地龍配方顆粒多指標成分測定及質(zhì)量評價

李 雷，張成中，張漢明，卜其濤，張 磊 （海軍軍醫(yī)大學藥學院, 上海 200433）

中藥配方顆粒是以符合標準的單味中藥飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取、濃縮、制粒而成的一種新型中藥制劑[1]。1992 年，國家批準了試點生產(chǎn)企業(yè)進行中藥配方顆粒研發(fā)，2001 年，將其規(guī)范命名為“中藥配方顆?！保瑫r納入中藥飲片管理范疇。2021 年國家先后公布了兩批次196 種配方顆粒的國家標準[2-3]，標志著中藥配方顆粒正式步入歷史舞臺。地龍配方顆粒目前仍屬于企業(yè)在研品種，由于藥材來源、制備工藝和質(zhì)量標準不同，其產(chǎn)品質(zhì)量亦存在差異，加之2020 年版《中國藥典》中地龍項下缺少指標成分和定量評價方法[4]，使其仍缺少統(tǒng)一的評價指標。

核苷類成分是地龍舒張支氣管、抗組胺、平喘的物質(zhì)基礎[5]，通過對核苷類成分的評測，可在一定程度上反映地龍藥材和配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。有研究表明，利用高效液相色譜法（HPLC）建立的特征圖譜，能較好地表征地龍藥材中核苷類成分[6-7]，同時可對其進行含量測定[8-12]，也有用該方法測定地龍配方顆粒中次黃嘌呤的含量并對其進行質(zhì)量評價的研究報道[13-14]。本研究采用高效液相色譜法測定不同廠家地龍配方顆粒中次黃嘌呤、肌苷、鳥苷和腺苷4 種核苷類成分的含量，并應用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版）》建立指紋圖譜進行質(zhì)量評價。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Vanquish Core 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。EX125DZH 型十萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；ME204E/02 型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；SB-5200DTD 型超聲波清洗機（上海般諾生物科技有限公司）。

1.2 試劑

乙腈（上海泰坦科技股份有限公司）；水（屈臣氏蒸餾水）。

1.3 藥材

尿嘧啶對照品（批號：B20908）,次黃嘌呤對照品（批號：B20211），尿苷對照品（批號：B20907）,鳥苷對照品（批號：B20902），肌苷對照品（批號：B20582），以上對照品購自上海源葉生物科技有限公司；黃嘌呤對照品（批號：C12004027，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；腺苷對照品（批號：SA8060，北京索萊寶科技有限公司）；純度均大于98%。地龍對照藥材（參環(huán)毛蚓，Pheretima，批號：120987-201508，中國食品藥品檢定研究所）；樣品S1～S10 為不同廠家或批次生產(chǎn)的地龍配方顆粒。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，洗脫條件見表1；流速0.6 ml/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μl。理論塔板數(shù)按肌苷峰計算不小于3 500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照溶液的制備

取地龍對照藥材約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入雙蒸水50 ml，稱定重量。于60 ℃水浴30 min，再超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放至室溫，稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，取上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

分別稱取對照品適量，制成含尿嘧啶0.504 mg/ml，次黃嘌呤0.326 mg/ml，黃嘌呤0.345 mg/ml，尿苷0.420 mg/ml，肌苷0.420 mg/ml，鳥苷0.338 mg/ml，腺苷0.350 mg/ml 的儲備液，置4 ℃儲存?zhèn)溆?。取上述對照品儲備液適量，制成含尿嘧啶20.16 μg/ml，次黃嘌呤60.52 μg/ml，黃嘌呤17.25 μg/ml，尿苷21.00 μg/ml，肌苷138.2 μg/ml，鳥苷33.82 μg/ml 和腺苷35.02 μg/ml 的混合對照溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取地龍配方顆粒適量，研細，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入雙蒸水50 ml，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放至室溫，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，取上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜峰的指認

