基于cGAS-STING 通路探討知母皂苷元對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷保護(hù)作用

汪洋，張輝，伍冬冬，王靜，吳秋歌

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450052

急性肺損傷是由諸多致病因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)而引發(fā)的急性低氧性呼吸功能不全，致病因素包括感染、膠原血管病、藥物作用、誤吸、休克、急性嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎、免疫介導(dǎo)的肺出血和血管炎以及放射性肺炎等[1]。早期臨床表現(xiàn)為急性進(jìn)行性加重的呼吸困難、呼吸窘迫、難治性低氧血癥和非心源性肺水腫，進(jìn)一步發(fā)展至嚴(yán)重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征，可導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡。急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，比較公認(rèn)的是肺內(nèi)炎癥因子大量釋放與激活使肺內(nèi)炎癥反應(yīng)失控[2]。目前臨床上尚無急性肺損傷的特效治療手段，常規(guī)治療主要是通過肺保護(hù)性通氣策略、氣道壓力釋放通氣（APRV）、高頻振蕩通氣（HFOV）、體外膜肺氧合（ECMO）和藥物干預(yù)如糖皮質(zhì)激素激素、β2受體激動(dòng)劑、他汀類藥物、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等限制其發(fā)展，減少肺內(nèi)皮和上皮屏障的炎癥[3-4]。另外，一些中藥和天然活性成分通過抗炎和抗氧化應(yīng)激作用在防治急性肺損傷中療效顯著[5-8]，且因天然活性成分藥效明確、不良反應(yīng)低，具有較好的臨床應(yīng)用前景。知母皂苷元是從中藥知母中分離得到的有效成分，研究表明知母皂苷元具有抗腫瘤、抗阿爾茨海默病、抗凝血、降血糖、調(diào)血脂、抗炎等多種藥理活性[9]。鐘艷梅等[10]發(fā)現(xiàn)知母皂苷元可通過下調(diào)核因子-κB（NF-κB）-誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）-一氧化氮（NO）通路抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中炎癥因子的釋放發(fā)揮保護(hù)作用。鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激因子（STING）信號(hào)通路的激活在免疫炎癥應(yīng)答中的作用受到廣泛關(guān)注。

本研究基于cGAS-STING 通路探討知母皂苷元對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用，為防治急性肺損傷藥物的研究提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)昆明小鼠60 只（雌性，6 周齡，體質(zhì)量18～22 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），許可證號(hào)SCXK（陜）2020-001。分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開展實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2020-KY-125）。

1.2 材料與儀器

1.2.1 藥物與試劑 知母皂苷元（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，成都普瑞法公司，批號(hào)BP1257）；LPS（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)JP0284）；地塞米松磷酸鈉注射液（辰欣藥業(yè)公司，規(guī)格1 mL∶5 mg，批號(hào)1112136114）；小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（批號(hào)EEL-M0044）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)E-EL-M0049）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)E-BC-K318-M）、SDS-PAGE 凝膠試劑盒（批號(hào)E-IR-R305）均購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物公司；兔抗小鼠cGAS 抗體（批號(hào)ab252416）、兔抗小鼠STING 抗體（批號(hào)ab189430）均購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)A21020）購(gòu)于武漢亞科因公司。

1.2.2 儀器 ME54E 型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；DHG-9146A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏公司）；BX 53 OLYMPUS 顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；MY-10 電動(dòng)組織研磨器（上海凈信公司）；M1324R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（深圳市瑞沃德公司）；Infinite200 多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）；通用型電泳儀（美國(guó)伯樂公司）；Amersham Imager 600 凝膠成像分析儀（美國(guó)通用電氣公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、給藥與造模

60 只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、地塞米松組及知母皂苷元50、100、200 mg/kg 組。知母皂苷元50、100、200 mg/kg 組小鼠ig 給予相應(yīng)劑量的知母皂苷元溶液，地塞米松組小鼠ip 地塞米松磷酸鈉注射液0.5 mg/kg，對(duì)照組和模型組ig 等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥1 h 后，其余各組小鼠除對(duì)照組外均ip 10 mg/kg LPS 溶液復(fù)制小鼠急性肺損傷模型[11]。

