鳥苷酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

劉晨，丁長河＊，金少舉，陳復生，杜娟

（1.河南工業(yè)大學 食品學院，鄭州 450001；2.河南省南街村（集團）有限公司，河南 漯河 462000）

鳥苷酸作為組成核酸的5種核苷酸之一，具有獨特的香菇樣鮮味，因其鮮味閾值達到0.0125g/dL，常被用于增強食品的鮮味［1］。在食品工業(yè)中主要以其鈉鹽（鳥苷酸二鈉）的形式作為食品添加劑，用作調味料、醬油、味精的原料，通常與谷氨酸鹽一起用于增強食品的鮮味［2］。在醫(yī)藥領域，鳥苷酸具有高度的生物活性，可以提高機體免疫力、輔助抗腫瘤、促進生長以及調節(jié)機體營養(yǎng)代謝，能夠促進肝功能恢復、調節(jié)機體免疫功能、抗癌等［3－6］，使鳥苷酸成為極具開發(fā)潛質的醫(yī)藥原料。此外，鳥苷酸具有的抗氧化活性，對神經的生長影響非常大［7－10］，可以保護細胞免受活性自由基的侵害。鳥苷酸在食品以及藥品工業(yè)中都起著不可估量的作用。

鳥苷酸的生產方法有酶水解RNA法、菌體自溶法、發(fā)酵法和化學合成法4種方法。鳥苷酸生產工藝目前運用最廣泛的是發(fā)酵轉化法，利用一定微生物，以葡萄糖作為碳源生產鳥苷，再利用生物或化學方法將其轉化為鳥苷酸，如鳥苷磷酸化得鳥苷酸，且工業(yè)化生產鳥苷酸的方法就是采用鳥苷發(fā)酵的二步生產法［11，12］。

目前，我國鳥苷酸發(fā)酵得率較國外先進水平低，鳥苷酸工業(yè)化生產還未成熟，如何提高鳥苷酸產量成為研究的重中之重。本文研究發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件對鳥苷產量的影響，通過單因素試驗及正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵條件進行優(yōu)化［13，14］，得到最佳發(fā)酵工藝，提高鳥苷酸發(fā)酵得率。

1 試驗材料

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）變異菌株：由河南省南街村（集團）有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基（%）

蛋白胨1.0；氯化鈉0.5；牛肉膏粉0.3；瓊脂1.5。

1.2.2 種子培養(yǎng)基（%）

蛋白胨1.0；牛肉膏0.3；氯化鈉0.5。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基（%）

葡萄糖12.0；酵母粉1.6；玉米漿0.2；谷氨酸鈉1.0；磷酸氫二鉀0.2；氯化鈣0.2；碳酸鈣2.0；硫酸銨2.0；硫酸鎂0.05。

1.3 主要試劑

葡萄糖（AR）、硫酸鎂（AR）、碳酸鈣（AR）、氯化鈣（AR）、磷酸氫二鉀（AR）、硫酸銨（AR）、氫氧化鈉（AR）、氯化鈉（AR）、乙腈（HPLC）：天津市科密歐化學試劑有限公司；谷氨酸鈉（BR）：Solarbio公司；酵母浸粉（BR）、牛肉膏（BR）、蛋白胨（BR）、營養(yǎng)瓊脂（BR）：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.4 主要儀器

高效 液 相 色 譜 儀 （Agilent Technologies 1260 Infinity） 安捷倫科技公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP－9052） 上海精宏實驗設備有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器（DSX－280B） 上海申安醫(yī)療器械廠；單人單面凈化工作臺（SW－CJ－1FD） 蘇州凈化設備有限公司；臺式低速離心機（TDL－5A） 金壇市醫(yī)療儀器廠；漩渦振蕩器（UVS－1） 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；電子萬用爐（DL－1） 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器（SHZ－2A） 金壇華峰儀器有限公司；電子天平（JY5002） 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK－98－Ⅱ） 天津市泰斯特儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 菌種活化

菌種定期活化，取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，置于恒溫培養(yǎng)箱中36℃恒溫靜置培養(yǎng)24h。

2.2 搖瓶種子培養(yǎng)

