分型鑒別HPIV1、HPIV2及HPIV3多重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立及驗證

程子恩，劉芷寧，曹鵬程，趙亞齊，侯廣爭，劉琪琦，劉馨，3

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850；3.錦州醫(yī)科大學(xué)葫蘆島市中心醫(yī)院教學(xué)基地，遼寧錦州121001

20 世紀50 年代，Andrews 等將首次發(fā)現(xiàn)的與流感病毒、流行性腮腺炎病毒感染后癥狀相似，但與流感病毒抗原性不同，且具有獨特的生物學(xué)特性的一種病毒命名為人副流感病毒（human parainfluenza virus，HPIV）。HPIV 是引起兒童、老年人、免疫抑制患者、基礎(chǔ)營養(yǎng)狀況差的人群呼吸道感染的重要病原體，可導(dǎo)致多種呼吸道疾病，包括感冒、哮吼、支氣管炎、肺炎等［1-2］。在全球范圍內(nèi)，HPIV 是引起兒童呼吸道感染住院的第二大病原體，僅次于呼吸道合胞病毒，給各個國家?guī)砹藝乐氐募膊∝摀?dān)和公共衛(wèi)生風(fēng)險［3-5］。

根據(jù)HPIV的血清學(xué)及基因組特征，可分為HPIV1~4四種血清型。其中HPIV3是HPIV引起下呼吸道感染最常見的型別，然后依次為HPIV2、HPIV1和HPIV4［6-7］。HIPV4根據(jù)抗原性的不同又被分為4a和4b 2個血清亞型，引起的感染癥狀較輕微［8-9］。在5 歲以下兒童呼吸道感染病例中，至少有75% ~ 80%的兒童曾感染過HPIV［10］。成人12%呼吸道感染與HPIV有關(guān)［11］。雖然在結(jié)構(gòu)上不同亞型HPIV 表現(xiàn)出高度的相似性，但各亞型病毒所致的臨床特點和流行病學(xué)特征有顯著差異［12］。人體感染HPIV 后不會產(chǎn)生完全的保護性免疫，終生均可能發(fā)生再感染，而目前尚無治療和預(yù)防HPIV感染的特異性藥物和疫苗［13-14］。

本研究選擇HPIV1、HPIV2和HPIV3基因保守區(qū)域設(shè)計相應(yīng)的引物及探針，以人核糖核酸酶P（RNase P）為內(nèi)質(zhì)控，建立同時檢測HPIV1、HPIV2 和HPIV3的多重?zé)晒舛縍T-PCR 方法，并進行驗證，以期在快速檢測HPIV 感染的同時實現(xiàn)患者亞型的鑒別診斷，為臨床HPIV 感染患者分型治療提供診斷結(jié)果和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病毒、質(zhì)粒及標準品 甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒滅活樣本由軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所保存，新型冠狀病毒滅活樣本由該院微生物研究所提供；HPIV1、HPIV2、HPIV3 標準品購自廣州邦德盛生物科技有限公司；pUC57 載體由北京博邁德基因技術(shù)有限公司提供。

1.2臨床樣本 192 份咽拭子樣本由軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所保存并提供。本研究獲得倫理委員會批準。

1.3主要試劑及儀器 5×Neoscript RT Premix Multi-UNG（Probe qRT-PCR）試劑盒購自珠海寶銳生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 購自德國QIAGEN 公司；7500 Real-Time PCR System 購自美國Applied Biosystems 公司；核酸／蛋白質(zhì)熒光定量儀購自美國Unchained Labs 公司；新羿TD-1 微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)購自北京新羿生物科技有限公司。

1.4引物及探針設(shè)計 從國際公共數(shù)據(jù)庫中下載HPIV1（MT232426.1）、HPIV2（LC486598.1）和HPIV3（MN145876.1）基因序列，利用DNAman 軟件進行同源性分析，Primer express 3.0.1 軟件進行引物及探針設(shè)計，Primer-BLAST 軟件對設(shè)計的引物及探針進行特異性驗證。RNase P引物及探針的設(shè)計參考美國疾病控制與預(yù)防中心引物及探針［15］。引物和探針序列見表1，由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。

表1 引物及探針序列Tab.1 Primer and probe sequences

1.5重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建及核酸提取 將HPIV1、HPIV2、HPIV3 三種病毒和RNase P 的靶基因序列插入至pUC57 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，測序后，鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P，該過程由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，利用核酸／蛋白質(zhì)熒光定量儀測定質(zhì)粒濃度，按下式計算拷貝數(shù)。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒樣本核酸并于-80 ℃保存。

