QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定牛奶中6 種玉米赤霉 烯酮類毒素

謝瑜杰，陳 輝，彭 濤,*，代漢慧，胡雪艷，范春林，呼秀智，薛占永,*

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056021；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

玉米赤霉烯酮類毒素是二羥基苯甲酸內酯類化合物，屬于非甾體類同化激素，具有弱雌激素功能[1]，包括α-玉米赤霉醇（α-zearalanol，α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-zearalanol，β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol，α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol，β-ZOL）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）和玉米赤霉酮（zearalenone，ZAN）6 種。其中，ZON主要存在于飼料及農產(chǎn)品中。有研究表明，家畜食入含有ZON的飼料或農產(chǎn)品后，會在胃腸道內通過代謝產(chǎn)生毒性更強的其他5 種玉米赤霉烯酮類毒素[2-3]（代謝途徑詳見圖1）。我國GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定ZON在農產(chǎn)品中的限量標準為60 μg/kg[4]。而赤霉醇（zeranol，ZER）在養(yǎng)殖業(yè)中常用作家畜的促生長劑，促進蛋白質合成，提高飼料轉化率及酮體瘦肉率[5-6]。當消費者食入含有ZER的動物性產(chǎn)品后會抑制體內外的激素結合受體，存在致癌風險[7]。為了確保消費者健康，多數(shù)國家將ZER列為禁用藥物，禁止在食用性動物上使用[8-9]，我國農業(yè)部235號公告也明確要求在所有食用動物以及組織中不得檢出ZER[10]。研究發(fā)現(xiàn)，排出動物體外的玉米赤霉烯酮類毒素可通過水和食物造成二次污染，人食用后會抑制促性腺激素結合受體，對人體性機能以及第二性征造成影響，在外部條件誘導下還會致癌[11-12]。因此，建立快速簡單、準確、靈敏的檢測食品中玉米赤霉烯酮類毒素方法非常重要。

高效液相色譜-串聯(lián)質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測技術具有靈敏度高、穩(wěn)定可靠、定性定量準確等優(yōu)勢，且可以提供目標物質的結構信息，使其成為檢測玉米赤霉烯酮類毒素的常用技術[13-14]。Visconti等[15]使用HPLC-MS/MS測定谷物中的6 種玉米赤霉烯酮類毒素；李麗萍等[16]利用HPLC-MS/MS檢測豬肉中的6 種玉米赤霉烯酮類毒素；邵瑞婷等[17]采用HPLC-MS/MS檢測牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素。已報道的文獻中，在凈化技術上多使用具有選擇性好、抗干擾能力強等優(yōu)勢的免疫親和柱凈化與固相萃取等手段。與這些傳統(tǒng)的凈化技術比，QuEChERS（quick easy cheap, effective,rugged and safe）方法具有簡單、快速等優(yōu)勢，在食品安全檢測方面應用越來越廣泛。其中，Yan Zheng等[18]采用QuEChERS-LC-MS/MS檢測豬肉中的6 種玉米赤霉烯酮類毒素。但是，目前針對檢測牛奶中玉米赤霉烯酮類毒素的QuEChERS-HPLC-MS/MS檢測方法的報道還相對較少。甄振鵬等[19]建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS檢測方法，對牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素進行檢測，使用乙酸乙酯提取，C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、無水硫酸鎂質量比1∶1∶1，凈化提取液，方法定量限為0.33～1 μg/kg，回收率在83.2%～111%之間。

牛奶中含有大量人體必需營養(yǎng)素，是人獲取營養(yǎng)的主要來源。但是牛奶中也會存在一些質量問題給身體健康帶來危害，如玉米赤霉烯酮類毒素的存在，使人類的健康面臨著一定的風險。目前，檢測牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素的方法較多，但操作繁瑣、復雜、靈敏度低。本研究對QuEChERS-HPLC-MS/MS同時檢測牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素方法進 行研究優(yōu)化，以1%乙酸-乙腈作為提取液，用PSA、C18、無水硫酸鎂質量比3∶4∶4為吸附劑，5 mmol/L乙酸銨-乙腈為流動相，方法定量限為0.25～0.5 μg/kg，回收率在91.8%～114.5%之間，優(yōu)于已有方法且滿足玉米赤霉烯酮類毒素的限量要求[4,20]。因此，使用本方法檢測牛奶中玉米赤霉烯酮及其代謝產(chǎn)物，方法簡單快速、靈敏度高，結果可靠準確，可以為準確快速檢測牛奶中玉米赤霉烯酮類毒素提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 市購。

甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純），甲酸、乙酸（質譜級） 美國Fisher公司；乙酸銨（色譜純） 比利時Acros Organics公司；C18（50 μm） 天津博納艾杰爾公司；N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm） 艾爾杰公司；實驗用水為Milli-Q超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1290高效液相色譜儀和6460三重四極桿質譜儀 美國安捷倫公司；TRIO TM-1 N型旋渦混合器 上海AS ONE公司；SR-2DS型水平振蕩器 日本TATEC公司；3-30 K型高速冷凍離心機 德國Sigma公司；N-EVAP 112型氮吹儀 美國Organomation Associates公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；KQ-600B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取各標準品（0.010 0±0.000 5）g，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液，于4 ℃冰箱保存。需要時各取儲備液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，并用甲醇稀釋成10 mg/L的混合中間液，使用前將中間液用甲醇稀釋配制成1.0 mg/L的混合標準液。配制好的溶液均避光、4 ℃保存。

1.3.2 樣品預處理

1.3.2.1 提取

準確稱2.00 g牛奶樣品置于50 mL離心管中，加入1%乙酸-乙腈10 mL，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL離心管中。用1%乙酸-乙腈重復提取1 次，合并上清液。加入乙腈飽和正己烷5 mL，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上層正己烷，重復該過程，待凈化。

1.3.2.2 凈化

將上述溶液轉移至裝有80 mg C18、60 mg PSA和80 mg無水硫酸鎂的離心管中，振蕩10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液（約20 mL）于雞心瓶中，40 ℃旋蒸至約2 mL，在40 ℃氮吹至干，以1 mL水-乙腈（3∶1，V/V）定容，過0.22 μm濾膜后，供HPLC-MS/MS分析。

1.3.3 HPLC-MS/MS分析條件

色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A為5 mmol/L NH4Ac溶液，B為乙腈溶液；洗脫梯度：0～5 min，25%～70% B，5～6 min，70% B；6～9 min，70%～25% B。

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；多反應監(jiān)測（multi-reaction monitoring，MRM）；負離子模式；毛細管電壓4.0 kV；離子源溫度350 ℃；去溶劑氣流：氮氣，10 L/min；去溶劑溫度325 ℃；錐孔氣流：氮氣，8 L/min；碰撞氣壓0.4 MPa。其他參數(shù)見表1。

1.3.4 基質匹配外標曲線

以陰性牛奶樣品提取液（操作同1.3.2節(jié)）作為溶劑，將標準溶液稀釋成0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/L的標準溶液，以待測物的質量濃度為橫坐標，定量離子質量色譜峰面積為縱坐標，繪制外標曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

采用Excel和Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理，結果以表示。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

玉米赤霉烯酮類毒素脂溶性較好，可以很好地保留在 C18色譜柱上[21]，因此本研究選擇在ZORBAX SB-C18柱上分離。由于該類毒素理化性質相似且存在兩對α和β異構體，而MS/MS很難區(qū)分兩對異構體[2-24]，所以必須在液相色譜上對兩對異構體進行分離。同時，動物源性食品是一類復雜基質，其中存在許多干擾雜質[25-26]，李賢良等[27]研究發(fā)現(xiàn)使用乙酸銨溶液作為流動相可以減少基質中雜質的干擾，提高離子化效率。因此，本研究參考已有的文獻報道，通過實驗最終選擇乙腈-5 mmol/L乙酸銨作為流動相進行梯度洗脫，使目標物在出峰位置無雜峰干擾并且出峰時間彼此分開，如圖2所示。

圖2 基質匹配標準溶液中6 種玉米赤霉烯酮類毒素的MRM色譜圖（質量濃度10 ng10 ng/mL）mLFig. 2 MRM chromatograms of 6 zeranols in matrix-matched standard solution (10 ng/mL)