在500mL三角瓶中加入50mL種子培養(yǎng)基，8層紗布封口，置于高壓滅菌鍋中在121℃下滅菌15min，在恒溫水浴鍋中恒溫至36℃，接種1環(huán)或2環(huán)斜面保存菌種，36℃，100r/min，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～15h。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

在500mL三角瓶中加入27mL種子培養(yǎng)基，8層紗布封口，置于高壓滅菌鍋中在121℃下滅菌15min，在恒溫水浴鍋中恒溫至36℃，接種種子液3mL，36℃，110r/min，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

2.4 正交試驗設計

將發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母粉、玉米漿、谷氨酸鈉等成分及發(fā)酵條件如溫度、發(fā)酵時間、pH等進行單因素試驗，再選取對鳥苷產量有顯著性影響的單因素，考慮因素間交互作用進行三因素三水平正交試驗。

2.5 發(fā)酵樣品預處理

準確吸取發(fā)酵樣品0.1mL于10mL離心管中，用4mol/L NaOH 定容至10mL，混合均勻，沸水浴5min，再以3000r/min離心5min。取離心后上清液1mL，稀釋定容至100mL，供測定。采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的鳥苷含量，柱子：C18，流動相：乙腈∶水為10∶90，流速：1mL/min，檢測波長：256nm，柱溫：25℃，進樣量：10μL［15］。

3 結果和討論

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對鳥苷產量的影響

3.1.1 葡萄糖濃度對鳥苷產量的影響

選取葡萄糖濃度8%，10%，12%，14%，16%5個水平，在發(fā)酵條件為菌種培養(yǎng)時間12h、接種量10%、發(fā)酵時間72h、發(fā)酵液pH 7.0、發(fā)酵溫度36℃時，葡萄糖濃度與鳥苷產量關系見圖1。

圖1 葡萄糖濃度與鳥苷產量關系Fig.1The relationship between the concentration of glucose and the yield of vernine

由圖1可知，當葡萄糖濃度為12%時，鳥苷產量最高，達到7.6g/L。顯著性分析表明：葡萄糖濃度為12%時鳥苷產量與8%，14%，16%3組之間存在極顯著性差異（P＜0.01），與葡萄糖濃度10%組之間存在顯著性差異（P＜0.05），葡萄糖濃度對鳥苷產量有顯著性影響。

3.1.2 酵母粉濃度對鳥苷產量的影響

發(fā)酵條件同3.1.1，葡萄糖濃度為12%，選取酵母粉濃度為1.2%，1.6%，2.0%，2.4%，2.8%5個水平進行鳥苷發(fā)酵，酵母粉濃度與鳥苷產量關系見圖2。

圖2 酵母粉濃度與鳥苷產量關系Fig.2The relationship between the concentration of yeast powder and the yield of vernine

由圖2可知，在酵母粉濃度為1.6%時，鳥苷產量最高，達到6.5g/L。顯著性分析表明：酵母粉濃度為1.6% 時鳥苷產量與1.2%，2.0%，2.4%，2.8%4組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），鳥苷產量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；酵母粉濃度達1.6%之后，隨著酵母粉含量增加，反而對鳥苷發(fā)酵有抑制作用。

3.1.3 玉米漿粉濃度對鳥苷產量的影響

發(fā)酵條件同3.1.1，葡萄糖濃度為12%，酵母粉濃度為1.6%，選取玉米漿粉濃度0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%5個水平，玉米漿粉濃度與鳥苷產量關系見圖3。

圖3 玉米漿粉濃度與鳥苷產量關系Fig.3The relationship between the concentration of corn starch and the yield of vernine

由圖3可知，玉米漿粉濃度為0.2%時，鳥苷產量最高，產量達到6.2g/L。顯著性分析表明：玉米漿粉濃度為0.2% 時，鳥苷產量與0.1%，0.15%，0.25%，0.3%4組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），鳥苷產量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢；玉米漿粉濃度達1.6%之后，隨著濃度增加，反而不利于鳥苷產量積累。

3.1.4 谷氨酸鈉濃度對鳥苷產量的影響

發(fā)酵條件同3.1.1，葡萄糖濃度為12%，酵母粉濃度為1.6%，玉米漿粉濃度為0.2%，選取谷氨酸鈉濃度0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%5個水平，谷氨酸鈉濃度與鳥苷產量關系見圖4。

