數(shù)字PCR技術(shù)及其在臨床檢驗(yàn)中的研究進(jìn)展*

周小勻,周 琰 綜述,郭 瑋 審校

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200032

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種用于體外擴(kuò)增和檢測(cè)低濃度核酸的技術(shù),它可以從少量的起始材料中產(chǎn)生幾百萬份特定的DNA片段的拷貝,目前在分子生物學(xué)領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的終點(diǎn)PCR只能提供相對(duì)和定性結(jié)果,后續(xù)的第二代PCR——實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)通過熒光探針或染料進(jìn)行靶向擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè),但由于熒光基線估計(jì)誤差和qPCR擴(kuò)增效率導(dǎo)致的擴(kuò)增偏差問題,仍然無法提供準(zhǔn)確的絕對(duì)結(jié)果。

1992年SYKES等建立了數(shù)字PCR(dPCR)的基本實(shí)驗(yàn)流程之后,“第三代PCR”——dPCR技術(shù)迅速發(fā)展起來并日趨成熟。2003年,DRESSMAN等結(jié)合dPCR技術(shù)和流式技術(shù),應(yīng)用乳狀液在單個(gè)試管中實(shí)現(xiàn)了PCR反應(yīng)體系的分隔。在商業(yè)化方面,2006年,Fluidigm公司最先推出了基于芯片的dPCR平臺(tái),Quantalife公司研制了最早的微滴式dPCR系統(tǒng)。如今,dPCR技術(shù)因其在分子檢測(cè)方面的高靈敏度和高準(zhǔn)確性,已在微量DNA檢測(cè)、罕見突變檢測(cè)和拷貝數(shù)變異等方面得到了廣泛應(yīng)用。

1 dPCR的原理、分類

1.1dPCR的原理 dPCR核酸分子定量方法的原理是基于熒光PCR 擴(kuò)增與計(jì)數(shù),但無須Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)定量。在dPCR中,擴(kuò)增反應(yīng)被分成數(shù)千個(gè)獨(dú)立的部分,分區(qū)可以通過微孔板、毛細(xì)管、油乳液或陣列來實(shí)現(xiàn)。理想情況下,每個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)混合物含有一個(gè)或沒有目標(biāo)分子,待分割后的反應(yīng)擴(kuò)增至終點(diǎn),計(jì)數(shù)陽性(熒光)和陰性分區(qū)的數(shù)量,即可通過泊松定律精確計(jì)算每個(gè)分區(qū)的DNA目標(biāo)數(shù)和原始標(biāo)本中的拷貝數(shù)[1]。使用dPCR準(zhǔn)確定量DNA須滿足以下兩個(gè)條件:第一,DNA目標(biāo)必須隨機(jī)分布于分區(qū)中,理想情況下每個(gè)分區(qū)不應(yīng)該包含一個(gè)以上的目標(biāo)分子,但這一稀釋需要大量的分割(104～105)才能達(dá)到泊松定律的要求。分區(qū)的大小也應(yīng)該一致以使每個(gè)分區(qū)包含相同數(shù)量的目標(biāo)分子。第二,擴(kuò)增須有足夠效率,讓所有包含目標(biāo)分子的分區(qū)都被擴(kuò)增,且正負(fù)分區(qū)間須有明確區(qū)分。

1.2dPCR的分類 目前主流的dPCR技術(shù)可分為液滴式dPCR(ddPCR)和芯片式dPCR(cdPCR)。

ddPCR使用兩種互不相溶的液體,通過兩者表面張力和剪切力的共同作用來形成微小的液滴。在ddPCR中,微滴發(fā)生器每次可以生成數(shù)百萬個(gè)納升級(jí)別的油包水微滴作為樣品分散載體,這些液滴將包裹著單拷貝的DNA模板和反應(yīng)液進(jìn)入反應(yīng)管擴(kuò)增,最后通過檢測(cè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行定量。該方法的優(yōu)勢(shì)在于靈活的通量及可擴(kuò)展性,但其生成液滴的穩(wěn)定性及可控性較差。相應(yīng)的商品化儀器平臺(tái)包括 Bio-Rad-Qx 200、RainDrop、Naica Crystal、新羿 TD-1 數(shù)字 PCR 儀和達(dá)微生物 OsciDrop?等。