2.2 質譜條件的優(yōu)化

玉米赤霉烯酮類毒素的化學結構式均帶有羥基，在ESI模式下易丟失氫離子而帶負電荷[14,22,28]，產(chǎn)生分子離子[M－H]－。玉米赤霉烯酮易產(chǎn)生碎片離子[M－H－CO2]－和[M－H－C8H14O2]－，而其余5 種毒素丟失一分子水和二氧化碳后產(chǎn)生碎片離子[M－H－H2O]－和[M－H－CO2]－。

本研究以[M－H]－為母離子，在MRM模式下進行掃描，選擇響應最強的碎片為定量離子，次級強為定性離子，具體條件詳見表1。選擇監(jiān)測離子與農業(yè)部1025號公告[29]一致。

2.3 提取溶劑的選擇

玉米赤霉烯酮類毒素為脂溶性物質，且呈弱酸性，在酸性及中性條件下易溶于有機溶劑[24]。已報道的文獻中動物源性食品提取該類物質主要采用乙腈[5]、乙酸乙酯[19]、無水乙醚[30]等。通過參考文獻發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮類毒素易在酸性條件下提取，因此本研究在10 μg/kg添加量下首先對乙腈、1%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈的提取效果進行比較。如圖3所示，實驗發(fā)現(xiàn)1%乙酸-乙腈作為提取液時回收率較高，且重復性良好（n=6）。根據(jù)實驗結果本實驗又對乙酸-乙腈中乙酸體積分數(shù)及提取過程等進行優(yōu)化，選用0.5%、1%、2%和3%乙酸-乙腈作為提取液，樣品經(jīng)提取液重復提取，合并上清液，用乙腈飽和正己烷重復脫脂，比較回收率和相對標準偏差，結果如圖3所示。0.5%乙酸-乙腈回收率和重復性均較差，1%、2%、3%乙酸-乙腈提取，回收率相當且均在70%～120%之間，但使用2%和3%乙酸-乙腈時的相對標準偏差較差，因此，選擇1%乙酸-乙腈作為提取劑。在10 μg/kg加標水平下，6 種玉米赤霉烯酮類毒素的提取回收率為87%～105%。

圖3 提取液對牛奶中玉米赤霉烯酮類毒素回收率的影響（n=3）Fig. 3 Recoveries of zeranols in milk with different extraction solvents (n = 3)

2.4 凈化方式的選擇

牛奶中存在大量的干擾物質，C18可用來去除牛奶中的脂肪和酯類等，PSA可去除脂肪酸、有機酸、色素、糖等極性物質。同時，提取液中還含有大量水分，使用無水硫酸鎂去除水分。因此本試驗對C18、PSA、無水硫酸鎂的吸附凈化效果進行研究。

吸附劑的質量對于減少基質干擾和提高回收率有重要作用，對此本研究分別對PSA、C18以及無水硫酸鎂的用量進行優(yōu)化。在10 μg/kg添加量下分別使用40、60、80、150、200 mg的PSA、C18和無水硫酸鎂對2.3節(jié)1%乙酸-乙腈提取液進行凈化，結果見圖4。圖4a給出了PSA用量變化時6 種玉米赤霉烯酮類毒素回收率的變化情況，PSA在40 mg時6 種毒素的回收率均較低且重復性差，60～80 mg時回收率在70%～120%之間且去除干擾效果較好，但當用量大于60 mg時，重復性相對較差。圖4b對C18的用量進行優(yōu)化，可以看出，C18的用量與回收率成正比，隨著用量的增多回收率也逐漸增高，用量大于80 mg時6 種毒素的重復性均較差，在80 mg時回收率在70%～120%范圍內且回收率高 于40 mg和60 mg。圖4c中顯示無水硫酸鎂對回收率的影響很明顯，在40～60 mg以及100～150 mg時回收率比80 mg和200 mg的回收率低，但是200 mg的重復性較差，因此本實驗原則使用80 mg無水硫酸鎂。