取混合對照溶液和樣品S1，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。根據(jù)對照品的保留時間，指認了地龍配方顆粒HPLC 圖譜中7 個主要色譜峰（圖1），分別為尿嘧啶（峰1）、次黃嘌呤（峰2）、黃嘌呤（峰3）、尿苷（峰4）、肌苷（峰5）、鳥苷（峰6）和腺苷（峰7）。

1.尿嘧啶 2.次黃嘌呤 3.黃嘌呤 4.尿苷 5.肌苷 6.鳥苷 7.腺苷A.混合對照品色譜圖；B.供試品色譜圖

2.4 HPLC 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗

取樣品S1，按“2.2.2”項制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定6 次，以肌苷峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，二者RSD分別小于0.12%和2.46%，表明儀器精密度良好。

采用上述方法治療腰椎間盤突出癥,具有治愈率高、并發(fā)癥少、恢復快、復發(fā)率低的特點,中藥配方結合中醫(yī)手法整復治療腰椎間盤突出癥是目前簡便易行的治療方法,有助于在相關領域?qū)W術交流活動的開展,值得臨床推廣使用。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取樣品S1，按“2.2.2”項制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h 時按“2.1”項下色譜條件測定，以肌苷峰為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 分別小于0.16%和2.73%，表明該溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗

取6 份樣品S1，按“2.2.2”項制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以肌苷峰為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 分別小于0.14%和2.52%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 對照指紋圖譜的生成

取樣品（S1～S10）和對照藥材，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，將所得的HPLC 圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2 012.130 723 版）》軟件，以樣品S1 色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，經(jīng)多點校正后，進行全譜峰匹配，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜R（圖2）。

圖2 10 批地龍配方顆粒和對照藥材的HPLC 指紋圖譜

使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723 版）》軟件對各廠家的地龍配方顆粒和對照藥材的HPLC 圖譜與對照特征圖譜進行相似度計算。結果10 批次地龍配方顆粒（S1～S10）和對照藥材的HPLC 指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為：0.943、0.953、0.961、0.982、0.912、0.970、0.989、0.974、0.972、0.978、0.945，均大于0.912，表明不同廠家生產(chǎn)的地龍配方顆粒之間，及其與地龍對照藥材所含成分種類較為相似，但成分含量上具有一定的差異。

2.5 4 種成分的含量測定

2.5.1 線性關系考察

分別取混合對照溶液0.1、0.25、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ml 置于10 ml 容量瓶中，定容。取上述溶液和混合對照溶液適量，0.45 μm 濾膜濾過，按“2.1”項下色譜條件檢測（n=2），以樣品濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，計算得回歸方程和相關系數(shù)，結果見表2。結果各回歸方程的相關系數(shù)r≥0.999 9，表明4 種成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 4 種核苷類成分線性關系

2.5.2 精密度試驗

取混合對照溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，次黃嘌呤、肌苷、鳥苷和腺苷峰面積的RSD 分別為0.19%、0.07%、0.26%、0.13%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗

取S1 樣品6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測，記錄峰面積并計算含量。次黃嘌呤、肌苷、鳥苷和腺苷含量的RSD 分別為1.94%、0.83%、0.94%、1.51%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗

取S1 樣品按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于配制0、4、8、12、16、24 h 時檢測，記錄峰面積。次黃嘌呤、肌苷、鳥苷和腺苷峰面積的RSD 分別為0.37%、0.41%、0.47%、1.31%，表明供試品溶液在24 h 之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗

精密稱取S1 樣品0.25 g，共9 份，分別精密加入相當于已知含量的50%、100%和150%的次黃嘌呤、肌苷、鳥苷和腺苷對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算平均加樣回收率。結果，次黃嘌呤平均回收率為97.95%，RSD 為0.47%；肌苷平均回收率為102.98%，RSD 為0.71%；鳥苷平均回收率為99.20%，RSD 為0.26%；腺苷平均回收率為103.45%，RSD為0.59%。表明該方法準確度良好。

