超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量的不確定度評(píng)定

李 靜，張居舟*，余曉娟，劉 毅

（安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051）

豆芽因其烹飪方式不拘一格、營(yíng)養(yǎng)豐富，且生產(chǎn)不受節(jié)令變化、區(qū)域限制而成為老百姓喜愛(ài)的家常菜。然而，一些不法商販為牟取高額利潤(rùn)，在豆芽生產(chǎn)過(guò)程中濫用人工合成化學(xué)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，企圖縮短豆芽生長(zhǎng)周期，提高發(fā)芽率，增加芽菜顏值等，以致“毒豆芽”“問(wèn)題豆芽”事件層出不窮[1-9]。添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要為多效唑、吲哚乙酸和吲哚丁酸等，長(zhǎng)期食用會(huì)影響人體內(nèi)分泌和代謝平衡等[9-11]。為確保食用安全，我國(guó)已明令禁止赤霉素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不再作為食品加工助劑，而多效唑等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑則被列為農(nóng)藥范疇，嚴(yán)格控制其殘留量[12-13]。由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑品種繁多，化學(xué)性質(zhì)和生物特性各異，殘留水平較低，基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重，為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，須進(jìn)行測(cè)量不確定度的評(píng)定。目前僅有6-芐基腺嘌呤的非標(biāo)準(zhǔn)方法的不確定度報(bào)道[14]，而多效唑等指定方法標(biāo)準(zhǔn)的不確定度研究尚處于空白。

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，其數(shù)值的大小反映了測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的高低，并直接與檢驗(yàn)結(jié)果的合格判定相關(guān)[15-21]。本實(shí)驗(yàn)參照J(rèn)JF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[22]和JJF 1135—2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[23]，通過(guò)BJS 201703《豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的測(cè)定》[24]評(píng)定豆芽中多效唑、吲哚乙酸和吲哚丁酸3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量檢測(cè)的不確定度，以期為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確、可信的依據(jù)，同時(shí)為測(cè)量其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量的不確定度評(píng)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豆芽 市購(gòu)。

吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）、多效唑標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）上海市農(nóng)藥研究所。

1290-6495型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；移液器 美國(guó)Gilson公司；XS4002S型電子天平 瑞士梅特勒公司。

其余試劑、材料和設(shè)備參見(jiàn)BJS 201703的要求。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

按照BJS 201703的要求提取后，取上層乙腈溶液5 mL置于QuEChERS離心管（含300 mg無(wú)水硫酸鎂和100 mg C18）中，渦旋2 min，以14 000 r/min離心5 min，精密移取4 mL上清液于離心管中，于45 ℃水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，渦旋混勻，離心5 min，0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.2.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，維持10% B；1～3 min，10% B線性變至60% B；3～5 min，60% B線性變至90% B；5～7 min，維持90% B；7～7.1 min，線性變至10% B。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓3 000 V；干燥氣溫度230 ℃；干燥氣流速18 L/min；鞘氣溫度320 ℃；鞘氣流速12 L/min；噴嘴電壓500 V；霧化氣壓力30 psi。主要質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Main mass spectrometric parameters for three plant growth regulators

1.2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

按照BJS 201703的測(cè)定方法及結(jié)果計(jì)算，待測(cè)物的含量按（1）式計(jì)算：

式中：X為試樣中待測(cè)組分的含量/（μg/kg）；C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中讀出的試樣溶液中待測(cè)組分的質(zhì)量濃度/（μg/L）；V為試樣溶液最終定容體積/mL；f為試樣制備過(guò)程中的稀釋倍數(shù)，本方法中為5；m為稱樣量/g。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線由最小二乘法進(jìn)行線性擬合而成，外標(biāo)法定量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以峰面積計(jì)算得到待測(cè)組分的質(zhì)量濃度。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、體積量取等影響不確定度的相關(guān)因素之間采取多元回歸分析，確定多個(gè)變量的因果關(guān)系，建立預(yù)測(cè)的數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來(lái)源分析

