囊泡相關(guān)膜蛋白8的研究進展

張鑫，侯雪陽 綜述，張瑞，唐景峰 審校

1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068；2.湖北工業(yè)大學科技部／教育部細胞調(diào)控與分子藥物學科創(chuàng)新“111”引智基地，湖北武漢430068

膜融合是細胞中普遍存在的生命活動［1］，如自噬、亞細胞區(qū)室化、細胞生長、激素分泌和神經(jīng)傳遞等基本生物過程均需要快速、特異性和受調(diào)控的膜融合［2-4］。盡管細胞中存在多種膜融合類型，但融合反應具有共同特征，主要包括膜聚集、脂質(zhì)雙分子層直接接觸、外部脂質(zhì)重排導致莖的形成、莖擴張產(chǎn)生半融合隔膜及融合孔形成和孔擴張等步驟，最終完全融合［5］。研究發(fā)現(xiàn)，細胞中的膜融合過程必須有N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）復合物的參與，根據(jù)分布位置不同，SNARE 可分為供體膜受體蛋白（v-SNARE）和靶膜受體蛋白（t-SNARE）［6］，v-SNARE 需與特定的t-SNARE 配對，形成“SNARE 復合物”來驅(qū)動細胞中不同的膜融合。SNARE 蛋白家族已有38 個成員被表征，其中囊泡相關(guān)膜蛋白8（vesicle associated membrane protein 8，VAMP8）是最重要的v-SNARE之一［7］。為更深入了解VAMP8 在膜融合中的作用及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，本文就VAMP8 的分子結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后修飾、生物功能及其與人類疾病相關(guān)性的研究進展作一綜述，以期為治療相關(guān)疾病和開發(fā)有效的VAMP8靶點藥物提供新思路。

1 VAMP8的生物學概述

1.1VAMP8 的分子結(jié)構(gòu)VAMP8基因位于人類二號染色體的2p11.2區(qū)，包含3個外顯子，跨越4 496 bp的基因組DNA。VAMP8基因的cDNA全長為679 bp，包括61 bp 的5'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）、315 bp 的3'UTR 和300 bp 的編碼100 個氨基酸殘基的多肽序列及1個終止密碼子。預測VAMP8相對分子質(zhì)量約為11 000，實際檢測約為15 000。VAMP8包含2 個結(jié)構(gòu)域，1 個是含有SNARE 基序的功能結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合其他特定的SNARE蛋白；另1個是跨膜結(jié)構(gòu)域，可確保其錨定在某些生物膜上以發(fā)揮特定功能［8］。

1.2VAMP8 的表達分布 VAMP8 主要定位于內(nèi)體、囊泡、溶酶體膜等各種生物膜上，是促進和輔助細胞中膜融合的關(guān)鍵蛋白［9］。VAMP8蛋白具有高度保守性，其在哺乳動物、兩棲動物、鳥類、魚類等物種中均有表達［10］。VAMP8蛋白在人類的結(jié)腸、胎盤、腎臟、肺及各種外分泌組織中廣泛存在，并具有相應的生理功能［11-12］。

2 VAMP8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與翻譯后修飾

2.1VAMP8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過改變基因的轉(zhuǎn)錄效率以協(xié)調(diào)基因表達水平和表達時間的重要方式。目前，關(guān)于VAMP8基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究的報道較少，其中一項研究表明，鼠源VAMP8基因可受CCAAT增強子結(jié)合蛋白β（CCAAT enhancer binding protein beta，CEBPB）的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子CEBPB 是通過結(jié)合小鼠VAMP8基因的-198～-1 bp區(qū)域的DNA序列來促進其轉(zhuǎn)錄［13］。

2.2VAMP8的翻譯后修飾

翻譯后修飾是指蛋白質(zhì)在生物合成后進行的化學修飾，該修飾會影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能，包括結(jié)構(gòu)變化、定位改變、激酶活性及相互作用等。甲基化、泛素化、乙?；?、糖基化、磷酸化等翻譯后修飾是細胞中最常見的修飾類型，不同種類的修飾及不同位點的同種修飾均會導致蛋白質(zhì)具有不同的功能。

