不同產(chǎn)地白術(shù)飲片HPLC指紋圖譜研究

侯曉杰 鄭英 李瑋 張建鋒

【摘 要】 目的：通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地白術(shù)飲片研究，建立白術(shù)飲片高效液相指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱：Agilent C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫（0～10 min，50%～70%A；10～20 min，70%～80%A，20～30 min；80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），流速為1.0mL·min-1，柱溫為25 ℃，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm，進(jìn)樣量20 μL。以2號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為參照， 記錄12批次白術(shù)飲片的HPLC圖譜，然后將其導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)2012版》（國(guó)家藥典委員會(huì)），采用指紋圖軟件確定共有峰。結(jié)果：建立12批白術(shù)飲片的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定12個(gè)共有峰，相似度均大于0.90。經(jīng)驗(yàn)證，與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：研究建立HPLC指紋圖譜可用于白術(shù)飲片質(zhì)量控制方法，同時(shí)也為白術(shù)飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 白術(shù)飲片；高效液相色譜法； 指紋圖譜；白術(shù)內(nèi)脂

【中圖分類號(hào)】R284.1? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A? ? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）14-0044-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202314011

Abstract：Objective To establish a high performance liquid fingerprint of Atractylodes macrocephala.Methods HPLC method was used. Column： Agilent C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm），mobile phase： acetonitrile-water，gradient elution （0-10 min，50%-70% A;10-20 min，70%-80% A） ，20～30 min; 80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），the flow rate is 1.0 mL·min-1，the column temperature is 25 °C，atractylenolide I，atractyl lactone III The detection wavelength was 220 nm，the atractylenolide II detection wavelength was 276 nm，and the injection volume was 20 μL. Taking the bergenin as a reference，the HPLC chromatogram of 12 batches of decoction pieces was recorded，and then introduced into the Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation Software System 2012 Edition （National Pharmacopoeia Commission） to determine the common peak.Results There were 12 common peaks in the HPLC fingerprints of 12 batches of Atractylodes macrocephala. The similarity was greater than 0.90. It has been verified that it has good consistency with the control fingerprint.Conclusion The HPLC fingerprint of this study can be used to control the quality control of Atractylodes macrocephala L.，and also provide reference for the quality evaluation of Atractylodes Rhizome.

Keywords：Atractylodes Macrocephala; High Performance Liquid Chromatography; Fingerprint; Atractylodes

白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖。臨床上白術(shù)炮制品主要有麩炒白術(shù)、土炒白術(shù)和焦白術(shù)等飲片，麩炒白術(shù)表面焦黃色或黃棕色，偶見(jiàn)焦斑，略有焦香氣，具有緩和燥性、健脾消脹之功效，用于脾胃不和、運(yùn)化失常、倦怠乏力和表虛自汗等癥狀［2-4］；土炒白術(shù)表面杏黃土色，附有細(xì)土末，有土香氣，具有補(bǔ)脾止瀉之功效，用于脾虛食少、泄瀉便溏、胎動(dòng)不安等癥狀［5-7］；焦白術(shù)不規(guī)則厚片，表面焦褐色，斷面焦黃色，質(zhì)松脆，略有焦香氣，焦白術(shù)具有補(bǔ)氣健脾、澀腸止瀉的作用，主要用于慢性寒性腹瀉［8-10］。因此，課題對(duì)不同區(qū)域白術(shù)飲片開(kāi)展研究，建立指紋圖譜共有模式，用于白術(shù)飲片質(zhì)量控制，為白術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate3000高效液相色譜儀（賽默飛）；JT5003千分之一電子天平（余姚市金諾天平儀器公司）；ME204E萬(wàn)分之一電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），AUW220D十萬(wàn)分之一電子分析天平（蘇州島津儀器有限公司）；LDP-150高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）；DZ-2BC真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)：111975-201501）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：111976-201501）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品（批號(hào)：111978-201501）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，以上對(duì)照品均供含量檢測(cè)用。甲醇（色譜純，天津科密歐公司）；乙腈（色譜純，天津科密歐公司）；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

收集不同產(chǎn)地的白術(shù)飲片，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室魏升華教授鑒定為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.經(jīng)加工制成的飲片。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫（0～10 min，50%-70%A；10～20 min，70%～80%A，20～30 min；80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），流速為1.0 mL.min-1，柱溫為25 ℃，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品適量，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度濃度分別為1.20 μg/mL、4.40 μg/mL、2.22 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱定白術(shù)飲片粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5 g，置具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）40 min，取出，放置至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取白術(shù)藥材粉末依照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，以2號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，其結(jié)果分別為1.3%和1.9%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取白術(shù)藥材粉末6份，并依照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品平行溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，以2號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，其結(jié)果分別為1.7%和2.2%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白術(shù)藥材粉末依照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，以2號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰，記錄共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積，其結(jié)果分別為1.6%和2.1%，表明24 h內(nèi)樣品溶液的成分穩(wěn)定。

2.4 白術(shù)HPLC指紋圖譜的建立及技術(shù)參數(shù)

2.4.1 白術(shù)HPLC指紋圖譜的比較和分析 采集于我國(guó)不同地區(qū)的12批白術(shù)飲片，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄HPLC指紋圖譜，然后將12批飲片的指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件系統(tǒng)2012版（國(guó)家藥典委員會(huì)）。進(jìn)行色譜峰匹配，并生成對(duì)照指紋圖譜，以建立的共有模式為參照?qǐng)D譜計(jì)算1～12批樣品的相似度。