cdPCR技術(shù)先在芯片上物理加工大量的腔室陣列作為微反應(yīng)腔室,再將納升級(jí)液體封閉在微孔中進(jìn)行擴(kuò)增,最后使用熒光顯微鏡判讀結(jié)果。近年來芯片產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步大大推動(dòng)了cdPCR的發(fā)展: Ismagilov研究組開發(fā)了滑動(dòng)式dPCR芯片[2];浙江大學(xué)研究組開發(fā)了具有分支結(jié)構(gòu)的無廢液式芯片和一體式dPCR芯片[3]。cdPCR獨(dú)立性高、反應(yīng)均一性好,為實(shí)時(shí)dPCR提供了可能性;但其芯片加工制作工藝要求高,技術(shù)操作復(fù)雜且實(shí)驗(yàn)成本較高。商品化儀器有Thermofisher QuantStudioTM3D、Clarity、QIAGEN QIAcuity等。

1.3dPCR商業(yè)化平臺(tái) 目前dPCR市場(chǎng)中的主要商業(yè)品牌有QX系列(Bio-Rad公司,美國(guó)),RainDrop系列(Bio-Rad公司,美國(guó)),BioMark 系列(Fluidigm Corporation公司,美國(guó))和 QuantStudio 系列(Thermo Fisher公司,美國(guó))。前兩者屬于ddPCR技術(shù),后兩者屬于cdPCR技術(shù)。其他品牌有Clarity(JN MedSys公司,新加坡)、Naica(Stilla Technologies公司,法國(guó))等。

1.3.1BioMark系列 Fluidigm Corporation早在2006年就開始著力于將dPCR技術(shù)商業(yè)化。其推出的BioMark HD平臺(tái),使用數(shù)字陣列集成流體電路 (IFC) 將樣品分成770個(gè)0.85 nL體積的分區(qū),通過在每個(gè)IFC中使用微流體結(jié)構(gòu),可以將樣品和化驗(yàn)溶液加壓加載到反應(yīng)分區(qū)中。之后,BioMark HD 執(zhí)行原位熱循環(huán),最后借助平面成像技術(shù)進(jìn)行終點(diǎn)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。此外,BioMark系列通過使用多種報(bào)告染料對(duì)標(biāo)本目標(biāo)進(jìn)行量化,可以有效消除假陽性。

在科研應(yīng)用方面,ALIKIAN等[4]使用基于 BioMark的 dPCR 平臺(tái),對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病BCR-ABL1基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量,效果明顯優(yōu)于qPCR。

1.3.2QuantStudio系列 Thermo Fisher Scientific 的 QuantStudio系列包括QuantStudio 3D dPCR 和 QuantStudio 12 K Flex with OpenArray Plates等平臺(tái)。QuantStudio 3D dPCR 芯片具有20 000個(gè)0.8 nL的反應(yīng)孔。樣品加載到芯片上是通過使用預(yù)先吸取樣品的一次性加載刀片實(shí)現(xiàn),之后自動(dòng)芯片加載器可以將樣品分配到芯片,該系列設(shè)備的價(jià)格目前在市場(chǎng)上處于較低水平。

1.3.3Bio-Rad QX系列 Bio-Rad QX 系列是目前市場(chǎng)上相當(dāng)流行的ddPCR儀器,目前提供QX100、QX200和QXONE dPCR等設(shè)備。QX200具有用于液滴生成和熒光檢測(cè)的獨(dú)立單元,可生成約 20 000個(gè)納升大小的液滴。其操作流程:使用定制混合溶液制備樣品,然后借助液滴生成油通過流動(dòng)聚焦形成液滴,最后送入熒光檢測(cè)器。 SUO 等[5]最近的一項(xiàng)研究顯示,使用QX200進(jìn)行新型冠狀病毒感染(COVID-19)的檢測(cè),可報(bào)告范圍為10～5×104拷貝/反應(yīng),在患者咽拭子標(biāo)本中,尤其是在病毒載量處于低水平時(shí),較qPCR顯示出高精度和靈敏度,但QX200在使用中需要手動(dòng)移液,在開放環(huán)境中有一定的污染風(fēng)險(xiǎn)。