2.2.1VAMP8 的磷酸化 VAMP8 對囊泡與質(zhì)膜的融合至關(guān)重要，但關(guān)于VAMP8 的翻譯后修飾對膜融合的影響則少有研究。MALMERSJ 等［14］研究表明，VAMP8 的磷酸化對膜融合具有抑制作用，這可能是由于磷酸化導致產(chǎn)生空間位阻和增加磷酸基團的內(nèi)部負電荷以減少SNARE 介導的融合。晶體結(jié)構(gòu)顯示，SNARE 復合物的可溶性部分由4 個α 螺旋（即SNARE 域）組成，VAMP8 的磷酸化位點位于這些螺旋的結(jié)合區(qū)域，為其通過磷酸化影響SNARE 介導的膜融合提供了可能［8，14］。與其相比，在突觸囊泡融合中起關(guān)鍵作用的VAMP1、VAMP2 及VAMP3 的相應位點被突變?yōu)楸彼?，導致其不能發(fā)生磷酸化［14］。通過對比發(fā)現(xiàn)，介導非突觸膜融合的其他SNARE 蛋白在類似位置均存在絲氨酸和蘇氨酸殘基，表明非突觸VAMP 具有進化上保守的內(nèi)部磷酸化位點，允許通過蛋白激酶對囊泡與質(zhì)膜的融合進行調(diào)控。HONG 等［15］的研究也證實，VAMP8第48 位點的蘇氨酸磷酸化會抑制自噬體膜與溶酶體膜的融合。

2.2.2VAMP8 的泛素化 VAMP8 氨基酸序列存在7個賴氨酸，提示VAMP8可能具有泛素化修飾。VAMP8作為胞質(zhì)分裂過程中囊泡融合所需的v-SNARE 蛋白，其可定位于對泛素化蛋白呈陽性的中央紡錘體區(qū)域，并能被信號轉(zhuǎn)導接頭分子的Src 同源3 結(jié)構(gòu)域的相關(guān)分子（associated molecule with the SH3 domain of STAM，AMSH）和去泛素化酶8（deubiquitinating enzyme 8，USP8）進行泛素化和去泛素化調(diào)控［16］。雖然VAMP8 的功能受到胞質(zhì)分裂過程中泛素化和去泛素化的調(diào)節(jié)，但VAMP8 泛素化在胞質(zhì)分裂中的意義尚未明確，有待深入研究。另有研究表明，VAMP8的泛素化不會抑制其與t-SNARE蛋白的相互作用，但替換所有賴氨酸殘基可能會導致VAMP8 的SNARE活性完全喪失；另外，VAMP8 可形成同型二聚體，提高泛素化VAMP8 通過非泛素化VAMP8 與t-SNARE蛋白間接相互作用的可能性［16］。

2.2.3VAMP8的其他翻譯后修飾 除了磷酸化和泛素化以外，目前尚無關(guān)于VAMP8 其他翻譯后修飾的報道。通過在線網(wǎng)站（https：／／services.healthtech.dtu.dk／service.php?NetNGlyc-1.0）預測發(fā)現(xiàn)，VAMP8 氨基酸序列存在N-X-S／T 基序，表明其可能具有N-糖基化修飾，VAMP8 主要定位在溶酶體上，但具體機制尚未明確。猜測可能是VAMP8 的糖基化修飾使其免受溶酶體蛋白酶的降解，進而長期錨定在溶酶體上，發(fā)揮其相應功能。

3 VAMP8與自噬的相關(guān)性

自噬是細胞維持穩(wěn)態(tài)、降解廢物和受損細胞器及進行某些正常生命活動不可缺少的重要生物過程［17-18］。VAMP8作為一種主要定位于溶酶體膜上的蛋白質(zhì)參與自噬體與溶酶體融合的過程，即VAMP8能夠與突觸體相關(guān)蛋白29（synaptosomal associated protein 29，SNAP29）和自噬溶酶體相關(guān)基因突觸融合蛋白17（SNARE protein syntaxin 17，STX17）形成SNARE 復合物，促進自噬體和溶酶體融合，進而促進自噬。