2.2 肺組織濕/干質(zhì)量比（W/D）測(cè)定

造模后6 h 取各組小鼠左肺組織，除去血漬后濾紙吸干，精密稱量，即為濕質(zhì)量；恒溫干燥箱中放置24 h（80 ℃），烘干后稱量，即為干質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠肺組織W/D。

2.3 蘇木精–伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理學(xué)

造模后6 h 取各組小鼠的肺組織，4%多聚甲醛固定，脫水、浸蠟、包埋、切片，脫蠟后進(jìn)行HE 染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.4 血清中IL-6、TNF-α 水平測(cè)定

造模后6 h 摘小鼠眼球取全血，3 500 r/min 離心10 min（4 ℃），分離上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平。

2.5 肺組織中cGAS、STING 的蛋白表達(dá)測(cè)定

造模后6 h 取各組小鼠的肺組織，加入蛋白裂解液機(jī)械研磨，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。樣品置于95 ℃水浴鍋煮沸10 min，12 000 r/min 離心10 min（4 ℃），取上清上樣后依次進(jìn)行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、1 脫脂牛奶封閉，再分別加入cGAS、STING、β-actin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)中成像，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白與β-actin 的灰度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，采用LSD 法進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 知母皂苷元對(duì)小鼠肺組織W/D 的影響

與模型組相比，地塞米松組及知母皂苷元200 mg/kg 組小鼠肺組織W/D 顯著降低（P＜0.05）；知母皂苷元50、100 mg/kg 組小鼠肺組織W/D 呈降低趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 知母皂苷元對(duì)小鼠肺組織W/D 的影響（，n=10）Table 1 Effects of sarsasapogenin on lung W/D in mice(,n=10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

3.2 知母皂苷元對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)的影響

對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡壁無水腫、增厚、液體滲出等炎癥表現(xiàn)，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肺泡壁明顯增厚，有水腫、出血及少許液體滲出現(xiàn)象，且有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。地塞米松組和知母皂苷元各劑量組小鼠肺泡水腫、出血、滲出程度較模型組較輕，損傷情況均有所改善，見圖1。

圖1 知母皂苷元對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)的影響（×200）Fig.1 Effects of sarsasapogenin on histopathological changes of lung in mice (× 200)

3.3 知母皂苷元對(duì)小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影響

與模型組相比，地塞米松組和知母皂苷元各劑量組小鼠血清中的IL-6 和TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量相關(guān)性，見表2。

表2 知母皂苷元對(duì)小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影響（，n=10）Table 2 Effects of sarsasapogenin on the serum levels of IL-6 and TNF-α in mice (,n=10)

表2 知母皂苷元對(duì)小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平的影響（，n=10）Table 2 Effects of sarsasapogenin on the serum levels of IL-6 and TNF-α in mice (,n=10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

3.4 知母皂苷元對(duì)小鼠肺組織中cGAS、STING 蛋白表達(dá)的影響

與模型組相比，地塞米松組小鼠肺組織中cGAS、STING 的蛋白表達(dá)均有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；知母皂苷元各劑量組小鼠肺組織中STING 的蛋白表達(dá)均顯著降低，知母皂苷元100、200 mg/kg 組小鼠肺組織中cGAS 的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），下降趨勢(shì)呈劑量相關(guān)性，結(jié)果見圖2、表3。

圖2 知母皂苷元對(duì)小鼠肺組織中cGAS、STING 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice

表3 知母皂苷元對(duì)小鼠血清中肺組織中cGAS、STING 蛋白表達(dá)的影響（，n=10）Table 3 Effects of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice(,n=10)

表3 知母皂苷元對(duì)小鼠血清中肺組織中cGAS、STING 蛋白表達(dá)的影響（，n=10）Table 3 Effects of sarsasapogenin on the protein expression of cGAS and STING in the lung tissue of mice(,n=10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜ 0.05 vs model group