1.6多重?zé)晒舛縍T-PCR體系的優(yōu)化及標準曲線建立 多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系參照Neoscript RT Premix Multi-UNG（Probe qRT-PCR）試劑盒說明書配制，將HPIV1、HPIV2、HPIV3和RNase P的上下游引物及不同熒光標記的探針加入反應(yīng)體系，以相同濃度重組質(zhì)粒標準品為模板，采用方陣法優(yōu)化引物、探針濃度。用優(yōu)化好的引物及探針體系優(yōu)化退火溫度。將pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNaseP重組質(zhì)粒標準品原液均制備成4×108copies／mL，按1∶1∶1∶1 混勻后10 倍稀釋，選取5 個濃度（103~107copies／mL）質(zhì)粒標準品混合物為模板，按照優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件進行熒光PCR擴增，以濃度的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線。

1.7方法的驗證

1.7.1靈敏度 用新羿TD-1微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)對HPIV1、HPIV2、HPIV3核酸進行定量后的濃度分別為1.78×105、1.11×106、2.70×105copies／mL，用ddH2O將其分別稀釋至1 000、500、250 和100 copies／mL，利用建立的多重?zé)晒釸T-PCR方法進行擴增，每個濃度進行20 個重復(fù)，以95%檢出率的最低濃度確定為最低檢測限。

1.7.2特異性 用建立的多重?zé)晒舛縍T-PCR 方法對甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠狀病毒、HPIV1、HPIV2、HPIV3 核酸進行擴增，設(shè)ddH2O為陰性對照。

1.7.3精密度 以104、105、106copies／mL 的pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P重組質(zhì)粒標準品混合物為模板，用建立的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法進行擴增，每種濃度重復(fù)3次，進行組內(nèi)精密度分析；選取3 個不同的時間，進行組間精密度分析；計算變異系數(shù)（CV）。

1.8方法的初步應(yīng)用 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒提取192 份臨床樣本核酸，應(yīng)用建立的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法進行檢測，陽性臨床樣本送北京天一輝遠生物科技有限公司測序，對測序結(jié)果進行比對分析。

1.9數(shù)據(jù)采集及分析 采用Graphpad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)粒標準品的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P經(jīng)核酸／蛋白質(zhì)熒光定量儀檢測后的濃度分別為80、79、154、42 ng／μL，換算成拷貝數(shù)分別為2.43×1012、2.40 × 1012、4.68 × 1012、1.27 × 1012copies／mL，作為多重?zé)晒舛縍T-PCR的標準品。

2.2多重?zé)晒舛縍T-PCR體系的優(yōu)化及標準曲線經(jīng)優(yōu)化后，確定反應(yīng)體系為30μL，其中10×Neoscript-RTase／UNG Multi mix 3 μL，5 × Neoscript RT Premix Multi Buffer 6μL，HPIV1、HPIV2、HPIV3（100μmol／L）上下游引物各0.1 μL，HPIV1、HPIV2、HPIV3探針（100 μmol／L）各0.05 μL，RNase P上下游引物（50μmol／L）各0.06μL，RNase P探針（50μmol／L）各0.03 μL，模板15 μL，ddH2O 補至30 μL。反應(yīng)條件：50 ℃20 min，95 ℃3 min；95 ℃15 s，54 ℃30 s，共45 個循環(huán)，每個循環(huán)退火時收集熒光信號。

將pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P重組質(zhì)粒標準品10 倍稀釋后作為模板，經(jīng)多重?zé)晒舛縍T-PCR 擴增，標準曲線方程分別為：y=-3.557x+47.153，R2=0.996 5，擴增效率（E）=91%；y=-3.385x+47.315，R2=0.995 2，E=96%；y= -3.495x+ 47.315，R2= 0.995 5，E= 97%；y=-3.306x+43.556，R2=0.993 4，E=112%。見圖1。表明4 種質(zhì)粒標準品在103~ 107copies／mL 范圍內(nèi)與Ct值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 pUC57-HPIV1（A）、pUC57-HPIV2（B）、pUC57-HPIV3（C）、pUC57-RNase P（D）重組質(zhì)粒標準品的多重?zé)晒舛縍T-PCR標準曲線Fig.1 Standard curves of multiplex real-time RT-PCR assay for recombinant plasmid standards of pUC57-HPIV1（A），pUC57-HPIV2（B），pUC57-HPIV3（C）and pUC57-RNase P（D）