1.3.4Raindrop系列 Raindrop 采用 ddPCR 技術(shù),可對(duì)超過100萬個(gè)皮升大小的液滴進(jìn)行高通量處理和實(shí)時(shí)成像。該設(shè)備在單個(gè)微流體平臺(tái)上結(jié)合了快速液滴生成、片上熱循環(huán)和廣域熒光成像技術(shù)。與 QX 系列不同,RainDrop 在生成的單層液滴上使用平面成像技術(shù),并從密封的機(jī)載儲(chǔ)液器自動(dòng)輸送過濾油以消除污染風(fēng)險(xiǎn)。RainDrop 系統(tǒng)在幾個(gè)重要應(yīng)用中都展現(xiàn)出了卓越的分子檢測(cè)性能,包括低頻腫瘤等位基因檢測(cè)、基因表達(dá)、拷貝數(shù)變異和單核苷酸多態(tài)性(SNP)測(cè)量。

對(duì)比來看,ddPCR儀器由于不受芯片制造分辨率的限制,可以利用微流體的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生更小的體積,因此QX200、RainDrop系列可以生成更高的分區(qū)數(shù)?；?cdPCR 的 QuantStudio 3D、Constellation/QIAcuity也已能在小于2 nL的體積內(nèi)實(shí)現(xiàn)10 000個(gè)以上的分區(qū)。

2 dPCR與其他分子診斷技術(shù)的比較

2.1dPCR與qPCR的比較 如表1所示,dPCR和qPCR在熒光測(cè)定、擴(kuò)增影響、檢測(cè)限、定量方式等方面均有不同。由于使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能是通過不同方法標(biāo)定的,不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行的qPCR檢測(cè)可能會(huì)得到不同的拷貝數(shù)。因此dPCR的主要優(yōu)勢(shì)在于其絕對(duì)量化不依賴校準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn),提高了實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的準(zhǔn)確性和可交換性[6]。若樣品中雜質(zhì)阻礙了擴(kuò)增,或靶標(biāo)、引物、探針序列不匹配降低擴(kuò)增效率,都會(huì)導(dǎo)致qPCR定量結(jié)果偏低。而dPCR定量使用終點(diǎn)檢測(cè)而非實(shí)時(shí)擴(kuò)增,定量受標(biāo)本中可能存在的擴(kuò)增抑制劑的影響較小,也較少受到擴(kuò)增效率不佳的影響[7],甚至能在不事先提取核酸的情況下對(duì)標(biāo)本進(jìn)行dPCR檢測(cè)[8]。dPCR可以更精確、靈敏地量化一些靶標(biāo),例如能夠?qū)τ诒O(jiān)測(cè)抗病毒治療的低病毒載量實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量[9]。與qPCR相比,dPCR的更高精度也有助于檢測(cè)和定量罕見變異[10]以及測(cè)定反應(yīng)中高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)靶點(diǎn)的比率。

表1 qPCR與dPCR的比較

dPCR也存在一些不足,有限的標(biāo)本體積會(huì)限制檢測(cè)的下限,有限數(shù)量的分區(qū)會(huì)使得動(dòng)態(tài)范圍較小,分子丟失會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的量化偏低,即在一個(gè)分區(qū)中并不能確保所有的模板都被擴(kuò)增。qPCR儀器能夠測(cè)量4～6種不同染料的熒光,這些染料與樣品中不同的目標(biāo)結(jié)合在一起,而大多數(shù)dPCR儀器可以測(cè)量2種熒光染料,限制了同一標(biāo)本中不同目標(biāo)的多重檢測(cè)能力?？偠灾?dPCR與qPCR因定量方式等方法原理上的差異而各具優(yōu)勢(shì),實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)不同的檢測(cè)需求與應(yīng)用場(chǎng)景選擇合適的檢測(cè)方法。

