艱難梭菌疫苗臨床試驗(yàn)的研究現(xiàn)狀及挑戰(zhàn)

陶薇，傅婷 綜述，洪艷 審校

杭州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生物工程學(xué)院，浙江杭州310013

艱難梭菌（Clostridiodes difficile，C.difficile），即難辨梭狀芽孢桿菌，是一種厭氧生長的革蘭陽性梭狀產(chǎn)毒芽孢桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境、動(dòng)物和人的糞便中，其芽孢對(duì)高溫、強(qiáng)酸、抗生素和輻射等均具有較強(qiáng)的抵抗力［1］。艱難梭菌是醫(yī)院抗生素相關(guān)腹瀉（antibiotic-associated diarrhea，ADD）的主要病因［2-3］。當(dāng)個(gè)體腸道正常菌群平衡被抗生素破壞時(shí)，會(huì)造成艱難梭菌感染（C.difficileinfection，CDI）。艱難梭菌致病性菌株主要產(chǎn)生兩種同源性糖基化毒素，艱難梭菌毒素A（C.difficiletoxin A，TcdA）和艱難梭菌毒素B（C.difficiletoxin B，TcdB），一些高致病菌株還會(huì)產(chǎn)生二元毒素（binary toxin），又稱艱難梭菌轉(zhuǎn)移酶（C.difficiletransferase，CDT），會(huì)造成從腹瀉到高致死的中毒型巨結(jié)腸等癥狀［4-5］。自2003 年，由于艱難梭菌強(qiáng)毒力株核糖體型027（ribotype 027，RT027）的出現(xiàn)，CDI 的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率及死亡率在全球范圍內(nèi)均大幅上升［6-7］。在北美、歐洲等國家均出現(xiàn)艱難梭菌高毒力株暴發(fā)流行。在歐洲，根據(jù)歐洲疾病預(yù)防和控制中心（EuropeanCentreforDiseasePreventionandControl，ECDC）對(duì)醫(yī)療保健相關(guān)感染的調(diào)查，2011—2012年期間，歐洲CDI 病例數(shù)為123 997 例［95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）：61 018 ~ 284 857 例］［8-9］。自2016 年1 月，ECDC 開始收集歐洲急診醫(yī)院CDI發(fā)病率的監(jiān)測數(shù)據(jù)。作為ECDC監(jiān)測數(shù)據(jù)的一部分，來自20 個(gè)國家的556 家醫(yī)院共報(bào)告了7 711 例CDI 病例［10］。而美國CDI 的感染率更高。美國疾病預(yù)防控制中心2019年抗生素耐藥報(bào)告顯示，美國2017年艱難梭菌感染病例數(shù)為223 900，其中15% ~ 35%的CDI患者有1次或多次反復(fù)感染，死亡病例數(shù)為12 800［11］。亞洲多數(shù)國家也出現(xiàn)了RT027 型菌株。2014 年，中國報(bào)道了首例RT027 型菌株的臨床感染病例［7，12］。但目前RT027型菌株在亞洲國家并不常見［13］。鑒于CDI對(duì)患者、醫(yī)療機(jī)構(gòu)和社會(huì)造成的巨大疾病負(fù)擔(dān)，預(yù)防性疫苗的研發(fā)尤為重要。國內(nèi)外對(duì)艱難梭菌疫苗的研究方案中，主要以TcdA和TcdB作為靶抗原［14-17］；此外還有TcdA、TcdB 和CDT 的聯(lián)合疫苗研究方案，非產(chǎn)毒艱難梭菌腸道上皮定植和黏附，以及艱難梭菌鞭毛帽蛋白、表面多糖和脂磷壁酸等作為疫苗的候選方案［18-22］。迄今尚無獲得使用許可的艱難梭菌疫苗，本文對(duì)艱難梭菌疫苗臨床試驗(yàn)的研究現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)作一綜述。

目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的候選疫苗主要為TcdA和TcdB 相關(guān)疫苗。TcdA 和TcdB 是艱難梭菌重要的致病物質(zhì)。它們通過糖基化修飾引起結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)Rho 蛋白家族鳥苷三磷酸酶（GTPases）失活，改變結(jié)腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和破壞上皮黏膜屏障，并誘發(fā)強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)［23-24］。既往研究表明，患者抗毒素抗體水平與CDI復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)［25］。因此，TcdA和TcdB被作為艱難梭菌主要的疫苗候選抗原。目前，賽諾菲巴斯德、輝瑞、Valneva、默克和Synthetic Biologics 5家藥企均有TcdA 和TcdB 相關(guān)疫苗投入臨床試驗(yàn)。此外其他疫苗方案的生物制品也投入臨床試驗(yàn)，如Takeda／Shire和葛蘭素史克。以下逐一對(duì)這些處于臨床試驗(yàn)的艱難梭菌疫苗進(jìn)行介紹（見表1）。

