河西走廊玉米大斑病菌0號(hào)生理小種生物學(xué)特性研究

雷玉明，鄭天翔，邢會(huì)琴，程紅玉，趙文勤，趙文明

1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000 2.甘肅河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000 3.河西學(xué)院祁連山有害生物綜合治理中心，甘肅 張掖 734000 4.德光農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，甘肅 張掖 734000

玉米大斑病是由大斑凸臍蠕孢菌[Exserohilumturcicum(Pass.)LeonardetSuggs.]引起的一種威脅玉米生產(chǎn)的重要葉部病害。1876年在意大利首次發(fā)現(xiàn)，已遍布世界五大洲的所有玉米產(chǎn)區(qū)[1]。我國(guó)最早在1899年就有大斑病發(fā)生的記載，后遍及全國(guó)，以東北、西北、華北北部、南方冷涼山區(qū)的玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生較重[2]。20世紀(jì)80年代，由于引進(jìn)高抗大斑病自交系Mo17，培育和推廣抗大斑病的雜交種，有效控制了田間大斑病的發(fā)生[3]。近幾年來(lái)，我國(guó)玉米種植區(qū)大斑病連年普遍發(fā)生，黃淮海、西北、東北等地大面積推行秸稈還田造成大斑病菌源積累量增大，東北、華北主栽品種抗病性普遍較差，2021年大斑病在東北、華北、西南、西北等大部分地區(qū)中等發(fā)生，局部偏重發(fā)生，發(fā)生面積達(dá)433 hm2[4]。王春明等[5]報(bào)道97份玉米雜交種對(duì)大斑病菌抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)46.39%品種為感病和高感品種，病情分級(jí)達(dá)5～9級(jí)；孫瑞東等[6]對(duì)185份玉米種質(zhì)抗大斑病菌分析，發(fā)現(xiàn)41.08%材料病斑面積在28%～96%之間，表現(xiàn)為感病和高感材料。雷玉明等[7-8]報(bào)道甘肅河西走廊玉米制種田真菌性病害達(dá)46種，其中大斑病發(fā)病率達(dá)48.63%，因受土地連作及抗病性差的親本組合大面積單一種植、病原菌越冬基數(shù)增多、病原種群變化大、病原傳播途徑多等因素的影響，玉米大斑病呈逐年加重趨勢(shì)，成為嚴(yán)重威脅玉米種子生產(chǎn)的主要病害。目前馬周杰等[9]、戴冬青等[10]報(bào)道遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、河北、山西、陜西、河南、山東、安徽等12個(gè)省份大斑病菌生理小種與交配型及遺傳多樣性，郭建國(guó)等[11]明確了甘肅河西走廊大斑病菌以0號(hào)為優(yōu)勢(shì)生理小種。但對(duì)甘肅獨(dú)特地理環(huán)境和氣候條件下的玉米大斑病的研究報(bào)道較少，特別是對(duì)其生物學(xué)特性尚未見(jiàn)系統(tǒng)研究。因此，以甘肅河西走廊玉米制種田大斑病為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究大斑病菌的生物學(xué)特性，分析環(huán)境因子對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)的影響，可為河西走廊玉米大斑病的流行規(guī)律探討和病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

玉米大斑凸臍孺孢病菌0號(hào)生理小種由河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。將純化菌株接種于PSA平板，25 ℃恒溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng)6～7 d，制作成活化菌株平板，用于采集菌餅和配制孢子懸浮液。用10 mL無(wú)菌水將培養(yǎng)6～7 d菌株平板孢子洗下，配成1×106～1×107的孢子懸浮液備用。

1.2 不同溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

采用PSA培養(yǎng)基，用直徑7 mm打孔器從菌落邊緣取圓形菌塊，置于PSA平板中央，設(shè)置5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃共9個(gè)溫度梯度，每處理重復(fù)3次。7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，利用紐鮑爾(Neubauer)血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量[12]。孢子萌發(fā)測(cè)定的溫度設(shè)置同前，吸取懸浮液1 mL采用凹玻片萌發(fā)法，重復(fù)3次，24 h后以孢子芽管長(zhǎng)度大于1/2孢子寬度時(shí)視為萌發(fā)，測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.3 不同pH對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

pH設(shè)3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0共計(jì)9個(gè)梯度(用0.1%HCl和NaOH調(diào)節(jié))。25 ℃恒溫培養(yǎng)，分別測(cè)定病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率[12]。

1.4 不同光照對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

設(shè)24 h/d全光照、12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗、24 h/d全黑暗3種光照處理[12]。