4 討論

急性肺損傷是臨床常見的急危重癥，其病因極其復(fù)雜，一般分為肺內(nèi)因素和肺外因素2 類，包括直接和間接導(dǎo)致肺損傷的疾病。急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，目前認(rèn)可度較高的發(fā)病機(jī)制是過度的炎癥反應(yīng)，促炎因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）是臨床上可能預(yù)測(cè)急性肺損傷發(fā)病率和死亡率的生物標(biāo)志物[1]。其中，IL-6 是IL 家族的核心成員，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、急性期反應(yīng)、免疫應(yīng)答和造血功能的作用。促炎因子TNF-α 能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，也能通過結(jié)合多種活性物質(zhì)對(duì)組織造成間接損傷[12]，因此本研究選取IL-6 和TNF-α 作為評(píng)估急性肺損傷的檢測(cè)指標(biāo)。

急性肺損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型多采用LPS 誘導(dǎo)，該模型主要用于模擬臨床中革蘭陰性菌和感染性休克所致的肺損傷[13]。LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞外壁的組成成分，注射LPS 會(huì)損傷機(jī)體毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成血管壁通透性增加、細(xì)胞間質(zhì)水腫，引起機(jī)體急性肺損傷，從而增加了炎性細(xì)胞因子的釋放，誘發(fā)瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征[14]。本研究采用ip LPS 復(fù)制急性肺損傷小鼠模型，模型組小鼠注射LPS 后肺組織W/D 顯著升高，TNF-α、IL-6 水平顯著增加，肺組織有明顯病理?yè)p傷，表明急性肺損傷小鼠模型建立成功。

cGAS-STING 通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬過程，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，阻斷cGAS-STING 通路可抑制炎癥反應(yīng)、減輕組織損傷，激活cGAS-STING通路可發(fā)揮促炎、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平顯著升高，肺組織中cGAS、STING 的蛋白表達(dá)顯著升高，提示急性肺損傷小鼠的炎癥反應(yīng)可能與激活cGAS-STING 通路有關(guān)。經(jīng)知母皂苷元預(yù)處理后，急性肺損傷小鼠TNF-α、IL-6 水平均顯著降低，肺組織中cGAS、STING 的蛋白表達(dá)亦顯著降低，表明知母皂苷元可通過抑制cGAS 和STING，減少促炎因子的釋放，最終減輕LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷。研究表明，cGAS 通過識(shí)別、結(jié)合細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的雙鏈DNA 進(jìn)而激活STING，在高爾基體上招募并激活TANK 結(jié)合激酶1（TBK-1），從而直接激活NF-κB 通路，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。TBK-1 也可招募并磷酸化下游干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），促進(jìn)干擾素相關(guān)基因的表達(dá)，增加Ⅰ型干擾素的合成，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫[16]。本研究中知母皂苷元可能通過激活cGAS-STING 通路，進(jìn)而激活NF-κB 通路，促進(jìn)TNF-α、IL-6 的產(chǎn)生，也可能通過磷酸化IRF3，促進(jìn)干擾素的合成。但cGAS-STING 的調(diào)控機(jī)制較復(fù)雜，具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

一些單味中藥、中藥復(fù)方及天然活性成分如酚類、黃酮類、萜類、皂苷類、生物堿類等具有顯著的防治急性肺損傷作用，其作用機(jī)制與抑制炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等相關(guān)[17]。研究表明，皂苷類成分如甘草酸[18]、人參皂苷[19]、遠(yuǎn)志皂苷元[20]、柴胡皂苷[21]可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）、NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）、NOD 樣蛋白3（NLRP3）通路發(fā)揮抗炎抗氧化作用從而對(duì)LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本研究建立了LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型，發(fā)現(xiàn)知母皂苷元可通過抑制cGAS-STING 通路，減少TNF-α、IL-6 的釋放，進(jìn)而改善肺組織病理?yè)p傷，對(duì)急性肺損傷模型小鼠具有一定保護(hù)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突