圖1 3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不確定度來(lái)源Fig. 1 Uncertainty sources for determination of three plant growth regulators

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定過(guò)程，對(duì)豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量的測(cè)定結(jié)果有影響的各種不確定度的分量進(jìn)行分析，具體引入的不確定度來(lái)源如圖1所示。

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 試樣稱量產(chǎn)生的不確定度u（m）

使用去皮稱量，稱取10.00 g豆芽樣品，天平校準(zhǔn)證書(shū)說(shuō)明最大允許誤差為±0.01 g，假設(shè)按矩形分布[15]，其不確定度u（m）=0.01/ =0.0058 g；urel（m）=u（m）/m=0.000 58。

2.2.2 體積量取產(chǎn)生的不確定度u（V）

2.2.2.1 提取液總體積引入的不確定度u（V1）

用20 mL單標(biāo)吸量管移取V1為20 mL 1%甲酸的乙腈提取液，按A類評(píng)定，其體積允差為±0.03mL，假設(shè)按矩形分布，其不確定度u（V1-1）=0.03/ =0.017 32mL；若溫度允差為±5 ℃，則溫度變化引起的不確定度u（V1-2）=。故u=0.0 8 0 9 m L，urel（V1）=u（V1）/V1=0.004 0。

2.2.2.2 濃縮體積引入的不確定度u（V2）

用5 mL分度吸量管移取V2為4 mL 1%甲酸的乙腈凈化液進(jìn)行濃縮，按A類評(píng)定，其體積允差為±0.025 mL，假設(shè)按矩形分布，其不確定度u（V2-1）=0.025/ =0.014 43 mL；若溫度允差為±5 ℃，則溫度變化引起的不確定度u（V2-2）=4×5×0.015 82mL。故u（V2）0.015 8 mL，urel（V2）=u（V2）/V2=0.004 0。

2.2.2.3 最終定容體積引入的不確定度u（V3）

試樣凈化液經(jīng)氮吹濃縮后，用1 mL單刻度吸量管移取V3為1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，按A類評(píng)定，其體積允差為±0.007 mL，假設(shè)按矩形分布，其不確定度u（V3-1）==0.004 04 mL；若溫度允差為±5 ℃，則溫度變化引起的不確定度u（V3-2）==1×5×1.1×故=0.005 1 mL，urel（V3）=u（V3）/V3=0.005 1。

2.2.3 待測(cè)物引入的不確定度

待測(cè)物（C）的不確定度來(lái)源由兩個(gè)因素組成，即標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制和由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)所產(chǎn)生的不確定度。其中標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制包括儲(chǔ)備液配制、稀釋及標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制3 個(gè)部分[25-28]。

2.2.3.1 儲(chǔ)備液配制過(guò)程引入的不確定度u（C1）

由標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)可知，吲哚乙酸、吲哚丁酸及多效唑標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)不確定度均為urel（C1）=0.040 0。

2.2.3.2 儲(chǔ)備液稀釋過(guò)程引入的不確定度u（C2）

分別用1 mL單標(biāo)線吸量管移取1 mL吲哚乙酸和吲哚丁酸儲(chǔ)備液、用0.2 mL分度吸量管移取0.2 mL多效唑儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得到吲哚乙酸和吲哚丁酸為1 μg/mL、多效唑?yàn)?.2 μg/mL質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照矩形分布處理，參考GB/T 12806—2011《實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器 單標(biāo)線容量瓶》[29]和JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》的要求[30]，按A類評(píng)定，玻璃器皿及溫度波動(dòng)引入的不確定度見(jiàn)表2；則儲(chǔ)備液稀釋過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度吲哚乙酸和吲哚丁酸按urel計(jì)算，多效唑按

表2 儲(chǔ)備液稀釋過(guò)程中引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from dilution of stock solution

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過(guò)程產(chǎn)生的不確定度u（C3）

表3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過(guò)程引入的不確定度Table 3 Uncertainty resulting from preparation of standard solution