2.6 樣品含量測定

按上述供試品溶液的制備方法和測定條件，測定10 批次地龍配方顆粒和對照藥材中次黃嘌呤、肌苷、鳥苷和腺苷的含量，結果見表3。

表3 4 種成分的含量(n=3)

3 討論

3.1 地龍配方顆粒的核苷類成分與原藥材具有一致性

中藥配方顆粒是將單味中藥飲片水提后經(jīng)多道工序制備而成。藥材產(chǎn)地、質(zhì)量、制備工藝的不同，使產(chǎn)品質(zhì)量存在差異。從不同廠家地龍配方顆粒中核苷類成分與含量的測定結果來看，所有配方顆粒中均含有次黃嘌呤、肌苷、鳥苷和腺苷4 種核苷類成分，而且肌苷含量最高，次黃嘌呤次之，與地龍藥材（飲片）中核苷類成分含量中肌苷含量最高，次黃嘌呤含量次之的報道比較相符[7-11]，說明從飲片提取至顆粒成品過程中，肌苷和次黃嘌呤的相對含量未發(fā)生較大變化，也表明了該成分在顆粒和藥材（飲片）中具有一定的穩(wěn)定性。而從含量測定結果來看，不同廠家地龍配方顆粒中4 種核苷類成分構成比差異較大，可能是水提過程中，活性酶的存在和條件的差異使核苷類成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化或分解[10,11]。

3.2 指紋圖譜可用于配方顆粒的質(zhì)量控制

指紋圖譜能表征樣品在特定條件下的特性，對照指紋圖譜能表征多個樣品的共性，二者的相似度大小能反映樣品之間共性的多少。本研究用不同廠家10 批次配方顆粒的HPLC 指紋圖譜建立了對照指紋圖譜，各樣品的HPLC 指紋圖譜與對照特征圖譜的相似度在0.910 以上，說明各廠家的地龍配方顆粒成分組成上具有一致性。本研究還將地龍對照藥材HPLC 指紋圖譜與配方顆粒圖譜進行了相似度評價，其與對照特征圖譜的相似度在0.94以上，表明配方顆粒與對照藥材在成分構成上也具有高度一致性。由此可知，HPLC 指紋圖譜可以反映配方顆粒之間的共性與差異，也可以表征配方顆粒與對照藥材間的異同。因此，HPLC 指紋圖譜可用于配方顆粒的質(zhì)量控制與評價。

3.3 合理建立地龍配方顆粒質(zhì)量評價標準

隨著部分中藥配方顆粒標準的頒布，中藥配方顆粒質(zhì)量將逐步完善，而合理選擇質(zhì)量控制成分仍是保證質(zhì)量和藥效的前提。目前，大部分配方顆粒仍執(zhí)行省藥監(jiān)部門標準，經(jīng)查閱多省地龍配方顆粒質(zhì)量標準公示稿發(fā)現(xiàn)，其質(zhì)量控制成分均為肌苷，但含量范圍存在較大差異。地龍配方顆粒中的核苷類成分可對平喘功效進行評價，而其與清熱定驚、通絡、利尿等功效的關聯(lián)關系仍不明確。因此，通過核苷類成分單一維度來對地龍的整體質(zhì)量狀況進行評價是不全面的，需要從多維度建立地龍配方顆粒的質(zhì)量評價標準，使其能全面反映地龍的不同功效。

本實驗在同一色譜條件下建立了地龍配方顆粒的指紋圖譜，測定并比較了不同廠家地龍配方顆粒中次黃嘌呤、肌苷、鳥苷和腺苷4 種成分的含量，從一定程度上反映了地龍配方顆粒的特征及內(nèi)在質(zhì)量。本研究所用方法簡便、穩(wěn)定，具備定性和定量作用，并且分析和評價能力良好，能為地龍配方顆粒的鑒別和質(zhì)量評價研究提供參考。