2.2dPCR與下一代高通量測(cè)序(NGS)的比較 NGS包括全外顯子組測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、全基因組測(cè)序以及靶向高通量測(cè)序等。基于其邊合成邊測(cè)序的核心原理,NGS可以用來對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序,也可以被限制在特定的目標(biāo)區(qū)域。因此NGS屬于非靶向全基因組分析,能夠在不事先知道腫瘤中可能存在的畸變位點(diǎn)種類的情況下檢測(cè)腫瘤特異性改變;而dPCR技術(shù)則需要根據(jù)相關(guān)基因位點(diǎn)的特定突變事先設(shè)計(jì)引物探針來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)定量。NGS的優(yōu)勢(shì)在于其通量高、速度快、精度高等,因而在臨床疾病分子診斷方面發(fā)揮著獨(dú)特作用。COVID-19疫情初期,NGS技術(shù)僅用5 d就獲得了病毒全基因組序列[11]。在腫瘤相關(guān)基因位點(diǎn)突變的檢測(cè)中,NGS平臺(tái)對(duì)血漿cfDNA中EGFR突變檢測(cè)的靈敏度為0.2%,批內(nèi)精密度、批間精密度、準(zhǔn)確度均為100%[12];dPCR平臺(tái)的檢出限為0.308 copy/μL, 準(zhǔn)確度為87.88%[13]。NGS也存在一些問題,尤其是在被應(yīng)用于低水平RNA的分析時(shí),這通常與整個(gè)轉(zhuǎn)錄組(RNAseq)有關(guān)。

dPCR平臺(tái)可以與NGS對(duì)接,對(duì)測(cè)序文庫進(jìn)行質(zhì)量控制、提供對(duì)測(cè)序文庫的定量分析和質(zhì)量評(píng)估信息。dPCR可以對(duì)NGS的結(jié)果,如對(duì)SNP、突變及拷貝數(shù)變異(CNV)在內(nèi)的基因組變異等測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,以確保測(cè)序結(jié)果的可信度。另外,dPCR所得到的結(jié)果還包含反映測(cè)序文庫質(zhì)量的信息,如接頭與接頭二聚體、錯(cuò)誤連接片段、過長(zhǎng)連接片段等,這種優(yōu)勢(shì)是當(dāng)前其他方法不具備的?？偟膩碚f,dPCR與NGS是兩種原理完全不同、能夠滿足不同檢測(cè)需求的分子檢測(cè)技術(shù),dPCR技術(shù)能夠在質(zhì)量控制或驗(yàn)證等方面支持NGS。

3 dPCR在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用

dPCR在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的兩個(gè)主要應(yīng)用是罕見突變檢測(cè)和核酸定量。dPCR主要應(yīng)用于病原體檢測(cè)、CNV檢測(cè)、microRNA (miRNA)表達(dá)分析、下一代測(cè)序、單細(xì)胞基因表達(dá)分析和染色體異常檢測(cè)。

3.1病原體檢測(cè) dPCR中眾多的單個(gè)反應(yīng)分區(qū)使研究病原體的單細(xì)胞基因組學(xué)成為可能。一種名為“IC 3D”的基于液滴的系統(tǒng)已被成功用于在幾分鐘內(nèi)檢測(cè)血液中的單個(gè)細(xì)菌[14]。在人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)檢測(cè)中, QX100TM系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories?)和BioMarkTMHD系統(tǒng)(Fluidigm?)兩種dPCR系統(tǒng)同時(shí)用于標(biāo)本檢測(cè)。其中,使用BioMark系統(tǒng)檢測(cè)得到的病毒拷貝數(shù)比傳統(tǒng)方法檢測(cè)血漿及PBS中提取的DNA分別高出26%和53%。PAVSI等[8]以外周血為標(biāo)本,用dPCR對(duì)標(biāo)本中HIV的 2-LTR序列進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示dPCR能對(duì)治療過程中HIV載量的微量變化進(jìn)行有效檢測(cè),且檢測(cè)精確度較熒光 PCR高出至少20倍。