使用20、100、200 μL移液器分別移取10、20、50、100、200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 mL容量瓶中，用空白豆芽基質(zhì)溶液定容至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，其中多效唑的質(zhì)量濃度為2、4、10、20、40 μg/L。移液器的刻度誤差參考JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》的要求[31]，按A類評(píng)定，如表3所示。則標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度u（C4）

將空白豆芽基質(zhì)溶液配制的5 種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，各取5 μL分別重復(fù)進(jìn)樣3 次，以峰面積（Ai）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（Ci）為橫坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合而成的線性回歸方程為Ai＝aCi+b，測(cè)定數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果如表4。取一陽(yáng)性樣品，對(duì)各待測(cè)化合物濃度C0進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表5，則由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度按（2）式計(jì)算：

式中：SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)物峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；a為斜率；b為截距；p為對(duì)樣品溶液C0的測(cè)定次數(shù)，p＝3；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中5 個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定3 次，n＝5×3＝15；Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的待測(cè)物的峰面積；Ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的待測(cè)物的質(zhì)量濃度；C0為校準(zhǔn)方程求得的陽(yáng)性樣品溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度；

為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C4）＝u（C4）/C0，結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 4 Results of standard curves

表5 陽(yáng)性樣品測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of determination of positive samples

表6 曲線擬合引入的不確定度相關(guān)量Table 6 Calculation of uncertainty resulting from curve fitting

2.2.4 重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度u（X）

在空白豆芽試樣中添加水平為7.5 μg/kg多效唑和25 μg/kg吲哚乙酸及吲哚丁酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定10 次。將重復(fù)測(cè)定的含量平均值X、標(biāo)準(zhǔn)偏差S（X）結(jié)果分別代入公式u（X）＝u（X）/X）＝S（X）/ 和urel（X，由重復(fù)性引入的不確定度和相對(duì)不確定度結(jié)果如表7所示。

表7 豆芽中吲哚乙酸、吲哚丁酸和多效唑的測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of determination of indole-3-acetic acid,3-indolebutyric acid and hydrochloride in bean sprouts

2.2.5 回收率產(chǎn)生的不確定度u（R）

測(cè)量回收率結(jié)果列于表7，按A類評(píng)定，將平均回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差S（R）的結(jié)果分別代入公式u（R）＝（R）＝u（R）/R，則得到回收率引入的不確定度和相對(duì)不確定度。

2.3 合成不確定度

3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的相對(duì)不確定度分量見(jiàn)表8，若不考慮各不確定度的相關(guān)性，則其合成不確定度按公式計(jì)算。

表8 3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑相對(duì)不確定度分量Table 8 List of relative uncertainty components for three plant growth regulators

2.4 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

依據(jù)CNAS-GL006：2018《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[15]，在95%置信區(qū)間，對(duì)于大多數(shù)測(cè)量選擇包含因子k＝2，則擴(kuò)展不確定度由此得到豆芽中3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量的結(jié)果，詳見(jiàn)表9。

表9 3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不確定度評(píng)定結(jié)果Table 9 Uncertainty evaluation for the determination of three plant growth regulators

3 結(jié) 論

從豆芽中3 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的測(cè)量不確定度評(píng)定過(guò)程可知，實(shí)驗(yàn)的前處理、質(zhì)譜測(cè)定、數(shù)據(jù)處理等過(guò)程均會(huì)引入不確定度。本研究系統(tǒng)深入地對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋、實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度、玻璃器皿、重復(fù)性、回收率、樣品稱量、體積量取等因素進(jìn)行綜合考量，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程引入的不確定度最大，其次是重復(fù)性、回收率和體積量取，而樣品稱量引入的不確定度可忽略不計(jì)。因此，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，可采取增加標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和平行樣品的測(cè)定次數(shù)，保持超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀良好的穩(wěn)定性和較高的靈敏度，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定期開(kāi)展期間核查，對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)或檢定，提升實(shí)驗(yàn)員的操作水準(zhǔn)等途徑，以減小測(cè)量的不確定度，從而確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。