一種艱難梭菌類毒素A的制備方法

代文秀 鄧卉卉 何菁榮 張祎 楊戰(zhàn)利 傅思武

摘要：目的? 探索一種制備艱難梭菌類毒素A的方法。方法 艱難梭菌VPI 10463菌株經(jīng)透析培養(yǎng)后純化取得A毒素，再用甲醛脫毒即獲得艱難梭菌類毒素A。結(jié)果? 制備的類毒素具有良好的免疫原性，不具備細(xì)胞毒性。結(jié)論? 該法具有可行性、簡便性，并具有重要的臨床應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：艱難梭菌;A毒素;類毒素

中圖分類號：R378.8? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Objective To explore a method for preparing Clostridium difficile toxoid A. Methods Clostridium difficile VPI 10463 strain was cultured by dialysis and purified to obtain toxin A， and then detoxified with formaldehyde to obtain Clostridium difficile toxoid A. Results The prepared toxoid has good immunogenicity and no cytotoxicity. Conclusion The method is feasible， simple， and has important clinical application value.

Keywords： Clostridium difficile; toxin A; toxoid

艱難梭菌（Clostridium difficile，CD）為革蘭陽性芽胞桿菌 [1]。抗生素濫用破壞腸道微生態(tài)平衡，艱難梭菌大量增殖產(chǎn)毒，導(dǎo)致艱難梭菌感染（CDI）[2]。研究表明，艱難梭菌A毒素在艱難梭菌致病過程起著重要作用。隨著高致病菌株的出現(xiàn)及菌株耐藥性的增加，CDI發(fā)病率逐年上升。由于缺乏有效疫苗，CDI防治仍是一個棘手的難題。外毒素用0.4%甲醛處理，脫去毒性而保留免疫原性，可得類毒素。其人工主動免疫刺激機(jī)體可產(chǎn)生中和外毒素的抗體。因此艱難梭菌類毒素A的制備為艱難梭菌疫苗和抗體的制備提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

基金項目：本科生科研創(chuàng)新項目（XBMU-BYL19186）

作者簡介：代文秀（1999-），女，西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部本科生，E-mail：2658356368 @qq.com

通信作者：傅思武（1967-），男，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事微生態(tài)制品研究，E-mail：yxfsw@xbmu.edu.cn

1材料與方法

1.1材料? 艱難梭菌VPI 10463菌株，Vero細(xì)胞，SSCM培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基，低溫離心機(jī)，CO2恒溫培養(yǎng)箱，BioLogic DuoFlow 系統(tǒng)，紫外線分光光度計，酶標(biāo)儀，SPF級雌性BALB/C小鼠。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)及純化? 同文獻(xiàn)[3，4]，Cd 10463于SSCM培養(yǎng)基中增菌，按5%接種于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)液離心取上清液，50%飽和硫酸銨鹽析后再次離心，取沉淀并溶解，透析后離心取沉淀。沉淀如上處理，再次離心取上清。將A毒素樣品加入DEAE-Toyopearl 650M 色譜柱，待其完全進(jìn)入膠體開始洗脫，按A280吸收峰收集洗脫液，透析24h，離心取沉淀，即為純化的艱難梭菌A毒素。

1.2.2蛋白濃度測定? 參考文獻(xiàn)[5]，采用考馬斯亮藍(lán)染色測蛋白法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用分光光度計測定OD595nm。

1.2.3類毒素制備? A毒素加入甲醛溶液至終濃度為0.4%，37℃放置7-14天，脫毒，最終得到艱難梭菌類毒素A。

1.2.4類毒素檢測

1.2.4.1無菌實驗? 將類毒素A接種于BHI培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)96h，涂片，革蘭染色后鏡檢，觀察有無細(xì)菌生長。

1.2.4.2細(xì)胞毒性測定? 將類毒素A作10倍系列稀釋，取103、104、105、106四個稀釋度，分別接種于長滿良好單層Vero 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度接種6 孔，0.1mL/孔，另設(shè)6 孔只接種稀釋液作空白對照，0.1ml/孔。37℃培養(yǎng)1周，每天觀察各孔細(xì)胞病變情況。