在10 μg/kg添加水平下使用不同比例的吸附劑對牛奶中玉米赤霉烯酮類毒素凈化效果、回收率及重復性進行比較，結果如圖5所示。將上述結果60 mg PSA、80 mg C18、80 mg無水硫酸鎂（質量比3∶4∶4）組合使用與甄振鵬等[19]實驗中使用的PSA、C18、無水硫酸鎂質量比1∶1∶1相比，前者的凈化效果、回收率和重復性均較好。因此，本研究最終選擇PSA、C18和無水硫酸鎂的用量分別是60、80 mg和80 mg。

圖4 吸附劑質量對牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素回收率的影響Fig. 4 Effect of sorbent dosage on recoveries of six zeranols from milk

圖5 吸附劑比例對牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素回收率的影響Fig. 5 Effect of sorbent composition on recoveries of zeranols from milk

2.5 基質效應測定結果

在HPLC-MS/MS色譜柱上被洗脫出的含有提取液的共流出物（包括基質成分），會與目標離子相互競爭液滴表面，導致該目標物出現(xiàn)離子化效率降低或增強，造成響應的降低或升高，最終出現(xiàn)基質抑制效應或增強效應。

本實驗建立了添加量0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/kg的溶劑和基質標準曲線，通過比較兩條標準曲線的斜率判定基質效應，計算公式如下：

根據(jù)受到基質效應的強弱，將基質效應分為3 類：基質效應低于－20%表現(xiàn)為基質抑制效應；基質效應介于－20%和20%之間表現(xiàn)為弱基質效應；基質效應高于20%表現(xiàn)為基質增強效應。結果表明：6 種玉米赤霉烯酮類毒素中α-ZAL表現(xiàn)弱的增強效應，其余化合物表現(xiàn)抑制效應，具體見表2。因此，本實驗選擇使用基質匹配外標法消除基質效應對目標物的影響。

表2 牛奶中6 種玉米赤烯酮醇類毒素的基質效應（n=7）Table 2 Matrix effect for six zeranols in milk (n =7))

2.6 定量方式及線性關系

由于存在基質效應，本實驗則以陰性牛奶樣品提取液作為溶劑配制混合標準溶液，采用基質匹配外標法定量。在陰性樣品中添加目標化合物，按照給定的方法測定，在0.1～50 μg/L線性范圍以信噪比RSN為3對應添加水平作為檢出限，信噪比RSN為10對應的添加水平作為定量限，結果見表3。結果顯示該方法的檢出限在0.05～0.1 μg/kg之間，定量限在0.25～0.5 μg/kg之間。

表3 6 種玉米赤霉烯酮類毒素的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, calibration equations, correlation coeffificients,LODs and LOQs for six zeranols

2.7 準確度和精密度實驗結果

為考察方法的準確度和精密度，使用陰性牛奶為空白樣品，分別選擇添加定量限的1、2 倍和10 倍的玉米赤霉烯酮類毒素，按前述方進行加標回收實驗測定，每個添加量實驗測定6 個平行。同時做空白實驗，均扣除本底值后計算添加回收率和相對標準偏差。6 種玉米赤霉烯酮類毒素在牛奶中的添加回收率為91.8%～114.5%，相對標準偏差在3.2%～14.4%之間，結果見表4。

表4 準確性和精密度實驗結果Table 4 Accuracy and precision of the method

2.8 實際樣品分析結果

應用本方法測定56 份市售牛奶樣品，結果發(fā)現(xiàn)，實際樣品中檢出β-ZAL、α-ZOL，含量在0.2～2.3 μg/kg之間。圖6為陽性牛奶樣品中檢出的2 種玉米赤霉烯酮類毒素的MRM色譜圖。

圖6 實際樣品的MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatogram of real milk sample

3 結 論

本研究建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS對牛奶中6 種玉米赤霉烯酮類毒素的檢測方法。對提取液、凈化條件等方面進行優(yōu)化，最終選取1%乙酸-乙腈作為提取液，PSA-C18-無水硫酸鎂（質量比3∶4∶4）凈化提取液，

HPLC-MS/MS檢測，基質匹配外標法定量，該方法具有簡單、快速、靈敏度高、降低基質干擾等優(yōu)勢，可推廣用于動物性食品中6 種玉米赤霉烯酮類毒素的檢測。