微滴式dPCR方法已經(jīng)被建立并用于檢測(cè)布魯菌, ddPCR檢出靶標(biāo)基因拷貝數(shù)為1～2.00×105拷貝/反應(yīng),測(cè)得值的對(duì)數(shù)值與DNA濃度的對(duì)數(shù)值有線性關(guān)系,陽性率在布魯氏菌病疫情相關(guān)血液標(biāo)本DNA的檢測(cè)中遠(yuǎn)高于培養(yǎng)法和試管凝集法[15]。利用ddPCR技術(shù),結(jié)合Taqman熒光探針技術(shù)對(duì)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)ORF1ab基因和N基因保守區(qū)進(jìn)行特異性檢測(cè)的試劑盒經(jīng)檢驗(yàn)符合產(chǎn)品技術(shù)要求,獲得了歐盟市場(chǎng)準(zhǔn)入資質(zhì),具有靈敏度高、可定量、操作簡(jiǎn)便和封閉檢測(cè)等特點(diǎn),有利于定量監(jiān)測(cè)SARS-CoV-2載量,在SARS-CoV-2核酸超敏定量檢測(cè)方面具有創(chuàng)新性,達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。2022年,華西醫(yī)院已開展基于五色熒光ddPCR法的血流感染檢測(cè),覆蓋血流感染中常見的16種細(xì)菌、8種真菌、5種病毒,以及碳青霉烯類、甲氧西林、萬古霉素、多黏菌素、青霉素等常見藥物相關(guān)的20個(gè)耐藥基因。cdPCR檢測(cè)肺炎克雷伯菌靈敏度比qPCR提高了約1.5個(gè)數(shù)量級(jí),最低檢出限可達(dá)到3.77 copy/μL[16]?？偟膩碚f,在病原體檢測(cè)中,dPCR已經(jīng)被證明能夠成功檢出各種樣品中低目標(biāo)濃度的待測(cè)物且結(jié)果可靠,已在臨床檢測(cè)中有一定的應(yīng)用。

3.2CNV檢測(cè) CNV是人類遺傳變異的重要來源,與大量的人類疾病密切相關(guān)。dPCR能夠檢測(cè)拷貝數(shù)變異,檢測(cè)限低至1個(gè)拷貝。基于微孔的dPCR已經(jīng)被用于檢測(cè)生殖系核質(zhì)體中的線粒體DNA (mtDNA)拷貝數(shù)。此外,一種稱為“局部臨時(shí)負(fù)壓輔助微流控裝置”的自制裝置已被證明可量化A549肺癌細(xì)胞系中角蛋白19的數(shù)量,并且觀察到熒光斑點(diǎn)的數(shù)量與稀釋因子之間存在良好的相關(guān)性[17]。在肺癌研究中,PENDER等[18]和LIN等[19]分別通過dPCR成功檢測(cè)到了KRAS基因突變和EGFR基因的拷貝數(shù)。KRAS基因突變的檢測(cè)限為2 000∶1(在2 000個(gè)野生KRAS基因中檢測(cè)到一個(gè)KRAS基因突變),靈敏度高于Sanger測(cè)序(10∶1)和下一代測(cè)序(50∶1)。除了肺癌,在高級(jí)別漿液性卵巢癌(HGSOC)的檢測(cè)中,HGSOC組織中缺失的NF1缺失和突變型TP53 p.R175H的數(shù)量已經(jīng)被成功定量[20]?；赿dPCR技術(shù)檢測(cè)融合基因轉(zhuǎn)錄本的方法可對(duì)外泌體中的微量PML-RARA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對(duì)定量,為無創(chuàng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者血清外泌體中PML-RARA融合基因的表達(dá)水平提供了可能[21]?？傊?關(guān)于基因拷貝數(shù)變異或突變的檢測(cè)目前已在dPCR領(lǐng)域引起廣泛研究興趣,并逐漸成為dPCR應(yīng)用的一大主流領(lǐng)域。

3.3miRNA表達(dá)分析 在癌癥的液體活檢中,miRNA被認(rèn)為是一種很有價(jià)值的循環(huán)生物標(biāo)志物,可用于癌癥的早期診斷[22]。其中,ddPCR因其高特異度和高靈敏度,已成為一種快速而準(zhǔn)確的癌癥早期診斷方法。microwell-based dPCR (Thermo Fisher Scientific?)已被用于檢測(cè)肺癌,檢測(cè)5種miRNA生物標(biāo)志物(miR16-5p、miR-21-5p、miR-126-3p、miR-486-5p和miR-600-5p)在肺癌患者血漿、細(xì)胞裂解液和組織中的拷貝數(shù)[23]。也有研究使用ddPCR進(jìn)行急性早幼粒細(xì)胞白血病的檢測(cè),在低濃度的靶基因下仍然表現(xiàn)出良好的批間和批內(nèi)重復(fù)性[24]。在癌癥研究中的其他應(yīng)用包括幫助乳腺癌患者血清中miRNAs的診斷[25]、分析直腸癌患者血漿中miR-155和miR-99b的表達(dá)情況[26]等。以上說明,ddPCR有望成為一種高特異度、高靈敏度、低成本且便捷的癌癥檢測(cè)方法。