有文獻報道，N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（N-acetylglucosamine transferase，OGT）介導的SNAP29糖基化及CREB基因結(jié)合蛋白（CREB-binding protein，CRP）介導的STX17 乙酰化可影響二者與VAMP8 的結(jié)合，從而影響自噬性SNARE復合物的形成［19-20］。在營養(yǎng)比較豐富的條件下，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）可與VAMP8 相互作用并將其磷酸化［15］，與去磷酸化的VAMP8 比較，磷酸化的VAMP8 與SNARE 蛋白STX17 及SNAP29 的相互作用減少，最終導致自噬體和溶酶體融合受阻。通過對自噬SNARE 復合物晶體結(jié)構(gòu)的解析發(fā)現(xiàn)，STX17的Q196、SNAP29的Q84／Q230 及VAMP8 的R37 組成了復合物中心的保守離子層，在分子層面明確闡述了自噬特異性膜融合的機制［21］。

VAMP8 作為參與自噬體與溶酶體融合的關(guān)鍵蛋白，與其他自噬相關(guān)蛋白存在調(diào)控和被調(diào)控的關(guān)系。VAMP8 在早期內(nèi)體、細胞質(zhì)膜、晚期內(nèi)體、溶酶體膜上的分布處于動態(tài)平衡。研究表明，在饑餓誘導情況下，Ras 相關(guān)蛋白21（Ras-related protein 21，RAB21）和肌管蛋白相關(guān)蛋白13（myotubularin-related protein 13，MTMR13）的活性增強，促使二者與VAMP8 結(jié)合，并調(diào)節(jié)VAMP8 向溶酶體轉(zhuǎn)運，進而增加VAMP8 在溶酶體的分布以促進自噬體與溶酶體的融合過程［22］。

人類自噬基因異位P 顆粒自噬蛋白5 同源基因（ectopic P-granules autophagy protein 5，EPG5）是Ras相關(guān)蛋白7（Ras-related protein 7，Rab7）效應器之一，能決定自噬體與溶酶體融合的特異性［23］。EPG5 可識別自噬體外膜上的微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）以介導自噬體的捕獲和對接，并能穩(wěn)定SNARE 復合物的組裝，進而促進融合。VAMP8 可通過直接相互作用將EPG5 募集至溶酶體，且可能決定其在晚期內(nèi)體／溶酶體微域上的空間和時間定位；而具有膜錨定基序缺失的VAMP8 突變體則會導致EPG5 定位錯誤，影響融合［24］。

Sec1結(jié)構(gòu)域蛋白1（Sec1 family domain containing 1，SCFD1）被確定是SNARE 復合物形成和自噬體與溶酶體融合所必需的調(diào)控蛋白之一［15］，是一種具有高度進化保守性的Sec1／Munc18（SM）樣蛋白。SCFD1與VAMP8的相互作用導致其向自噬溶酶體募集，自噬的刺激促進了SCFD1與VAMP8之間的相互作用，從而促進了復合物的形成。在敲除SCFD1基因的細胞中，復合物的組裝效率顯著降低，融合過程也受阻［15］。見圖1。

圖1 VAMP8對自噬體與溶酶體融合的調(diào)控Fig.1 Regulation of autophagosome and lysosome fusion by VAMP8

4 VAMP8與胞吐作用的相關(guān)性

胞吐作用是通過分泌型囊泡與質(zhì)膜的融合釋放細胞內(nèi)某些物質(zhì)的過程，是全身細胞信號傳導及物質(zhì)運輸?shù)闹匾M成部分。VAMP8作為一種v-SNARE蛋白，在胞吐作用中發(fā)揮的功能與自噬類似，可與細胞質(zhì)膜上的t-SNARE蛋白特異性結(jié)合，使囊泡膜與質(zhì)膜融合，促進胞吐。參與胞吐作用膜融合過程的t-SNARE 蛋白有所不同，其中突觸體相關(guān)蛋白25（synaptosomal associated protein 25，SNAP25）或SNAP23 與VAMP8、STX蛋白所形成的SNARE復合物可用于驅(qū)動調(diào)節(jié)性胞吐作用的膜融合［25］。SNAP25 一般在神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中執(zhí)行上述功能，而SNAP23在其他類型的細胞中參與這一膜融合過程。