1.5 7種碳源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

以PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別將蔗糖等量替換為葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖、乳糖、淀粉，以不加碳源為對(duì)照(CK)[12]。病菌菌落直徑和產(chǎn)孢量測(cè)定方法與1.2相同。孢子萌發(fā)試驗(yàn)，將供試碳源按照2%濃度配制成培養(yǎng)液，分別吸取孢子懸浮液0.5 mL與2%碳源培養(yǎng)液0.5 mL等量混合，采用凹玻片萌發(fā)法，無(wú)菌水為對(duì)照(CK)，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)。重復(fù)3次，24 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率[13]。

1.6 7種氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

以PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以0.5%的量加入硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、硫酸銨、氯化銨[12]，以不加氮源為對(duì)照(CK)，測(cè)定病菌的菌落直徑和產(chǎn)孢量。孢子萌發(fā)的試驗(yàn)方法與1.5相同[13]。

1.7 菌絲致死溫度測(cè)定

將直徑7 mm的菌餅置于裝有無(wú)菌水的試管中，每管10塊，將試管分別置于45～60 ℃(溫差1 ℃)的恒溫水浴鍋中，共計(jì)16個(gè)溫度梯度，處理10 min(預(yù)熱1 min左右)，迅速冷卻后移植于PSA平板培養(yǎng)基，每皿3塊，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。7 d后觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，以無(wú)菌絲生長(zhǎng)視為死亡，確定菌絲致死溫度[13]。

1.8 分生孢子致死溫度測(cè)定

取5 mL孢子懸浮液裝入無(wú)菌試管中，將試管分別置于45～60 ℃(梯度間隔為1 ℃)恒溫水浴鍋中處理10 min(預(yù)熱1 min左右)，12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率[13]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 12.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan’s新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析。孢子萌發(fā)率計(jì)算公式：孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)的孢子數(shù)/試驗(yàn)的孢子總數(shù))×100%[8,13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)圖1)表明，病菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)的溫度范圍較廣，在5～40 ℃時(shí)均可生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度差異顯著。在28 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，菌落平均直徑達(dá)84.4 mm/7 d；其次為25、30 ℃，菌落平均直徑分別達(dá)75.23 mm/7 d和75.33 mm/7 d；溫度低于10 ℃和高于35 ℃生長(zhǎng)緩慢，表明該菌菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為25～30 ℃。病菌在15～40 ℃間均可產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量差異顯著。28 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，達(dá)8.67×104個(gè)/mL，溫度低于15 ℃和高于40 ℃產(chǎn)孢量顯著下降，表明低溫或高溫環(huán)境抑制產(chǎn)孢。分生孢子萌發(fā)對(duì)溫度的要求范圍較廣，在5～40 ℃時(shí)均可萌發(fā)。25 ℃時(shí)孢子萌發(fā)率最高，達(dá)92.33%；其次為28 ℃，萌發(fā)率達(dá)85.33%；溫度≥30 ℃或≤20 ℃均抑制孢子萌發(fā)，表明該菌分生孢子萌發(fā)最適溫度為25～28 ℃(見(jiàn)圖2)。

2.2 pH對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖3)表明，病菌菌絲生長(zhǎng)的pH適應(yīng)范圍廣泛，在pH 3～11范圍均能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度差異顯著。最適pH為7和8，生長(zhǎng)速度最快，菌落平均直徑分別達(dá)77.33 mm/7 d和77.87 mm/7 d；pH 3～5和pH 10～11菌絲雖能正常生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)緩慢。pH 3～11范圍均能產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢差異顯著，pH 7時(shí)病菌產(chǎn)孢量最高，達(dá)7.03×105個(gè)/mL；其次是pH 8，達(dá)6.93×105個(gè)/mL；pH 3～6和pH 9～11雖能產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢量顯著下降，表明pH 7～8是適宜的產(chǎn)孢范圍。分生孢子在pH 3～11均能萌發(fā)，pH 7時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)80.67%；其次為pH 6和pH 8，分別達(dá)70.67%和70.33%；pH 3～5和pH 9～11分生孢子雖能萌發(fā)，但萌發(fā)率顯著降低，表明分生孢子萌發(fā)適宜pH為6～8(見(jiàn)圖4)。

2.3 光照對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同光照條件下菌絲生長(zhǎng)差異顯著，12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)63.33 mm，全黑暗條件下生長(zhǎng)速度居中，全光照條件生長(zhǎng)最慢。在不同光照處理下產(chǎn)孢量差異顯著，半光半暗、全黑暗條件下產(chǎn)孢量較大，分別達(dá)7.67×104個(gè)/mL、6.67×104個(gè)/mL，全光照條件下產(chǎn)孢量較少。分生孢子在3種光照處理下均能萌發(fā)，差異顯著，半光半暗、全黑暗條件下萌發(fā)率較高，分別達(dá)91.67%、91.00%，全光照條件萌發(fā)率最差。