圖4 谷氨酸鈉與鳥苷產量關系Fig.4The relationship between the concentration of sodium glutamate and the yield of vernine

由圖4可知，當谷氨酸鈉濃度為1%時，鳥苷產量達到7.3g/L。顯著性分析表明：谷氨酸鈉濃度為1%時鳥苷產量與0.8%，1.2%，1.4%，1.6%4組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），谷氨酸鈉濃度對鳥苷發(fā)酵有顯著影響。

3.1.5 硫酸銨濃度對鳥苷產量的影響

發(fā)酵條件同3.1.1，葡萄糖濃度為12%，酵母粉濃度為1.6%，玉米漿粉濃度為0.2%，谷氨酸鈉濃度為1.0%，選取硫酸銨濃度為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%5個水平，硫酸銨濃度與鳥苷產量關系見圖5。

圖5 硫酸銨濃度與鳥苷產量關系Fig.5The relationship between the concentration of ammonium sulfate and the yield of vernine

由圖5可知，當硫酸銨濃度為2.0%時，鳥苷產量達到6.2g/L，隨著硫酸銨濃度增加，鳥苷產量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。顯著性分析表明：硫酸銨濃度為2.0% 時鳥苷產量與1.0%，1.5%，3.0%3組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），與2.5%組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

3.2 不同發(fā)酵條件對鳥苷產量的影響

3.2.1 接種時間對鳥苷產量的影響

鳥苷產量不僅與發(fā)酵培養(yǎng)基配方有關，還與種子生理性狀有很大關系。菌種培養(yǎng)時間不足，轉入發(fā)酵培養(yǎng)基中，會出現(xiàn)種子前期生長緩慢，整個發(fā)酵周期延長，產物開始形成的時間推遲等常見的幾種現(xiàn)象，甚至會出現(xiàn)發(fā)酵異?，F(xiàn)象。菌種培養(yǎng)時間過長，菌體會在種子培養(yǎng)基中過早自溶，會影響后期鳥苷積累。選取培養(yǎng)8，10，12，14，16h的種子菌種轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種時間與鳥苷產量關系見圖6。

圖6 不同接種時間與鳥苷產量關系Fig.6The relationship between the inoculation time and the yield of vernine

由圖6可知，培養(yǎng)12h的種子液轉移至發(fā)酵培養(yǎng)基得到鳥苷產量最高，達6.9g/L。顯著性分析表明：接種時間為12h時鳥苷產量與8，10，14，16h4組不同接種時間之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），確定最適接種時間為12h。

3.2.2 接種量對鳥苷產量的影響

培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分有限，接種量多少對鳥苷積累有顯著影響。接種量少，培養(yǎng)基得不到充分利用；接種量過多，培養(yǎng)基營養(yǎng)有限，會對鳥苷積累產生抑制作用。

圖7 接種量與鳥苷產量關系Fig.7The relationship between the inoculum size and the yield of vernine

選取接種量為6%，8%，10%，12%，14%5個水平，隨著接種量增加，鳥苷產量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。由圖7可知，當接種量為10%時，鳥苷產量達到6.4g/L。顯著性分析表明：接種量為10%時鳥苷產量與6%，8%，14%3組不同接種量之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），與12%接種量之間存在顯著性差異（P＜0.05），確定最適接種時間為12h。

3.2.3 發(fā)酵時間對鳥苷產量的影響

選取發(fā)酵時間48，54，60，66，72，78h6個水平，發(fā)酵時間與鳥苷產量關系見圖8。

圖8 發(fā)酵時間與鳥苷產量關系Fig.8The relationship between the fermentation time and the yield of vernine

由圖8可知，當發(fā)酵時間為72h時，鳥苷產量達到7.9g/L。顯著性分析表明：發(fā)酵時間為72h時鳥苷產量與48，54，60，66，78h5組不同發(fā)酵時間之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），發(fā)酵時間對鳥苷產量有顯著性影響。

