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    湖北荊州地區(qū)雞傳染性貧血病病毒的流行病學(xué)調(diào)查及致病性分析

    2023-09-23 08:15:58榮俊李楊楊玉瑩李國攀
    關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹致病性毒株

    榮俊,李楊*,楊玉瑩,李國攀

    1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025 2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025

    雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus,CAV)屬于圓環(huán)病毒科環(huán)狀病毒屬,是一種無包膜的二十面體病毒[1]。自我國于1992年由崔現(xiàn)蘭等[2]首次分離報道該病毒后,全國各地相繼發(fā)現(xiàn)該病的流行。在對我國多個省市2014—2015年CAV的分子流行病學(xué)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),CAV陽性率為13.30%,其中混合感染率為55.56%,為主要的感染類型[3]。對我國13個省市的調(diào)查表明,2016-2019年CAV陽性率為12.5%~25.69%[4],而且CAV的感染在很多國家普遍存在,陽性率甚至高達(dá)60%以上[5-6]。CAV在雞群中是水平和垂直傳播的[7],且不同日齡的雞均容易感染,幼雞感染后會導(dǎo)致嚴(yán)重貧血和免疫抑制,甚至死亡。高日齡雞感染后會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損,從而與禽腺病毒(FADV)、馬立克氏病毒(MDV)等病毒產(chǎn)生混合感染[8]。因存在誘發(fā)多種疾病混合感染與疫苗免疫失敗的風(fēng)險,給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

    CAV基因組全長約2.3 kb,為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA,共含有3個開放讀碼框,分別編碼主要為結(jié)構(gòu)蛋白的VP1、支架蛋白VP2以及名為凋亡蛋白的非結(jié)構(gòu)蛋白VP3,VP1和VP2是中和抗體的主要靶點[9]。VP1與高度保守的VP2和VP3不同,VP1從氨基酸位點139到151位為高突變區(qū),這些氨基酸的突變可能直接影響CAV的復(fù)制、傳染性及其致病性。因此,VP1通常用于CAV的遺傳進(jìn)化和分子研究[10]。

    由于對近年的分離毒株的致病性研究較少,為進(jìn)一步了解CAV的流行情況與毒株的致病性,本研究通過PCR檢測,調(diào)查了湖北荊州地區(qū)菜市場肉雞感染CAV情況,對CAV全長核苷酸序列和VP1的氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析,分析了CAV的遺傳進(jìn)化以及VP1蛋白的分子特征,并采用動物回歸試驗分析強毒株JZ2118的致病性,以期更好地了解在我國傳播的CAV的流行病學(xué)及分子特征與致病性之間的聯(lián)系。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    DNA提取試劑盒與pTOPO-BluntT 載體購自北京艾德萊生物科技有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自O(shè)mega公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司;2×Hieff Canace?Plus PCR Master Mix(With Dye)高保真酶預(yù)混液與Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix購自翌圣生物科技股份有限公司。

    1.2 樣本收集與處理

    2021年在湖北荊州地區(qū)6個菜市場收集肉雞雞肝樣品224份,將收集雞肝用高通量組織冷凍研磨儀進(jìn)行勻漿,研磨后的組織勻漿4 000g離心5 min,取得勻漿上清并參照艾德萊DNA提取試劑盒說明書提取DNA,所提取的DNA儲存于-20 ℃。

    1.3 病料中CAV的PCR檢測

    根據(jù)GenBank中參考序列NX15091(KY486150)設(shè)計1對PCR引物,CIAV All Seq F(5′-GCATTCCGAGTGGTTACTATT-3′)/CIAV All Seq R(5′-GATTGTGCGGTAAAAGCATTT-3′)覆蓋CAV全基因組序列。PCR產(chǎn)物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像進(jìn)行分析,并用Omega DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

    1.4 CAV全基因測序及序列分析

    將PCR擴(kuò)增的CAV全基因片段亞克隆到pTOPO-Blunt T 載體,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽性克隆送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,從而獲得分離毒株的全基因組序列。用MEGA 7軟件對CAV全基因組序列和VP1、VP2、VP3氨基酸序列進(jìn)行比對和分析,并構(gòu)建CAV分離株與GenBank中32個已發(fā)表同源性較高的CAV(見表1)全基因序列和VP1氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹。