2.3方法的驗證

2.3.1靈敏度 建立的多重?zé)晒舛縍T-PCR 方法對HPIV1、HPIV2 和HPIV3 的最低檢測限均能達到500 copies／mL，見表2。

表2 靈敏度驗證結(jié)果（x±SD，n=20）Tab.2 Results of sensitivity verification（x±SD，n=20）

2.3.2特異性 建立的多重?zé)晒舛縍T-PCR 方法僅對HPIV1、HPIV2、HPIV3核酸的擴增結(jié)果為陽性，見圖2。表明該方法特異性較強。

圖2 方法的特異性驗證Fig.2 Verification for specificity

2.3.3精密度 3 種濃度的pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P重組質(zhì)粒標準品混合物多重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測結(jié)果的組內(nèi)和組間CV均小于3%，見表3。表明該方法精密度較好。

表3 精密度驗證結(jié)果（x±SD，n=3）Tab.3 Results of precision verification（x±SD，n=3）

2.4方法的初步應(yīng)用192份臨床樣本中，檢出HPIV1陽性15 份，陽性率7.81%；HPIV2 陽性1 份，陽性率0.05%；HPIV3 陽性6 份，陽性率3.1%。陽性樣本測序結(jié)果與本方法檢測結(jié)果一致。表明建立的方法可用于臨床樣本的檢測。

3 討論

HPIV是導(dǎo)致兒童下呼吸道感染的重要病原體［16-17］。其引起的主要疾病有咽扁桃體炎、支氣管炎、肺炎、喉炎、肺炎等。不同亞型的HPIV 引起的臨床疾病及臨床表現(xiàn)不同，HPIV1、HPIV2是引起急性支氣管、支氣管肺炎的主要亞型，表現(xiàn)為鼻塞、肌痛、關(guān)節(jié)痛，較少有發(fā)熱［18］。HPIV3是引起咽扁桃體炎、喉炎的主要亞型，表現(xiàn)為咳嗽、鼻炎等，多出現(xiàn)發(fā)熱［19-20］。流感病毒和副流感病毒感染的診斷極為相似，難以區(qū)分。因此，建立一種能夠快速準確區(qū)分HPIV 亞型的診斷方法對HPIV的臨床治療具有重要意義。

對于HPIV 的檢測，傳統(tǒng)方法如病原體分離培養(yǎng)鑒定，存在費事費力等缺陷，難以滿足臨床快速診斷的要求。而免疫學(xué)檢測存在窗口期且靈敏度和特異性略低［21］。熒光定量RT-PCR 作為一種快速、靈敏、特異的檢測方法，在臨床實驗室中得到了廣泛應(yīng)用，但其檢測項目單一，無法滿足臨床診斷需求。多重?zé)晒舛縍T-PCR 法可在1 個反應(yīng)體系中同時檢測多個目的基因，具有簡便、經(jīng)濟、高效等優(yōu)點［22］。但多重?zé)晒舛縍T-PCR體系中存在多對引物和探針，會對擴增體系造成抑制作用或降低靈敏度，需要對引物和探針組合及反應(yīng)體系進行優(yōu)化。PCR 反應(yīng)的內(nèi)質(zhì)控與樣本同樣參與檢測全過程，實施對每一份樣本的監(jiān)控職責(zé)［23］。RNase P 是人體各組織器官細胞中普遍存在的一種酶，對于人源性樣本的RNA 檢測，RNase P可作為內(nèi)質(zhì)控使用。

本研究通過篩選特異性引物及探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種用于檢測HPIV1、HPIV2、HPIV3的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，該方法特異性強，與甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠狀病毒無交叉反應(yīng)，最低檢測限為500 copies／mL；3種濃度的重組質(zhì)粒標準品混合物的組間和組內(nèi)CV均低于3%，精密度較好。本研究建立的多重?zé)晒舛縍T-PCR 方法可用于臨床呼吸道感染患者的早期篩查，與傳統(tǒng)檢測方法相比，具有高靈敏度、高分辨、快速甄別等特點，不僅可有效提高臨床檢測效率，也能明確感染的病原體類型，為臨床快速鑒別診斷HPIV 及其精準治療提供了診斷結(jié)果和理論依據(jù)，對防治HPIV 感染和保護公共衛(wèi)生安全具有重要意義。綜上所述，本研究建立了HPIV1、HPIV2 和HPIV3 多重?zé)晒舛縍T-PCR 檢測方法，可用于HPIV 感染及其亞型的鑒別診斷。