表1 艱難梭菌候選疫苗臨床試驗(yàn)階段研究現(xiàn)狀Tab.1 Research status of C.difficile candidate vaccine in clinical trial stage

1 Cdiffense

Cdiffense 是賽諾菲巴斯德研制的一種二價(jià)類毒素疫苗。采用傳統(tǒng)方法，從天然高毒素艱難梭菌菌株VP110463 中純化TcdA 和TcdB，經(jīng)甲醛處理脫去其毒性后，以氫氧化鋁作為佐劑，制備二價(jià)類毒素疫苗。在已報(bào)道的臨床Ⅱ期試驗(yàn)中（2011年6月—2013 年6月），40~64歲患者接種100μg二價(jià)類毒素疫苗，免疫3次（0、7和30 d）后，約90%檢測出高效價(jià)中和抗體；老年患者（65~75歲）在第180天進(jìn)行第4次免疫后，60%抗體陰性患者陽轉(zhuǎn)，中和抗體陽性率增加至90%［26］；但臨床Ⅲ期試驗(yàn)中期報(bào)告顯示，該疫苗不能完成預(yù)防原發(fā)CDI的預(yù)期目標(biāo)，終止在臨床Ⅲ期試驗(yàn)［27］。

2 PF-06425090

與賽諾菲巴斯德二價(jià)類毒素疫苗Cdiffense 相比，輝瑞PF-06425090 疫苗采用基因工程技術(shù)構(gòu)建TcdA和TcdB表達(dá)載體，并通過缺乏TcdA和TcdB基因的非孢子化艱難梭菌進(jìn)行表達(dá)。該毒素同時(shí)采用基因修飾和化學(xué)法脫毒，以氫氧化鋁作為佐劑［28］。2012年9月—2014年1月，192名50~85歲美國健康成人參與臨床Ⅰ期試驗(yàn)。在第2次免疫后出現(xiàn)TcdA和TcdB 中和抗體，第7 個(gè)月產(chǎn)生預(yù)期濃度的TcdA和TcdB 中和抗體，類毒素組抗體滴度高于佐劑組。50~64與65~85歲組免疫效果相當(dāng)。常見的不良反應(yīng)為接種部位疼痛、頭疼和疲勞［29］。2015 年7 月—2017 年3 月，對(duì)855 名年齡在65 ~ 85 歲之間的美國健康成人進(jìn)行疫苗臨床Ⅱ期試驗(yàn)，比較不同的接種劑量和不同免疫周期對(duì)TcdA 和TcdB 中和抗體的影響。臨床Ⅱ期試驗(yàn)證明，該疫苗對(duì)65~85 歲健康美國成年人安全性、耐受性好，免疫原性強(qiáng)。200μg免疫劑量和月方案（0、1 和6 月）組產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)更高［30］。2016 年2 月—2017 年2 月，該疫苗在日本進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗(yàn)，也獲得預(yù)期結(jié)果［31］。在臨床Ⅲ期試驗(yàn)中（2017年3月—2021年12月），17 571名年齡≥50 歲健康成人參與，截至2022 年3 月1 日，基于次要終點(diǎn)，該疫苗在縮短病程和減輕疾病嚴(yán)重程度方面具有強(qiáng)大的潛在效應(yīng)。

3 Bezlotoxumab

Bezlotoxumab 是由美國默克制藥公司研發(fā)的人源化TcdB 單克隆抗體（MK-6072），用于預(yù)防艱難梭菌復(fù)發(fā)感染［32］，目前已經(jīng)完成臨床Ⅲ期試驗(yàn)［33］。近期，JOHNSON 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用Bezlotoxumab或聯(lián)合actoxumab（KM-3415）均能有效降低B1 型艱難梭菌的復(fù)發(fā)率和死亡率。