2.4.2 色譜峰指認(rèn) 對(duì)不同的供試品色譜圖的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，本試驗(yàn)標(biāo)定了12個(gè)指紋圖譜中的共有峰，如圖1所示，與混合對(duì)照品的指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)了2號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、5號(hào)峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、8號(hào)峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。從相似度數(shù)據(jù)（表2）和圖2中可以看出不同地區(qū)的白術(shù)飲片相似度在0.963～0.999之間，均大于0.9，說(shuō)明不同產(chǎn)地的白術(shù)所含化學(xué)成分大致相同。

2.4.3 白術(shù)參照峰的標(biāo)定 通過(guò)對(duì)12批不同產(chǎn)地白術(shù)飲片指紋圖譜的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，確定了12個(gè)色譜峰為共有峰，并選擇了2號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰。在白術(shù)藥材指紋圖譜中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ保留時(shí)間適宜，峰形較穩(wěn)定，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ也是白術(shù)藥材的主要成分之一，并且在所有白術(shù)飲片中為共有峰，因此選定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為參照峰。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本試驗(yàn)利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)白術(shù)樣品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，經(jīng)波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)白術(shù)樣品溶液分別在243 nm，292 nm，376 nm 3個(gè)波長(zhǎng)處有吸收。并利用高效液相色譜液對(duì)各波長(zhǎng)進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm時(shí)，基線較穩(wěn)定，呈現(xiàn)的吸收峰較多，峰面積相對(duì)較大，分離度好，峰形對(duì)稱。本試驗(yàn)通過(guò)全波長(zhǎng)掃描得到，樣品在3個(gè)波長(zhǎng)下有吸收，分別對(duì)3個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行比較，最終選擇243 nm作為白術(shù)指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 洗脫方式的選擇 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇等度洗脫和梯度洗脫兩種方式進(jìn)行研究， 當(dāng)使用等度洗脫，色譜峰在分離過(guò)程中分離度不理想，所以考慮使用梯度洗脫，以色譜峰的分離度和保留時(shí)間為指標(biāo)，確定最終洗脫方式為梯度洗脫。

3.3 提取溶劑的選擇 取白術(shù)粉末約1.0 g，精密稱定，分別以甲醇和乙醇進(jìn)行超聲提取。以考察甲醇、乙醇作為提取的溶劑對(duì)白術(shù)樣品溶液的指紋圖譜，結(jié)果兩種提取溶劑對(duì)白術(shù)樣品差異不明顯，且乙醇毒性較小，故本試驗(yàn)選擇用乙醇進(jìn)行提取。

3.4 提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇 本試驗(yàn)分別以100%、80%、60%乙醇作為溶劑考察對(duì)白術(shù)指紋圖譜的影響。顯示用100%乙醇作提取溶劑時(shí)，峰分離度較好，吸收較大，信息量大，故本試驗(yàn)選擇用100%乙醇進(jìn)行提取。

3.5 料液比的選擇 本試驗(yàn)對(duì)比不同料液比的提取溶劑對(duì)白術(shù)進(jìn)行提取，分別考察料液比為1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10對(duì)白術(shù)樣品指紋圖譜的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，峰分離度較好，吸收較大，信息量大，故選擇1∶20為最佳料液比。

3.6 提取時(shí)間的選擇 為了得到較好的提取效果，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料［7-8］，本試驗(yàn)分別考察超聲提取60 min、40 min、20 min對(duì)白術(shù)樣品的影響，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)峰分離度較好，吸收較大，信息量大，本試驗(yàn)以超聲40 min來(lái)進(jìn)行提取。

3.7 提取方法的選擇 以文獻(xiàn)中查閱的方法為依據(jù)［9-10］，分別進(jìn)行回流提取、超聲提取兩種方法考察，分別比較兩種提取方法下指紋圖譜，結(jié)果顯示，兩種提取方法對(duì)白術(shù)指紋圖譜色譜圖無(wú)明顯差異，為了操作方便，節(jié)約時(shí)間故選擇超聲提取。在研究白術(shù)指紋圖譜提取方法時(shí)，分別從樣品提取方法、提取溶劑、溶劑比例、提取時(shí)間進(jìn)行了考察，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定提取方法為加入100%乙醇20 mL超聲40 min。

3.8 指紋圖譜結(jié)果分析 通過(guò)建立白術(shù)飲片指紋圖譜，對(duì)12批白術(shù)飲片指紋圖譜進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)白術(shù)飲片HPLC共有峰的相對(duì)峰面積和共有保留時(shí)間具有較好穩(wěn)定性，12批飲片相似度均大于0.90，說(shuō)明雖然產(chǎn)地不同，生長(zhǎng)環(huán)境多樣化，但是白術(shù)的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

綜上，研究根據(jù)市場(chǎng)調(diào)研情況，對(duì)全國(guó)白術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)分別采集樣品進(jìn)行研究，確保研究樣品具有道地性、真實(shí)性和代表性，全面系統(tǒng)考察了檢測(cè)波長(zhǎng)、洗脫方式、提取溶劑、提取時(shí)間和料液比等條件，保證建立的方法較好的適用性和科學(xué)性。通過(guò)HPLC法對(duì)全國(guó)不同區(qū)域白術(shù)飲片進(jìn)行研究，建立白術(shù)飲片指紋圖譜研究方法，采用指紋圖譜軟件標(biāo)定12個(gè)共有峰，并選擇2號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ作為參照峰，記錄12批次白術(shù)飲片的HPLC圖譜，其相似度均大于0.90，說(shuō)明該方法具有較好的專屬性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和可控性，可作為白術(shù)種質(zhì)資源、開(kāi)發(fā)應(yīng)用、加工方法和飲片標(biāo)準(zhǔn)等研究提供研究基礎(chǔ)和技術(shù)方法，并能更加系統(tǒng)全面為白術(shù)相關(guān)的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2022-11-05 編輯：陶希睿）