罕見(jiàn)抗-M鑒別分析:附1例報(bào)道*

鄒 昕,虞 茜,馬思飛,楊紅梅△

1.江蘇省常州市中心血站輸血研究室,江蘇常州 213004;2.江蘇省常州市臨床輸血重點(diǎn)專(zhuān)科實(shí)驗(yàn)室,江蘇常州 213004

MNS血型系統(tǒng)是第2個(gè)被發(fā)現(xiàn)的血型系統(tǒng),目前大約包括 50個(gè)抗原?？?M是較常見(jiàn)的“天然抗體”,國(guó)內(nèi)有研究報(bào)道,產(chǎn)前抗體篩查中抗-M被列為繼Rh血型系統(tǒng)的第2位常見(jiàn)抗體,大多數(shù)抗-M只在低于37 ℃有反應(yīng),最適反應(yīng)溫度為4 ℃[1]。常州市中心血站在獻(xiàn)血者篩查中發(fā)現(xiàn)1個(gè)特殊案例,血漿中存在一種罕見(jiàn)的抗-M,影響ABO血型鑒定,但這種抗-M不與其自身M抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞凝集?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 獻(xiàn)血者,女,30歲,江蘇常州人,漢族,2022年4月12日首次無(wú)償獻(xiàn)血,在常州市中心血站檢驗(yàn)科篩查的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其ABO血型正定型為B型,反定型為O型,因正反定型不符送EDTA抗凝血和非抗凝血標(biāo)本到常州市中心血站輸血研究室進(jìn)行血型鑒定。

1.2儀器與試劑 日本久保田KA-2200血清學(xué)專(zhuān)用離心機(jī);上海躍進(jìn)醫(yī)療37 ℃恒溫水浴箱;強(qiáng)生ORTHOTM Workstation離心機(jī)。抗-A/B單克隆抗體(批號(hào):20201221)、抗-D(IgM)單克隆抗體(批號(hào):20201201104)、ABO血型反定型紅細(xì)胞(批號(hào):20225309)、抗-M和抗-N(批號(hào):20211011、20200709)、2-Me(批號(hào):20217701)、酸放散試劑盒(批號(hào):20212101)均購(gòu)自上海血液生物公司;抗體篩選細(xì)胞和譜細(xì)胞(批號(hào):702205、732205)購(gòu)自德國(guó)CE公司;抗人球蛋白卡(批號(hào):AHC228H)購(gòu)自強(qiáng)生公司;人源抗-M(批號(hào):20220128)自制。

1.3方法

1.3.1血清學(xué)檢測(cè) 用試管法進(jìn)行ABO、Rh血型鑒定;用試管法、凝膠卡法進(jìn)行直接抗球蛋白試驗(yàn)和不規(guī)則抗體篩查;應(yīng)用譜細(xì)胞進(jìn)行不規(guī)則抗體鑒定;用等比稀釋法進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)。所有試驗(yàn)嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[2]及試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2吸收放散試驗(yàn) 用生理鹽水洗滌3次所需壓積細(xì)胞1 mL(O型分別為MN型、MM型、NN型紅細(xì)胞以及自身紅細(xì)胞),均加入等量受檢血清混勻,放入4 ℃冰箱吸收60 min ,其間搖動(dòng)混勻2～3次,離心去上清液,然后用4 ℃生理鹽水洗滌6次,取第6次洗滌液作為對(duì)照,分別加入與紅細(xì)胞等量的生理鹽水,56 ℃水浴熱放散10 min,其間搖動(dòng)混勻2～3次,離心取放散液,挑選相應(yīng)的譜細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3MN基因測(cè)序分析和序列比對(duì) 該實(shí)驗(yàn)部分由天津秀鵬公司完成。根據(jù)GenBank 的NG-007470基因參照序列,使用Oligo 軟件自行設(shè)計(jì)GYPA 基因第2外顯子的上、下游引物,進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1ABO/MNS血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 該獻(xiàn)血者血型正定型為B型,反定型結(jié)果顯示血清與A、 B、O細(xì)胞均為凝集狀態(tài),但與自身細(xì)胞無(wú)凝集,紅細(xì)胞與單克隆抗-M及人源抗-M反應(yīng)均有凝集,該獻(xiàn)血者M(jìn)NS血型見(jiàn)表1。用經(jīng)篩選出M陰性的Ac、Bc、Oc獻(xiàn)血者紅細(xì)胞做反定型,結(jié)果為B型。

