QuEChERS-液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法測定毒蘑菇中5種鵝膏肽類毒素

林子豪，羅鼎峰，戚 平，毛新武

（廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400）

近年來，蘑菇中毒事件在我國常有發(fā)生，其致死率高達90%以上[1]，主要由鵝膏肽類毒素引起[2]。鵝膏肽類毒素化學性質(zhì)穩(wěn)定，在烹飪過程無法破壞其毒性[3]。按結(jié)構(gòu)分類，鵝膏肽類毒素可分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和毒傘素3大類[4]，其中鵝膏毒肽主要有α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽，鬼筆毒肽以羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽為主。鵝膏肽類毒素進入人體后，如果不及時發(fā)現(xiàn)和采取治療，將會引起肝腎功能衰竭而死亡，因此建立快速準確、靈敏度高的鵝膏肽類毒素分析方法對預防蘑菇中毒和搶救中毒患者具有重要意義。

目前，鵝膏肽類毒素的檢測方法以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-7]為主，其樣品前處理主要采用固相萃取法[8-10]，但該前處理方法耗費時間較長，不適用于中毒應急檢驗。QuEChERS凈化方法簡便快捷，在農(nóng)獸藥殘留[11-12]和非法添加物[13-14]檢測中有廣泛的應用。四極桿飛行時間質(zhì)譜相比四極桿串聯(lián)質(zhì)譜具有更高的分辨率，可以降低樣品基質(zhì)的干擾，進一步提高方法準確性[15]。本實驗通過優(yōu)化前處理方法和儀器條件，建立毒蘑菇中5種鵝膏肽類毒素的液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜分析方法，為食品中毒應急檢驗提供技術(shù)支撐保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

甲醇、乙腈，色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；0.22 μm聚四氟乙烯濾膜，上海安譜科學儀器有限公司；5種鵝膏肽類毒素購自上海安譜科學儀器有限公司（純度均≥ 90%）。

Waters Xevo Q-TOF液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀，美國Waters 公司；旋渦振蕩混合器，美國Thermo Fisher Scientific公司；電子天平，德國Sartorius公司；Allegra X-30R冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取5種鵝膏肽類毒素標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到100 μg/mL的標準儲備液，于-20 ℃避光保存；分別移取1 mL標準儲備液至10 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇定容至刻度，配制成濃度均為1 μg/mL的混合標準中間液。移取適量混合標準中間液，用水配制成濃度為10～200 ng/mL的系列混合標準溶液。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取經(jīng)粉碎均質(zhì)處理的樣品1.0 g（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，于旋渦振蕩混合器上渦旋5 min，以10 000 r/min離心5 min；取1 mL上清液置于2 mL離心管中，分別加入25 mg無水硫酸鈉和C18凈化劑，旋渦1 min后，10 000 r/min離心5 min。吸取1 mL凈化液，用水稀釋至10 mL，過膜，待測。

1.2.3 實驗條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動相A為水，流動相B為乙腈；梯度：0～2 min，8%B；2～3 min，8%～40%B；3～5 min，40% ～ 60%B；5～ 7 min，60% ～ 80% B；7～7.1 min，80%～8%B；7.1～10 min，8%B。

（2）質(zhì)譜條件。離子化模式：ESI+；掃描范圍：m/z為50～1 000；電噴霧離子源溫度為120 ℃；毛細管電壓為3.0 kV；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流量為800 L/h；錐孔氣流量為50 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

由于α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽的分子量僅相差1 Da，α-鵝膏毒肽含有約43%的13C同位素，因此這兩種毒肽需要在色譜上進行基線分離?？疾炝艘译?水和乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽在以乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相時無法分離，在乙腈-水的條件下分離度較好。在乙腈-水的條件下，比較了5種化合物的[M+H]+和[M+Na]+的母離子信號響應，發(fā)現(xiàn)[M+Na]+的信號響應均高于[M+H]+。5種鵝膏多肽的質(zhì)譜條件見表1，色譜圖見圖1。

表1 5種鵝膏肽類毒素的質(zhì)譜條件

圖1 5種鵝膏肽類毒素的色譜圖

2.2 前處理條件的優(yōu)化

目前，鵝膏肽類毒素的前處理方法主要采用固相萃取法，耗費時間較長，不適用于中毒應急檢驗。本實驗采用QuEChERS凈化方法對提取液進行凈化?？疾炝薈18、石墨化炭黑、PSA、無水硫酸鈉等4種常用凈化劑對目標物的吸附情況（用量均為1 mL提取液加入25 mg凈化劑）。由圖2可知，PSA和石墨化炭黑對β-鵝膏毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽等有較強的吸附，C18和無水硫酸鈉對5種鵝膏肽類毒素基本沒有吸附。因此，本實驗采用C18和無水硫酸鈉進行凈化。

圖2 4種凈化劑對5種鵝膏肽類毒素的吸附情況

2.3 方法學驗證

5種鵝膏肽類毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（S/N=3）見表2。在10～200 ng/mL的范圍內(nèi)，5種鵝膏肽類毒素的相關(guān)系數(shù)均＞0.99，檢出限在0.03～0.36 mg/kg。按照實驗步驟，選擇蘑菇空白樣品，進行低、中、高加標回收試驗，每個水平重復6次，結(jié)果如表3所示。在2～10 mg/kg的加標水平下，5種鵝膏肽類毒素的加標回收率為90.1%～105.4%，相對標準偏差為0.1%～4.1%。結(jié)果表明，該方法滿足5種鵝膏肽類毒素的檢測需求。

表2 5種鵝膏肽類毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表3 5種鵝膏肽類毒素的回收率和相對標準偏差

3 結(jié)論

本實驗以乙腈為提取溶劑，結(jié)合QuEChERS凈化技術(shù)，建立了5種鵝膏肽類毒素的液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析方法。該方法快速簡便，回收率高，能滿足定性定量需求，為食品中毒應急檢驗提供強有力的技術(shù)保障。