2.4 碳源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

從測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)圖5)可見(jiàn)，病菌對(duì)供試7種碳源的利用情況存在差異。菌絲在葡萄糖和木糖為碳源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，菌落平均直徑分別達(dá)65.40 mm/7 d和64.47 mm/7 d；其次為果糖和蔗糖，菌落平均直徑分別達(dá)57.37 mm/7 d和57.60 mm/7 d；淀粉培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)緩慢。從產(chǎn)孢量看，以果糖和乳糖、木糖為碳源培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最多，達(dá)6.67×104個(gè)/mL、6.00×104個(gè)/mL，其次為蔗糖，在淀粉培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量與對(duì)照無(wú)差異。從對(duì)分生孢子萌發(fā)影響看，在葡萄糖溶液中萌發(fā)率最高，為80.60%；其次在木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖溶液中萌發(fā)良好，對(duì)分生孢子萌發(fā)具有促進(jìn)作用；而乳糖和淀粉溶液中萌發(fā)率低于無(wú)菌水對(duì)照，可見(jiàn)乳糖和淀粉抑制分生孢子萌發(fā)(見(jiàn)圖6)。

2.5 氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

從測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)圖7)可見(jiàn)，病菌對(duì)氮源的利用表現(xiàn)明顯差異。其中甘氨酸最適合菌絲生長(zhǎng)，菌落平均直徑達(dá)75.73 mm/7 d；在以酵母膏和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，分別達(dá)59.83 mm/7 d、60.10 mm/7 d；而以硝酸鉀、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨等為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較差，生長(zhǎng)量明顯低于不加氮源對(duì)照，說(shuō)明這4種氮源抑制菌絲生長(zhǎng)。從產(chǎn)孢量看，供試7種氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量較不加氮源對(duì)照的明顯減少，說(shuō)明氮源對(duì)分生孢子產(chǎn)生具有抑制作用。從對(duì)分生孢子萌發(fā)影響看，在蛋白胨溶液中萌發(fā)率最高，為87.30%；其次是牛肉膏、甘氨酸，萌發(fā)率為77.50%～78.80%，顯著高于無(wú)菌水對(duì)照萌發(fā)率；而在硝酸鉀、酵母膏、硫酸銨、氯化銨溶液中分生孢子萌發(fā)率顯著低于無(wú)菌水對(duì)照，說(shuō)明對(duì)分生孢子萌發(fā)有抑制作用(見(jiàn)圖8)。