表1 該獻(xiàn)血者ABO/MNS血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2直接抗球蛋白試驗(yàn) 多特異性抗球蛋白、抗-IgG、抗-C3d均為陰性。

2.3抗體鑒定 該獻(xiàn)血者反定型結(jié)果提示其體內(nèi)有不規(guī)則抗體,進(jìn)一步進(jìn)行抗體鑒定。其血漿與德國(guó)CE譜細(xì)胞(批號(hào):732205)反應(yīng),在鹽水、聚凝胺、抗球蛋白凝膠卡試管法中結(jié)果符合IgM型的抗-M。用酶處理細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行抗體鑒定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。為了排除IgM抗體的干擾,血清與等量的2-Me在37 ℃孵育30 min,繼續(xù)抗體鑒定結(jié)果均為陰性。

2.4吸收放散試驗(yàn) 將該獻(xiàn)血者血漿分別用O型的MM、NN型紅細(xì)胞以及自身紅細(xì)胞吸收;該獻(xiàn)血者的紅細(xì)胞用人源抗-M血清吸收,再進(jìn)行熱放散。放散液與相應(yīng)的譜細(xì)胞(1、3、4號(hào))反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 吸收放散試驗(yàn)結(jié)果

2.5抗體效價(jià)測(cè)定 用純合子MM型細(xì)胞作效價(jià)測(cè)定,試管法檢測(cè)該抗-M效價(jià)為16。

2.6MN基因測(cè)序分析和序列比對(duì) 基因測(cè)序GYPA 第2外顯子59位C>T,71位G>A,72位T>G(均為雜合峰)。測(cè)序結(jié)果顯示標(biāo)本基因分型結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果相符為MN型,堿基序列未發(fā)現(xiàn)異常突變。特征序列見(jiàn)圖1。

圖1 基因測(cè)序GYPA 第2外顯子結(jié)果

3 討 論

類(lèi)同種特異性自身抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)類(lèi)抗體),被認(rèn)為具有明顯紅細(xì)胞同種抗體特異性,又能被該特異性抗原陰性的紅細(xì)胞吸收的一類(lèi)抗體,而真正的同種抗體僅能被抗原陽(yáng)性的紅細(xì)胞吸收[3-5]。通常情況下,紅細(xì)胞表面存在相關(guān)的抗原,而血漿中不應(yīng)存在該抗原對(duì)應(yīng)的抗體。該獻(xiàn)血者血清在鹽水介質(zhì)中檢測(cè)出明顯特異性抗-M,自身有M抗原,與自身細(xì)胞不凝集,結(jié)果相矛盾不符合常理,因此排除類(lèi)抗-M。有研究表明人類(lèi)紅細(xì)胞MNS血型中抗-M的產(chǎn)生與M抗原是否存在沒(méi)有必然關(guān)聯(lián),與相關(guān)基因GYPA的表達(dá)也無(wú)明顯關(guān)聯(lián)[6-7],為了研究這個(gè)問(wèn)題從兩方面著手考慮:(1)該檢測(cè)的抗體是否為抗-M;(2)該檢測(cè)的抗原是否為M抗原。