3.4新一代測(cè)序驗(yàn)證 二代測(cè)序是一種高通量的測(cè)序技術(shù),它通過引入可逆終止末端,捕捉DNA復(fù)制過程中新添加堿基攜帶的特殊標(biāo)記來確定DNA序列。不同于傳統(tǒng)的qPCR,dPCR精確的結(jié)果定量不依賴于不同的擴(kuò)增子長(zhǎng)度,為高通量測(cè)序提供了靈敏度和絕對(duì)校準(zhǔn)。該方法成功地減少了1 000倍以上的標(biāo)本量,且由于不需要預(yù)先放大,可以最大限度地減少偏差的不良影響。EIBLWIESER等[27]使用多重ddPCR預(yù)先擴(kuò)增患者特異性的EWS融合基因,然后再采用Ion S5系統(tǒng)對(duì)該文庫進(jìn)行測(cè)序,得出基于多重dPCR的靶向富集與NGS的組合提高了鑒定基因組融合序列成功率的結(jié)論。

此外,微流控液滴富集序列分析(MESA)是一種新的基于dPCR的目標(biāo)富集技術(shù)。MESA技術(shù)可以將來自5個(gè)不同基因組位點(diǎn)的250 kb定向基因組DNA富集至31.6倍[28],然后提取基因組DNA片段進(jìn)行基于TaqMan探針的微滴式dPCR,TaqMan陽性液滴經(jīng)介電電泳法回收,然后通過酶促反應(yīng)去除擴(kuò)增子后進(jìn)行測(cè)序。該方法僅需要少量的DNA就能全面識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn)內(nèi)的遺傳多態(tài)性,非常適合生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的遺傳變異研究。

3.5單細(xì)胞基因表達(dá)分析 由于不需要預(yù)擴(kuò)增,dPCR可以在不存在擴(kuò)增偏移的情況下進(jìn)行單細(xì)胞基因表達(dá)分析,這凸顯了它替代傳統(tǒng)qPCR的潛力,能夠?qū)?xì)胞發(fā)育機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。例如,在一項(xiàng)對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究中,使用條形碼引物對(duì)微珠進(jìn)行修飾,每個(gè)與微珠結(jié)合的單細(xì)胞被封裝在油包水的小滴中[29]。甲基化單細(xì)胞限制分析(SCRAM) 已經(jīng)用于分析單細(xì)胞多位點(diǎn)甲基化水平。SCRAM主要包括以下步驟:單細(xì)胞的分離和裂解,甲基化敏感限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA的消化作用,兩個(gè)周期的多位點(diǎn)PCR擴(kuò)增,目標(biāo)甲基化狀態(tài)的確定[30]。Westbrook的團(tuán)隊(duì)總結(jié)了產(chǎn)生高通量單細(xì)胞的微納米技術(shù),并為在單細(xì)胞基因表達(dá)分析中使用dPCR奠定了基礎(chǔ)[31]。dPCR在單細(xì)胞基因表達(dá)分析中的應(yīng)用引起了研究者們的廣泛興趣。