有研究證明，VAMP8 在胰腺和血小板的分泌調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［26-27］。另外，WANG 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，除了在調(diào)節(jié)胰腺腺泡細胞的胞吐作用中發(fā)揮功能外，VAMP8 對唾液腺和淚腺的胞吐作用也較重要。免疫組化分析顯示，VAMP8 在幾乎所有的外分泌組織中廣泛表達，推測VAMP8 可能是一種常見的、負責調(diào)節(jié)整個外分泌系統(tǒng)中胞吐作用的v-SNARE蛋白［29］。

黏蛋白對健康的影響及在疾病中的作用越來越受到重視，并被公認為是先天免疫的關(guān)鍵因素之一，其主要作用方式是由SNARE蛋白特異性介導的組成性胞吐。CORNICK 等［30］研究表明，VAMP8 介導的SNARE 胞吐作用是導致杯狀細胞黏蛋白分泌的最終途徑，在人杯狀細胞系中沉默VAMP8，發(fā)現(xiàn)黏蛋白的組成性胞吐釋放受到嚴重損害，而其他VAMP亞型的作用卻較小。在肺上皮分泌細胞中，VAMP8的表達水平是VAMP 亞型中最高的，盡管VAMP2、VAMP3和VAMP7與分泌細胞的囊泡胞吐作用有關(guān)，但VAMP8 是參與氣道杯狀細胞黏蛋白顆粒胞吐作用的主要v-SNARE［30］。

VAMP8 對胞吐途徑的調(diào)控可能具有選擇性。在神經(jīng)元細胞中，VAMP2 對突觸小泡的快速釋放至關(guān)重要，而VAMP8 不參與此過程［31］。通過對來自不同組織分泌細胞器的蛋白質(zhì)組學分析表明，VAMP8存在于多種但不是所有的分泌囊泡中［32］。

5 VAMP8與疾病的相關(guān)性

5.1VAMP8與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性 據(jù)報道，一些VAMP與腫瘤發(fā)生有關(guān)，如VAMP2可促進肝癌細胞凋亡并抑制增殖和侵襲；依賴于VAMP3 的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1（membrane-type matrix metalloproteinase-1，MT1-MMP）的分泌可增強細胞外基質(zhì)的降解，增加細胞侵襲［33-34］。VAMP8 作為致癌基因能夠加速細胞增殖，研究發(fā)現(xiàn)，VAMP8 參與了細胞質(zhì)分裂的終末步驟，即細胞分裂過程中，2 個子細胞的中間體脫落，VAMP8 缺失會導致細胞的中間體脫落異常［35］。中間體脫落受阻會進一步導致細胞周期停滯和細胞生長減弱，這與CHEN 等［36］的研究一致，VAMP8 過表達在體外和體內(nèi)均可促進細胞增殖，而敲低VAMP8可通過在G0／G1 期阻滯細胞周期來減弱腫瘤的生長。

VAMP8 具有腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能，DIAZ-VERA等［37］研究證實，VAMP8通過促進RAB17介導的促侵襲物質(zhì)neuopilin-2的胞飲，限制neuopilin-2向質(zhì)膜的輸送，從而抑制乳腺癌細胞的侵襲。YU 等［38］也發(fā)現(xiàn)，VAMP8 可通過調(diào)節(jié)RAB37 介導的抗轉(zhuǎn)移物質(zhì)，如基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP1）的胞吐作用在肺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用，RAB37 和VAMP8 蛋白同時低表達的肺癌患者與進行性腫瘤分期有關(guān)，且預后較差。

VAMP8 在不同類型腫瘤細胞中的功能不同。VAMP8 既能作為促癌蛋白，也能作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，這可能部分歸因于其與不同類型腫瘤中不同結(jié)合蛋白協(xié)同作用的結(jié)果。VAMP8 的特定磷酸化修飾可調(diào)節(jié)其在不同細胞中的功能，如VAMP8的磷酸化可阻止囊泡與質(zhì)膜的融合，在各種細胞中，蛋白激酶和磷酸酶的平衡可能會改變VAMP8 介導的囊泡融合，從而影響致癌進程。