2.6 菌絲和分生孢子的致死溫度

測(cè)定結(jié)果表明，在溫度≥55 ℃時(shí)，未見(jiàn)菌絲生長(zhǎng)，確定菌絲致死溫度為55 ℃，10 min。當(dāng)溫度≥57 ℃時(shí)，分生孢子均不萌發(fā)，確定病菌分生孢子致死溫度為57 ℃，10 min。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，河西走廊病菌生長(zhǎng)的溫度范圍廣泛，在5～40 ℃范圍內(nèi)菌絲和分生孢子均生長(zhǎng)萌發(fā)，15～40 ℃范圍內(nèi)可產(chǎn)孢。菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為25～30 ℃，菌絲和產(chǎn)孢最適溫度28 ℃，病菌在15～40 ℃間均可產(chǎn)孢，分生孢子萌發(fā)最適宜為25～28 ℃，25 ℃萌發(fā)率最高，菌絲致死溫度為55 ℃，分生孢子的致死溫度57 ℃。浦子鋼[14]報(bào)道黑龍江西部地區(qū)的玉米大斑病菌菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為20～30 ℃，上限溫度達(dá)35 ℃，菌絲生長(zhǎng)速度為0，30 ℃孢子萌發(fā)率最高。張治家等[15]報(bào)道山西省侯馬地區(qū)玉米大斑菌株菌絲生長(zhǎng)溫度范圍10～30 ℃，陽(yáng)曲、靜樂(lè)、屯留嶺等地區(qū)菌株15～30 ℃，最適溫度為25 ℃，10、40 ℃菌絲仍然生長(zhǎng)。馮勝澤等[16]研究表明，大斑病菌在15、35 ℃均不產(chǎn)生分生孢子，25 ℃為病菌分生孢子產(chǎn)生的最適溫度。本研究在菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍，最適溫度的上、下限，產(chǎn)孢與孢子萌發(fā)的最適溫度方面與前人研究結(jié)果均存在差異，分析認(rèn)為與該菌因地理區(qū)域、環(huán)境差異而存在不同生理小種的分布相關(guān)。董金皋等[17]報(bào)道玉米大斑病1、2號(hào)生理小種在菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲生長(zhǎng)量、孢子產(chǎn)生量以及致病毒素產(chǎn)生量等生物學(xué)特性方面的溫度效應(yīng)存在著一定的差異，進(jìn)一步證實(shí)了這一相關(guān)性。楊信東等[18-19]對(duì)玉米大斑病田間病葉病斑研究表明，病斑上的病菌在5 ℃以下、35 ℃以上基本不能產(chǎn)孢，在10 ℃以上開(kāi)始產(chǎn)孢，產(chǎn)孢適溫大體在20～26 ℃，25 ℃孢子萌發(fā)率最高，達(dá)96%，孢子萌發(fā)、附著孢形成與侵入適溫大體在20～27 ℃，這一規(guī)律與本研究結(jié)果相似。這些特性與該病害每年8月高溫季節(jié)在甘肅河西走廊玉米田易于發(fā)生流行基本吻合。因此，這一試驗(yàn)結(jié)果可為玉米大斑病生理小種監(jiān)測(cè)、流行預(yù)測(cè)和防治提供科學(xué)依據(jù)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌在pH 3～11的環(huán)境中菌絲和分生孢子均能生長(zhǎng)萌發(fā)，pH 7和8時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快；pH 7時(shí)產(chǎn)孢量7.03×105個(gè)/mL為最多，pH 8產(chǎn)孢量次之；分生孢子萌發(fā)適宜pH為6～8，pH 7時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)80.67%。其變化趨勢(shì)表明，該菌在弱堿性條件下有利于菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)，在中性偏堿環(huán)境下有利于產(chǎn)孢。浦子鋼[14]報(bào)道pH 7時(shí)菌落直徑增長(zhǎng)最快，pH 6～10生長(zhǎng)均表現(xiàn)良好，pH 7時(shí)孢子萌發(fā)率最高為78.9%，pH >8萌發(fā)率有所下降，弱堿條件下生長(zhǎng)略優(yōu)于酸性條件，這一變化規(guī)律與本研究結(jié)果相吻合。與宋文靜等[20]報(bào)道河北省玉米大斑病菌0號(hào)小種的孢子萌發(fā)最適pH 5.0～7.0存在差異，說(shuō)明不同菌株孢子萌發(fā)對(duì)酸堿適應(yīng)性存在差異。因此，在生產(chǎn)上采取檢測(cè)葉部大斑病菌生長(zhǎng)擴(kuò)展的菌態(tài)，有針對(duì)性的選擇偏酸或偏堿性的殺菌劑葉面噴霧，以抑制菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)，降低侵染機(jī)率，達(dá)到防治大斑病的目的。

本研究結(jié)果表明，12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗環(huán)境下菌絲生長(zhǎng)最快，半光半暗、全黑暗條件下產(chǎn)孢量和萌發(fā)率最大，與馮勝澤等[16]、姜開(kāi)梅等[21]報(bào)道的12 h光暗交替培養(yǎng)條件下有利于菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量最大的研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果證實(shí)了低光照條件有利于該病害的發(fā)生規(guī)律，與該病害在田間易出現(xiàn)于中下部葉片的規(guī)律相吻合。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中通過(guò)調(diào)整種植密度，改善田間光照條件，減輕病害的發(fā)生。

從碳源、氮源對(duì)該菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢影響試驗(yàn)看，該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的需求存在一定差異，最有利于菌絲生長(zhǎng)碳源為葡萄糖和木糖，最佳氮源為甘氨酸；最有利于產(chǎn)孢的碳源為果糖和乳糖、木糖；最利于孢子萌發(fā)的碳源為葡萄糖溶液，氮源為蛋白胨溶液；供試7種氮源的產(chǎn)孢量顯著低于無(wú)菌水對(duì)照處理，氯化銨、硫酸銨等無(wú)機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)具有抑制作用，這一結(jié)果與浦子鋼[14]、馮勝澤等[16]前人研究結(jié)果相一致。楊信東等[22]試驗(yàn)證實(shí)，大斑病對(duì)氮肥比較敏感，肥力水平與大斑病菌侵染機(jī)率呈顯著負(fù)相關(guān)，肥力水平較高條件下大斑病發(fā)生較輕。因此，本試驗(yàn)結(jié)果為研究玉米田間肥力水平對(duì)大斑病菌的抗性機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。