1.2.5小鼠免疫及血清IgG測定? 取24只20±2g的SPF級雌性BALB/C小鼠，隨機(jī)分為2組，每組12只。一組小鼠分別腹腔注射10μg生理鹽水作空白對照，另一組分別腹腔注射10μg類毒素A作實驗組，兩組分別于0d、7d、14d、28d、42d進(jìn)行免疫。于7d、14d、28d、42d尾靜脈采血、收集血清樣品，采用間接ELISA法，測OD450來反映血清中特異性IgG含量。

1.3統(tǒng)計方法? 采用SPSS 19.0，正態(tài)分布的連續(xù)變量以表示，兩組之間比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1蛋白含量：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0106x+0.0904。測得純化后A毒素的吸光度為0.103，因而濃度為1.189mg/ml。

2.2類毒素檢測

2.2.1無菌實驗：在嚴(yán)格無菌操作下，類毒素A接種于BHI培養(yǎng)基后無細(xì)菌生長。

2.2.2細(xì)胞毒性測定：在適宜條件下無菌培養(yǎng)1周，各稀釋度及空白對照組無明顯細(xì)胞病變。

2.3血清IgG測定

3討論

艱難梭菌為腸道正常菌群成員之一，菌群失調(diào)可導(dǎo)致CDI。其主要引起抗生素相關(guān)性腹瀉、偽膜性腸炎、中毒性巨結(jié)腸等病變。[6]目前CDI的治療有抗菌藥物、益生菌制劑、內(nèi)溶素及免疫療法等。事實上這些方法仍不能有效防治CDI，因此疫苗研發(fā)十分重要。

艱難梭菌為專性厭氧菌，培養(yǎng)困難，而透析培養(yǎng)不使用厭氧培養(yǎng)設(shè)備，使培養(yǎng)簡化、易行。該法在離子交換層析前采用鹽析與酸沉處理，有效去除雜蛋白，減少純化過程蛋白的降解與損耗，且此法將層析介質(zhì)由DEAE-Sepharose CL 6B改為DEAE-Toyopearl 650M，分離效果更佳。此外本法操作簡單、設(shè)備簡易、重復(fù)性好，可大批量制備艱難梭菌類毒素A。

經(jīng)甲醛處理后的艱難梭菌A毒素，無菌實驗與細(xì)胞毒性測定均為陰性，表明制備的艱難梭菌類毒素A無毒性，安全試驗合格。如表1，每次所測IgG效價（）實驗組均大于對照組，且P值均<0.05，表示類毒素A能刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體，說明類毒素A具有明顯的免疫原性。綜上所述，類毒素A無毒但具備免疫原性，該艱難梭菌類毒素A的制備方法可行、簡便且有效。

參考文獻(xiàn)

[1]Leuzzi R ， Adamo R ， Scarselli M . Vaccines against Clostridium difficile[J]. Human Vaccines & Immunotherapeutics， 2014， 10（6）：1466-1477.

[2]Etienne-Mesmin L . Clostridium difficile ： la belle et la bête[J]. Medecine ences： M/S， 2017， 33（10）：825-828.

[3]傅思武，周殿元.艱難梭菌A毒素的純化[J].中國生化藥物雜志，2004（02）：86-88.

[4]傅思武， 艱難梭菌B毒素的純化及其生物學(xué)活性鑒定. 甘肅省，西北民族大學(xué)，2012-04-06

[5]祝連彩，唐士金，周麗.考馬斯亮藍(lán)G 250法測定蛋白質(zhì)含量的教學(xué)實踐及方法學(xué)探討[J].教育教學(xué)論壇，2020（23）：266-269.

[6]Nunzia DUrzo， Malito E ， Biancucci M ， et al. The structure of Clostridium difficile toxin A glucosyltransferase domain bound to Mn2+ and UDP provides insights into glucosyltransferase activity and product release.[J]. Febs Journal， 2012， 279（17）.

西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，甘肅蘭州 730030