筆者又用進(jìn)口Sanquin(批號(hào):800451970)的16份譜細(xì)胞鑒定,再次證實(shí)該抗體有抗-M特異性。有文獻(xiàn)報(bào)道抗-M1同樣具有抗-M特異性,研究發(fā)現(xiàn)早期的抗-M1是在NN個(gè)體血清中和抗-M一起被發(fā)現(xiàn)的,M1只在M陽(yáng)性紅細(xì)胞上存在,抗原在非洲裔人群中頻率高達(dá)24%,而在白種人中頻率為4%[8]?？?M1也被認(rèn)為是唯一的特異性,與抗-M不同,但又有交叉反應(yīng),在譜細(xì)胞上顯示沒(méi)有劑量效應(yīng),不符合積分規(guī)律。本案例中譜細(xì)胞凝集強(qiáng)度具有明顯的劑量效應(yīng),基本排除該抗體為抗-M1。用吸收放散試驗(yàn)進(jìn)一步證明獻(xiàn)血者抗-M能被異體的M抗原陽(yáng)性的細(xì)胞吸收放散,但不能被M抗原陰性和自身細(xì)胞吸收放散,且沒(méi)有證據(jù)表明獻(xiàn)血者體內(nèi)紅細(xì)胞被自身抗體破壞,能排除該抗-M為自身抗體。早期文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)在M抗原陽(yáng)性的個(gè)體血清中鑒定出類(lèi)抗-M同種抗體,這種抗體與自身細(xì)胞不反應(yīng),患者的類(lèi)抗-M和他的MN型孩子的細(xì)胞均不反應(yīng),與MN型姐妹也不發(fā)生反應(yīng)[9]。鑒于吸收放散試驗(yàn)結(jié)果,該獻(xiàn)血者的血漿不能輸注給M陽(yáng)性患者,若為受血者,需要輸注交叉配血相合的M陰性血液。

MNS系統(tǒng)本身也是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng),很多抗原能夠發(fā)生交叉反應(yīng)。比如一些單克隆抗-M與He會(huì)有交叉反應(yīng),但是多克隆抗-M不涉及這種交叉反應(yīng)問(wèn)題[8]。因此筆者用人源的抗-M鑒定進(jìn)一步證實(shí)該獻(xiàn)血者為M抗原陽(yáng)性。MNS血型系統(tǒng)基因多態(tài)性的產(chǎn)生機(jī)制主要有單核苷酸突變(相關(guān)抗原如 S/s、Mit等)、兩個(gè)或多個(gè)核苷酸突變(如 M/N抗原等)、基因轉(zhuǎn)換(如 Mia、Mur抗原等)、基因不等位交換[8](如 Hil 抗原等)。該獻(xiàn)血者M(jìn)N基因測(cè)序分析和序列比對(duì)結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果相符為MN型,堿基序列未發(fā)現(xiàn)異常突變。還有一種情況由于GYPA和GYPB發(fā)生了不等交換產(chǎn)生了變異體GP.Hil表型紅細(xì)胞,它不僅是一個(gè)表達(dá)GP(B-A)血型蛋白的雜交基因,而且其兩側(cè)有正常的GYPA和GYPB[10]。這樣的雜交子可以解釋異常的MNS表型。獻(xiàn)血者血清學(xué)分型結(jié)果為MN型但其凝集強(qiáng)度偏弱,MN基因測(cè)序分析和序列比對(duì)結(jié)果也為MN型。由于實(shí)驗(yàn)條件有限,本案例沒(méi)有應(yīng)用免疫印跡技術(shù)進(jìn)一步鑒定血型糖蛋白,對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)是否有變化無(wú)法判斷,條件允許的情況下可以做家系調(diào)查,同時(shí)還應(yīng)分析該例抗-M與其他人類(lèi)和單克隆抗-M的性能區(qū)別,如不同人的紅細(xì)胞M血型檢測(cè)、吸收放散試驗(yàn),還要檢測(cè)吸收后血漿中的抗-M活性。

綜上所述,MNS系統(tǒng)的相應(yīng)抗原復(fù)雜且多樣化,本文報(bào)道的該例獻(xiàn)血者紅細(xì)胞上既有M抗原,血清中又檢出抗-M,因此將血型血清學(xué)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合才能更準(zhǔn)確地鑒定標(biāo)本。該獻(xiàn)血者血漿中存在一種罕見(jiàn)的抗-M,這種抗-M不與M抗原陽(yáng)性的自身紅細(xì)胞凝集,但與異體M陽(yáng)性紅細(xì)胞反應(yīng),其血漿不能輸注給M陽(yáng)性的患者,患者輸血時(shí)應(yīng)該選擇交叉配血相容的M陰性紅細(xì)胞。