4 VLA84疫苗

與類毒素疫苗不同，Valneva Austria VLA84 疫苗是一種含有TcdA 和TcdB 受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）的嵌合蛋白，該疫苗可在異源表達(dá)系統(tǒng)中制備，無需培養(yǎng)艱難梭菌。在臨床Ⅰ期試驗(yàn)（2010 年12 月— 2013 年5 月）中，佐劑對(duì)疫苗免疫原性的影響無差異，抗體能夠中和VPI10463 產(chǎn)生的2 種毒素的活性［35］。目前該疫苗已完成臨床Ⅱ期試驗(yàn)。

5 SYN-004（Ribaxamase）

SYN-004（Ribaxamase）是Synthetic Biologics 研發(fā)的第二代口服藥β-內(nèi)酰胺酶，旨在降解排泄至胃腸道的靜脈注射β-內(nèi)酰胺類抗生素，從而保護(hù)腸道微生物群，預(yù)防原發(fā)性艱難梭菌感染和抗生素相關(guān)性腹瀉。第一代口服藥P1A，主要是一種青霉素酶，對(duì)頭孢菌素?zé)o活性［36］。SYN-004（Ribaxamase）擴(kuò)大了降解譜，包括頭孢菌素。臨床Ⅱ期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，412 名診斷為下呼吸道感染而接受靜脈注射頭孢曲松的住院患者中，安慰劑組艱難梭菌感染率為3.4%，而SYN-004（Ribaxamase）組為1%，證明降解抗生素可預(yù)防艱難梭菌感染［37］。

6 VP 20621

并非所有艱難梭菌均產(chǎn)生毒素，缺乏產(chǎn)生毒素基因的非產(chǎn)毒素艱難梭菌（non-toxigenicC.difficile，NTCD）也存在于醫(yī)院環(huán)境和住院患者中，患者通常無癥狀。既往研究表明，NTCD在患者和倉鼠的胃腸道定植后，可預(yù)防產(chǎn)毒菌株引起的CDI［38］。根據(jù)這一生物學(xué)特征，Takeda／Shire 研制了NTCD M3 菌株（NTCD-M3）孢子疫苗VP 20621。該疫苗目前已完成臨床Ⅱ期試驗(yàn)。經(jīng)甲硝唑或萬古霉素治療后的CDI患者口服VP 20621 疫苗后，NTCD-M3 腸道定殖率為69%，其中NTCD-M3 腸道定殖成功的86 例中僅2 例（2%）復(fù)發(fā)CDI，而NTCD-M3腸道定殖不成功的39例患者中12例（31%）復(fù)發(fā)CDI。表明NTCD-M3定植腸道，占據(jù)腸道的生存環(huán)境，可有效阻止致病艱難梭菌定植，顯著減少CDI復(fù)發(fā)［39］。

7 GSK2904545A

葛蘭素史克研制的一種含有艱難梭菌F2 抗原GSK2904545A（疫苗方案未公布）在2019 年8 月進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)，目前尚未結(jié)束臨床Ⅰ期試驗(yàn)。

8 挑戰(zhàn)

對(duì)艱難梭菌疫苗的研究已超過20 年，但目前仍無許可的人用疫苗。盡管艱難梭菌類毒素疫苗可中和毒素，預(yù)防毒素引發(fā)的腸道癥狀，但具有局限性。既往研究表明，類毒素疫苗不能防止艱難梭菌在胃腸道定殖［40］。此外，也不能阻止艱難梭菌產(chǎn)孢子，因此可能增加無癥狀感染者的數(shù)量［41］。含有RBD 嵌合蛋白疫苗VLA84 具有1 個(gè)明顯的缺陷，即缺乏位于毒素其他部位的中和抗原表位。此外，一些艱難梭菌菌株的變異，可能限制了該疫苗的有效免疫能力。在艱難梭菌毒素單克隆抗體Bezlotoxumab 的臨床Ⅲ期試驗(yàn)中顯著降低了復(fù)發(fā)／繼發(fā)性CDI 的風(fēng)險(xiǎn)［33］，預(yù)示著一個(gè)良好的研究方向，但同時(shí)也提出了一些問題：如何時(shí)接種該疫苗、如何在CDI 治療中發(fā)揮作用等，均需進(jìn)一步探討。鑒于目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的候選疫苗的試驗(yàn)范圍，在未來5 年內(nèi)獲得許可的艱難梭菌疫苗是可行的。但由于賽諾菲巴斯德類毒素疫苗Cdiffense 在臨床Ⅲ期試驗(yàn)中的失敗，提醒研發(fā)者需考慮改進(jìn)現(xiàn)有疫苗方案。