    表1 參考株序列信息

    1.5 動物回歸試驗

    將陽性病料雞肝臟提取的DNA,通過PCR擴(kuò)增對禽腺病毒(FADV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生病病毒(REV)與馬立克氏病病毒(MDV)分別進(jìn)行檢驗[11]。選取其他病毒檢測為陰性,且含有符合強毒株特征的JZ2118毒株的雞肝用研磨儀進(jìn)行研磨,研磨后的勻漿4 000g離心5 min,取上清液,用0.22 μm濾器除菌過濾,分離出病毒液。

    將孵化的1日齡SPF雛雞分為2組,攻毒組(n=23)與對照組(n=10)。攻毒組每只胸肌注射100 μL(熒光定量檢測:1.15×109病毒拷貝數(shù))JZ2118毒株組織病毒液,對照組以同樣方式注射100 μL生理鹽水,每天觀察精神狀態(tài)及監(jiān)測肛溫體重。感染14 d后采集全血進(jìn)行血常規(guī)檢測并全部剖檢,測定肝組織CAV的病毒載量及胸腺組織與法氏囊組織的病理切片。

    1.6 病毒載量測定

    參照北京艾德萊DNA提取試劑盒說明書提取肝臟組織DNA。采用實時熒光定量PCR中絕對定量法檢測組織病毒載量,根據(jù)與JZ2118毒株序列設(shè)計引物Prime 2 FP P6D(5′-ACCACCTCAAGCGACTTC-3′)/Prime 2 RP P6D(5′-GCAGCCTCACACTATACG-3′),擴(kuò)增CAV基因組序列中長度為123 bp的核苷酸序列,用于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及待檢樣品的檢測。

    1.7 血常規(guī)檢測

    使用10% EDTA-Na2溶液作為全血的抗凝劑,按照全血與抗凝劑25∶1的比例采集全血,進(jìn)行血常規(guī)檢測。

    1.8 病理組織切片

    取胸腺與法氏囊,用4%的多聚甲醛固定液固定,進(jìn)行石蠟包埋與蘇木精-伊紅染色(HE染色),再進(jìn)行顯微觀察。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 CAV病原檢測

    通過PCR檢測,從收集的224份雞肝樣品中,共檢出18份CAV陽性病料(見圖1),CAV陽性率為8.04%。檢測的新CAV毒株使用格式PPYYXXX命名,其中PP是采樣位置,YYXXX是樣本來源的時間和順序,毒株命名依次為JZ2101~JZ2118。

    注:M為標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA Maker;1~18為CAV JZ2101-JZ2118基因條帶檢測;N為陰性對照;P為陽性對照。圖1 全長CAV基因組擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 CAV gene band test results

    2.2 CAV全基因組序列分析

    通過對18個CAV毒株全長基因序列的測序,基因片段的大小均為2 298 bp,與32個參考株的全基因組序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(見圖2),遺傳進(jìn)化樹可分為3個基因群,分別是JZ2101、JZ2103、JZ2104、JZ2106、JZ2107、JZ2109、JZ2116、JZ2118毒株與主要來自廣東、廣西的毒株被歸類于A組,JZ2102、JZ2108、JZ2110、JZ2112、JZ2113、JZ2114毒株與主要來自土耳其、天津的毒株被歸類于B組,JZ2105、JZ2111、JZ2115、JZ2117與主要來自山東、黑龍江的毒株被歸類于C組。國內(nèi)強毒株GD-103、GD-104及日本強毒株C368全部被歸類于A組,A組中毒株JZ2118、JZ2107與JZ2109與3株強毒株親緣關(guān)系最近,與3株強毒株的核苷酸序列同源性為98.9%~99.4%。

    圖2 CAV全基因組進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenic tree analysis of the CAV complete genome

    2.3 CAV的VP1、VP2、VP3序列分析

    根據(jù)GenBank獲得參考株與18個毒株的VP1、VP2、VP3核苷酸序列,18個毒株的VP1、VP2、VP3的核苷酸序列大小分別為1 350、651、366 bp,與參考序列相比未發(fā)現(xiàn)插入或缺失。18個毒株的VP1的同源性為96.1%~99.9%,VP2的同源性為98.9%~100%,VP3的同源性為99.7%~100%,VP2和VP3都非常保守,主要核苷酸突變發(fā)生在VP1蛋白的編碼區(qū)。