3.6染色體異常分析 染色體異常是指染色體某一片段的缺失、添加或不規(guī)則變化。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法如侵入性羊膜穿刺、絨毛膜取樣等可能會(huì)造成胎兒丟失。無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPS)或通過dPCR檢測(cè)胎兒的染色體異常對(duì)胎兒的影響較小,檢測(cè)更加準(zhǔn)確,已成為目前新的診斷方法。2012年,BARRETT等[32]借助dPCR對(duì)孕婦血漿中的無細(xì)胞胎兒DNA(cffDNA)進(jìn)行了鐮狀紅細(xì)胞貧血檢測(cè)。TAN等[33]采用鎖核酸(LNA)探針的多重 ddPCR 檢測(cè)準(zhǔn)確地識(shí)別了胎兒非整倍體,證明了多重dPCR在非侵入性產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的可行性,是具有重要應(yīng)用潛能的產(chǎn)前診斷方法。在胎兒染色體的21-三體、18-三體、13-三體檢測(cè)中,使用dPCR-NIPT檢測(cè)技術(shù)能夠在細(xì)胞游離DNA(cfDNA)分?jǐn)?shù)低至5%、提取的cfDNA濃度低至0.2 ng/μL的情況下檢測(cè)出三體瘤[34]。在283份臨床標(biāo)本檢測(cè)中,dPCR-NIPT測(cè)定顯示檢測(cè)靈敏度為100.00%,特異度為95.12%,優(yōu)于現(xiàn)有的方法。在胎兒的非整倍體染色體診斷中,JACKY等[35]提出了一種虛擬分區(qū)ddPCR分析方法,該方法根據(jù)熒光強(qiáng)度劃分多個(gè)閾值,以確定每個(gè)陽性液滴中目標(biāo)基因的數(shù)量。這種算法減少了分區(qū)誤差,從而提高了基于復(fù)用ddPCR進(jìn)行三體細(xì)胞鑒定的準(zhǔn)確性。

dPCR還可以準(zhǔn)確反映標(biāo)本中的Y染色體微缺失狀況,優(yōu)化后的dPCR方法檢測(cè)標(biāo)本的濃度可低至0.1 mg/L,該值遠(yuǎn)低于常規(guī)qPCR的檢測(cè)限(1 mg/L),可開發(fā)成為男性不育癥及其他生殖診斷中的重要技術(shù)[36]。

4 展 望

目前,dPCR 在病原體鑒定和病原微生物的定量檢測(cè)上具有突出優(yōu)勢(shì):臨床標(biāo)本無須經(jīng)過病原微生物培養(yǎng)過程即可進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè),縮短了報(bào)告周期,且可以從多種高濃度的背景核酸中檢出病原微生物,使快速檢測(cè)潛在的病原微生物成為可能,對(duì)于感染性疾病的診斷和控制具有重大意義。此外,dPCR在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用也正在不斷被拓寬,它適用于檢測(cè)各種體液標(biāo)本中的腫瘤相關(guān)突變,可輔助分析患者的腫瘤突變,能夠部分克服腫瘤的異質(zhì)性;此外,dPCR可以從分子表型層面發(fā)現(xiàn)腫瘤的早期耐藥突變,從而提示醫(yī)生耐藥出現(xiàn)的可能性,幫助調(diào)整用藥方案。同時(shí),dPCR能大幅降低體細(xì)胞中背景DNA的干擾,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的有效檢測(cè),還能定量監(jiān)測(cè)突變頻率變化,量化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。目前dPCR技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于EGFR、KARS、BRAF、PIK3CA等各種癌基因突變檢測(cè),以及癌癥相關(guān)基因(如HER2基因)的擴(kuò)增檢測(cè)。相比于NGS,dPCR對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員和設(shè)施的要求低,操作流程簡(jiǎn)易,報(bào)告時(shí)間快速,便于臨床實(shí)驗(yàn)室工作的開展。

同時(shí),dPCR也面臨一些挑戰(zhàn),包括檢測(cè)下限受限、動(dòng)態(tài)范圍小、RNA PCR中目標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄不完整導(dǎo)致檢測(cè)不到所有的拷貝等。cdPCR成本高、通量低的問題也對(duì)其提出了挑戰(zhàn)。在檢測(cè)低拷貝數(shù)標(biāo)本時(shí),ddPCR較不穩(wěn)定,需要重復(fù)檢測(cè)以獲得合格的數(shù)據(jù)。dPCR臨床檢測(cè)還沒有統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),缺乏商品化的室內(nèi)質(zhì)控品,同時(shí)由于靈敏度較高,檢測(cè)過程中容易遭受外源污染,因此需要做好實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制,建立規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)操作流程和結(jié)果評(píng)估分析體,加強(qiáng)人員培訓(xùn),在大量比對(duì)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上才能夠進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)室。