5.2VAMP8 與其他疾病的相關(guān)性 VAMP8 在一些其他人類疾病中發(fā)揮作用。VAMP8 是一種新的三基序蛋白6（tripartite motif 6，TRIM6）依賴性因子，參與調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的信號傳導，如在西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）感染期間，有助于TRIM6 介導的Ⅰ型干擾素抗病毒反應［39］。在阿爾茨海默病的研究中發(fā)現(xiàn)，微管相關(guān)蛋白tan（microtubule associated protein tau，MAPT）會過度磷酸化，聚集并積聚在神經(jīng)元的體細胞樹突區(qū)室中，VAMP8 的過表達可以調(diào)控囊泡與質(zhì)膜融合，進而促進晚期內(nèi)體途徑，顯著增加了tau 蛋白的分泌，降低tau 蛋白在神經(jīng)母細胞瘤細胞系中的胞內(nèi)水平［40］，表明VAMP8 可通過增加一些有害蛋白的分泌，防止與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)積累。另外，急性胰腺炎是一種外分泌性胰腺炎疾病，被認為是由于蛋白水解酶原（最顯著的是胰蛋白酶原）與酸化細胞室中的溶酶體水解酶［最顯著的是組織蛋白酶B（cathepsin B，CatB）］異常混合而過早激活引起的［41］。有研究提出，VAMP8 介導的基底外側(cè)胞吐作用是酒精相關(guān)性急性胰腺炎的潛在機制［42］。VAMP8 分泌途徑的急性失調(diào)會觸發(fā)細胞內(nèi)胰蛋白酶積累和早期內(nèi)體區(qū)室的丟失，最終導致急性腺泡性胰腺炎［26］。VAMP8 還可影響腸道的穩(wěn)態(tài)，其缺乏會抑制黏蛋白2（mucin 2，MUC2）的胞吐分泌，進而改變腸道的黏液層，導致結(jié)腸杯狀細胞與微生物直接接觸，引起炎癥反應［30］。

5.3VAMP8與耐藥性的相關(guān)性 腫瘤細胞的耐藥性與其自噬水平強弱顯著相關(guān)［43］。有研究表明，通過上調(diào)不同腫瘤的自噬來增強對抗癌癥療法（包括放射療法、化學療法和靶向療法等）的抵抗力［44-45］。VAMP8在腫瘤耐藥中起重要作用，如VAMP8 通過提高自噬蛋白的表達水平和自噬體的數(shù)量來促進替莫唑胺（temozolomide，TMZ）抗性，通過干擾自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene 5，ATG5）或STX17進一步逆轉(zhuǎn)了VAMP8 過表達細胞中的TMZ 抗性，而VAMP8 的沉默削弱了自噬通量并減輕了膠質(zhì)瘤細胞中的TMZ抗性［36］。VAMP8 去磷酸化可能是腫瘤惡性的原因，而VAMP8 磷酸化在抑制癌細胞存活中起重要作用。CHEN 等［9］研究表明，VAMP8 磷酸化可能影響自噬體成熟，導致癌細胞的化療耐藥性，表明增強VAMP8磷酸化以阻止自噬體成熟可能是降低耐藥性的一種有效策略。

6 小結(jié)與展望

VAMP8 的相關(guān)研究主要集中于各種生物膜的膜融合方面，其通過與靶膜表面的其他SNARE 蛋白相互作用參與各種細胞（包括白細胞和多種分泌細胞等）的內(nèi)吞作用、囊泡-囊泡融合和胞吐作用等。VAMP8 的翻譯后修飾及一些相互作用蛋白是調(diào)控這些膜融合過程的關(guān)鍵，其異常表達會導致多種疾病和腫瘤細胞的耐藥性。因此，需要對VAMP8 在癌細胞中的機制展開更廣泛、更深刻的研究，VAMP8有望成為一個通過調(diào)控膜融合過程來治療相關(guān)腫瘤疾病的藥物靶點。

近年，細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），即微泡（microvesicles，MVs）和外泌體的相關(guān)研究受到關(guān)注，一些研究表明，v-SNARE 可能參與其中，如突觸小泡蛋白同源物（synaptobrevin homolog）YKT6在外泌體分泌中發(fā)揮重要作用［46］。有研究提出，VAMP8可作為外泌體基底外側(cè)釋放的調(diào)節(jié)劑，但關(guān)于EV 釋放的機制尚未明確［47］，VAMP8 在外泌體中發(fā)揮的功能有待深入研究。