    用MEGA 7軟件對VP1、VP2與VP3蛋白的核苷酸序列進(jìn)行翻譯和比對,結(jié)果表明,18個毒株的VP1有36個氨基酸位點發(fā)生替換,VP2有4個氨基酸位點發(fā)生替換,VP3未發(fā)生氨基酸替換。VP1蛋白有15個位點的突變頻率較高,突變信息如表2所示,其他突變頻率較低的位點是F12L、P14A、V107E、G137V、A164S、W168C、L170V、M157L、D177H、N183S、G194V、K216R/T、G231E、D239A、V240I、Y242S、H246L、V436I、Y444S;VP2蛋白發(fā)生4個氨基酸替換,分別為E24G、N36D、F170Y、R205K,且均為JZ2101毒株的氨基酸替換。

    表2 新分離株的VP1蛋白中的主要氨基酸差異

    VP1氨基酸序列進(jìn)化樹(見圖3)也分為3個組群,JZ2101、JZ2103、JZ2104、JZ2106、JZ2107、JZ2109、JZ2116、JZ2118與主要來自廣東、廣西的毒株被歸類于A組,JZ2105、JZ2111、JZ2115、JZ2117與主要來自山東、黑龍江的毒株被歸類于C組,JZ2102、JZ2108、JZ2110、JZ2112、JZ2113、JZ2114與主要來自土耳其毒株被歸類于B組,分組結(jié)果幾乎與全基因序列的進(jìn)化樹相同,說明了CAV的遺傳進(jìn)化主要與VP1蛋白的氨基酸突變有關(guān)。VP1氨基酸序列進(jìn)化樹中的A組與C組分離毒株中氨基酸位點75V、89T、125L、139K、141Q、144E、394Q與國內(nèi)強毒株GD-103、GD104株及日本強毒株C368全部一樣,表明A組和C組中的毒株均符合強毒株特征。尤其A組中的分離毒株可能與這3株強毒株具有相似的致病性。

    圖3 CAV VP1氨基酸序列進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of CAV VP1 amino acid sequence

    2.4 JZ2118毒株的致病性分析

    1日齡SPF雛雞攻毒10 d后開始出現(xiàn)精神萎靡、羽毛蓬松、體重下降等臨床癥狀;在攻毒第11 d開始出現(xiàn)死亡,并出現(xiàn)肛溫先升高后下降的現(xiàn)象。在感染14 d后,攻毒組23只,死亡19只,僅4只存活,致死率高達(dá)82.6%,對照組全部存活(見圖4(a))。

    注:*表示具有顯著性差異(P<0.05),** 表示具有極顯著性差異(P<0.01)。圖4 對照組與攻毒組生存曲線、肛溫、體重、病毒載量的比較Fig.4 Comparation of the survival curve,temperature,body weight,viral load of liver tissueof the control group and the challenge group

    根據(jù)每日肛溫監(jiān)測,剛孵化的1日齡SPF雛雞肛溫在(39.21±0.56)℃左右,隨著日齡的增長肛溫逐漸上升,逐漸穩(wěn)定在41.5 ℃左右(見圖4(b)),而攻毒組的雞在死亡的前2 d肛溫會出現(xiàn)升高,升到42 ℃以上,甚至43 ℃以上;剛孵化的1日齡雛雞體重一般在(38.03±2.21)g,對照組雞的體重在2周內(nèi)不斷增加,2周后能達(dá)到100 g以上,而攻毒組雞的體重在感染10 d左右開始出現(xiàn)下降或增長緩慢(見圖4(c)),2周后體重降到70 g以下。

    通過熒光定量PCR獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ct=-3.327lgN+37.677,式中:Ct為閾值循環(huán)數(shù),N為病毒拷貝數(shù),相關(guān)系數(shù)R2=0.992,擴(kuò)增效率為99.8%,計算得出對照組每毫克肝組織的病毒拷貝數(shù)約為102,攻毒組每毫克肝組織病毒拷貝數(shù)約為107,對攻毒組與對照組每毫克肝組織病毒拷貝數(shù)的對數(shù)值用獨立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析(見圖4(d)),即兩組具有極顯著性差異(P<0.01)。

    由采集全血的血常規(guī)檢測結(jié)果(見表3)可知,對照組與攻毒組的白細(xì)胞(WBC)數(shù)目、紅細(xì)胞(RBC)數(shù)目、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、淋巴細(xì)胞數(shù)目(Lym)、中性粒細(xì)胞(Neu)數(shù)目、中性粒細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞(Lym)比例、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)數(shù)目通過獨立樣本t檢驗分析均具有極顯著性差異(P<0.01)。其中RBC數(shù)目、HGB、HCT與MCHC下降表明攻毒組出現(xiàn)了嚴(yán)重的貧血,WBC數(shù)目與Neu比例下降表明雞受到了病毒感染,Lym比例下降說明雞感染后對其造成了免疫缺陷,EOS數(shù)目下降說明雞發(fā)生了再生障礙性貧血。