3.2.4 發(fā)酵pH對鳥苷產量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基pH是微生物發(fā)酵的一項重要的發(fā)酵參數(shù)，是微生物在發(fā)酵液中代謝活動的綜合指標。pH通過影響微生物內酶活力，從而影響微生物生長和產物積累。

圖9 發(fā)酵pH與鳥苷產量關系Fig.9The relationship between the pH and the yield of vernine

選取pH 值為6.6，6.8，7.0，7.2，7.4 5個水平進行發(fā)酵，由圖9可知，當pH值為7.0時，鳥苷產量最高，達到6.8g/L。顯著性分析表明：發(fā)酵pH為7.0時鳥苷產量與6.6，7.4 2組之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），與pH 為6.8組存在顯著性差異（P＜0.05），與pH 為7.2組不存在差異性（P＞0.05），pH 在7.0～7.2范圍內，鳥苷產量較高。

4.文章字數(shù)控制在1500字或3000字左右，末尾附上作者姓名、單位、聯(lián)系方式、自我介紹（100字內）。

3.2.5 發(fā)酵溫度對鳥苷產量的影響

溫度對微生物發(fā)酵有很大影響。溫度通過影響微生物各種酶反應速率，改變微生物代謝調控機制，從而影響發(fā)酵培養(yǎng)基的理化性質，最終影響發(fā)酵產物的積累。

圖10 發(fā)酵溫度與鳥苷產量關系Fig.10The relationship between the fermentation temperature and the yield of vernine

試驗選取32，34，36，38，40℃5個水平，由圖10可知，最佳發(fā)酵溫度為36℃，此溫度下，鳥苷產量最高，達到8.0g/L。顯著性分析表明：發(fā)酵溫度為36℃時鳥苷產量與32，34，38，40℃4組不同發(fā)酵溫度之間均存在極顯著性差異（P＜0.01），發(fā)酵溫度對鳥苷產量有顯著性影響。

3.3 正交試驗

正交試驗設計和分析方法是目前最常用的工藝優(yōu)化試驗設計和分析方法。鳥苷酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分復雜，交互作用錯綜復雜，發(fā)酵條件對鳥苷產量影響顯著，因此，鳥苷酸發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化工作尤為重要。

3.3.1 正交試驗結果

表1 正交試驗設計表Table 1Orthogonal test design table

為研究因素間的交互作用，采用L27（311）正交試驗表，見表2。

表2 正交試驗結果Table 2The results of orthogonal test

3.3.2 正交試驗結果分析

直觀分析見表3。

表3 鳥苷產量均值響應表Table 3The mean response of the yield of vernine

由表3可知，以鳥苷產量為評價指標，可知發(fā)酵溫度對鳥苷產量影響最大，各因素對鳥苷產量的影響依次為發(fā)酵溫度（B）＞發(fā)酵時間（C）＞葡萄糖濃度（A）。以鳥苷產量為分析指標，選擇鳥苷產量高的組合，通過直觀分析可知最佳組合為A1B2C2。

方差分析結果見表4。

表4 鳥苷產量方差分析表Table 4Analysis of variance of the yield of vernine

由表4可知，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間對鳥苷產量影響達到了極顯著性差異（P＜0.05），葡萄糖濃度對鳥苷產量影響不顯著，交互作用對結果均不顯著。由此分析，結合直觀分析結果，以鳥苷產量為指標，最佳組合為A1B2C2，即葡萄糖濃度10%，發(fā)酵溫度36℃，發(fā)酵時間72h。再次在發(fā)酵條件下進行驗證性試驗，得到鳥苷產量達到10.6g/L。

4 結論

單因素試驗確定了發(fā)酵培養(yǎng)基配方中葡萄糖、酵母粉、玉米漿粉、谷氨酸鈉及硫酸銨的最佳濃度，確定了發(fā)酵工藝參數(shù)適宜范圍，通過正交試驗對鳥苷產量有顯著性影響的葡萄糖濃度、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度3個發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化，確定最優(yōu)組合為葡萄糖濃度10%，發(fā)酵溫度36℃，發(fā)酵時間72h。在此條件下進行鳥苷發(fā)酵試驗，鳥苷產量達到10.6g/L，產量較優(yōu)化前提高了71%。