殖作用。另外，據(jù)以往研究[9-10]報(bào)道，miRNA在癌細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些功能和機(jī)制使miRNA 成為包括乳腺癌在內(nèi)的癌癥的治療靶點(diǎn)。已有多項(xiàng)研究[19]證明，miR-128-3p 在乳腺癌中發(fā)揮重要作用，如Lnc RNA PVT1 可通過(guò)海綿吸附miR-128-3p 進(jìn)而影響其靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，圣草酚可有效上調(diào)miR-128-3p 表達(dá)，暗示miR-128-3p 可能參與圣草酚的干預(yù)過(guò)程。進(jìn)一步的研究顯示，抑制miR-128-3p 可在一定程度上逆轉(zhuǎn)圣草酚的抗癌功效，表明圣草酚可能通過(guò)調(diào)控miR-128-3p 表達(dá)在MCF-7中發(fā)揮抗增殖作用。除此以外，MAPK信號(hào)通路已被多項(xiàng)研究證實(shí)，其可廣泛參與包括乳腺癌在內(nèi)的細(xì)胞凋亡、增殖和分化等過(guò)程[11]。其中p38 MAPK 是MAPK 重要的亞通路之一，p38 MAPK 在維持不同組織以及癌癥的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，即p38 MAPK 信號(hào)可以保護(hù)細(xì)胞免受有害物質(zhì)的侵害，但當(dāng)損傷持續(xù)時(shí)會(huì)促進(jìn)它們的死亡，這種兩面的角色在癌癥中尤其明顯[20]。因此，p38 MAPK 的定向腫瘤治療可能是一把雙刃劍，有必要對(duì)其在圣草酚治療過(guò)程中的機(jī)制進(jìn)行探討。另外，HSP27是p38 MAPK的下游靶點(diǎn)之一，高水平的HSP27會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性行為，包括過(guò)度增殖、轉(zhuǎn)移和較少的細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，圣草酚干預(yù)后，p38 MAPK和HSP27的磷酸化水平均降低，暗示圣草酚可能對(duì)MAPK 通路具有抑制作用。此外，miR-128-3p逆轉(zhuǎn)圣草酚抗癌作用的同時(shí)，可明顯上調(diào)p38 MAPK和HSP27 的磷酸化水平，推測(cè)圣草酚可能通過(guò)上調(diào)miR-128-3p 的表達(dá)抑制MAPK 通路。而進(jìn)一步添加MAPK 通路抑制劑SB 進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，SB 可明顯減弱抑制miR-128-3p 的表達(dá)對(duì)圣草酚干預(yù)后的MCF-7 細(xì)胞的作用。以上說(shuō)明，圣草酚在乳腺癌中通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出抗增殖作用可能是通過(guò)miR-128-3p/MAPK軸實(shí)現(xiàn)的。

另外，為驗(yàn)證圣草酚體內(nèi)抗癌活性，使用MCF-7細(xì)胞和裸鼠建立異種移植裸鼠模型，結(jié)果顯示，圣草酚可呈劑量依賴性地誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，圣草酚組裸鼠體質(zhì)量減輕略小于紫杉醇組，暗示圣草酚的毒性可能低于紫杉醇。另外圣草酚在體內(nèi)的抗癌作用也明顯弱于紫杉醇，即使在高劑量下也是如此。這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)修改圣草酚的結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)其抗癌活性來(lái)解決。本研究是對(duì)圣草酚抗癌作用的初步研究，接下來(lái)將進(jìn)一步探討本研究提出的圣草酚抗乳腺癌的作用機(jī)制，未來(lái)將嘗試修改圣草酚的結(jié)構(gòu)以提高其抗乳腺癌活性。本研究表明，天然黃酮圣草酚可以有效抑制乳腺癌的生長(zhǎng)，可能是通過(guò)調(diào)控miR-128-3p/MAPK 軸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)表明，圣草酚可能是未來(lái)治療乳腺癌的潛在藥物。