    表3 血常規(guī)檢測結(jié)果

    通過對胸腺組織與法氏囊組織的病理切片的結(jié)果來看,圖5(a)中對照組胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)界限分明,皮質(zhì)有大量的淋巴細(xì)胞,而圖5(b)中攻毒組胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)的界限消失,皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重減少,且并伴有出血癥狀,胸腺結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重;圖5(c)中對照組的法氏囊濾泡與濾泡之間緊密相接,且濾泡內(nèi)有較多的淋巴細(xì)胞,而圖5(d)中攻毒組的法氏囊發(fā)生濾泡萎縮,濾泡之間間隙增大,且淋巴細(xì)胞數(shù)量減少,表明雛雞感染CAV后免疫系統(tǒng)被嚴(yán)重破壞,從而發(fā)生免疫抑制。

    圖5 感染14日雞的胸腺與法氏囊HE染色結(jié)果Fig.5 Results of thymus with bursal HE staining in chickens infected on 14 days

    3 討論

    有研究表明,VP1蛋白的第394位氨基酸是毒力的主要遺傳決定因素,谷氨酰胺(Q)和組氨酸(H)分別代表高和低致病性,以及毒力衰減的其他突變(75I、125I、139Q和144Q)[12]。其中18株CAV毒株的VP1蛋白的394位氨基酸均為谷氨酰胺(Q),且JZ2101、JZ2103、JZ2104、JZ2105、JZ2106、JZ2107、JZ2109、JZ2111、JZ2115、JZ2116、JZ2117、JZ2118都具有75V、89T、125L、141Q和144E的組合,表明都不具有減毒特征,且與已經(jīng)鑒定過為強毒株的AV1550株、GD-103株、GD-104株、C368株的第75、89、125、141、144氨基酸位點相同[13-14]。本研究中,荊州地區(qū)肉雞中CAV的感染率為8.04%,雖然低于近年來其他地區(qū)調(diào)查的感染率12.5%~25.69%,但在18株的CAV毒株中有12株符合強毒株特征,強毒株占66.7%,說明荊州地區(qū)流行CAV毒株多為強毒株。而且其中JZ2118毒株經(jīng)過動物回歸試驗也證明具有較強的致病性,推測另外11株可能具有同樣較強的致病性。

    TODD等[15]研究表明,如果VP1蛋白位點第75、89、125、141和144位同時發(fā)生氨基酸突變,即使在第394位氨基酸為谷氨酰胺(Q),雞感染CAV后也不會導(dǎo)致貧血、白骨髓和胸腺萎縮。本研究中JZ2102、JZ2108、JZ2110、JZ2112、JZ2113、JZ2114毒株都發(fā)生75I、125I、139Q和144Q的突變。TODD等[16]將Cuxhaven-1 CAV在173次細(xì)胞培養(yǎng)傳代后獲得克隆的減毒CAV分離物,在幼雞傳代10次后恢復(fù)了致病性,其中VP1蛋白的第287位氨基酸從丙氨酸(A)變?yōu)樘於彼?D)。而JZ2102、JZ2108、JZ2110、JZ2112、JZ2113、JZ2114毒株的第287位氨基酸均為丙氨酸(A),推測這6株毒株很可能為減毒毒株。

    王林等[17]研究表明,1日齡與7日齡的SPF雞比21日齡更容易感染CAV,且肌肉注射比口服的致病性更強。本研究中,1日齡肌肉注射的攻毒方法致死率達(dá)到82.6%,在感染的10~14 d達(dá)到致病的關(guān)鍵期,從各項臨床癥狀及相關(guān)病理變化體現(xiàn)了分離株JZ2118的高致病性。本研究進(jìn)一步了解了CAV的遺傳進(jìn)化及分子特征與致病性之間的聯(lián)系,驗證符合強毒株特征的JZ2118毒株的確具有高致病性。后續(xù)研究需要對CAV作進(jìn)一步的分子和病原特征分析,以找出它們之間的變異,這將有助于相關(guān)疫苗的研發(fā)以及制定適當(dāng)?shù)目刂撇呗?,防止家禽業(yè)的損失。

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