超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中草甘膦和草銨膦的殘留量

楊 梅，孫 思，劉文鋒，王安波，潘承丹，汪 儉*

（黔東南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，貴州 凱里 556000）

草甘膦是世界上應用最廣、生產(chǎn)量最大的除草劑，其作為無選擇類除草劑，以其高效、低毒、廉價等特性被廣泛運用于全球各個農(nóng)業(yè)和非農(nóng)業(yè)領域[1]。草銨膦可以有效去除絕大部分耐草甘膦雜草，且具有環(huán)保易降解等特點而受到各界青睞。近年來由草甘膦引起的水體污染、植被破壞、牲畜中毒等案件持續(xù)增加[2-3]。隨著其在茶葉上的運用日益加劇，其殘留問題也越來越受關注，為此，世界各國均對茶葉中草甘膦和草銨膦的最大殘留限量制定了嚴格的規(guī)定。歐盟規(guī)定茶葉中草甘膦[4]和草銨膦的最大殘留限量分別為2.0 mg/kg和0.1 mg/kg，日本肯定列表制度對茶葉中草甘膦和草銨膦的最大殘留限量為1.0 mg/kg和0.3 mg/kg，我國GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定茶葉中草甘膦和草銨膦的最大殘留限量分別為1.0 mg/kg和0.5 mg/kg。

草甘膦和草銨膦的結(jié)構類似，具有強極性、難溶于各種有機溶劑的特點，這也就決定了對其殘留量進行準確定量分析難度較大，目前主要的檢測方法有免疫技術法[5-6]、氣相色譜法[7-8]、高效液相色譜法[9]、離子色譜法[10-13]、毛細管電泳法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[17-22]，但大部分方法存在靈敏度低、操作程序繁瑣、有機試劑污染嚴重等缺點，也難以直接運用于茶葉農(nóng)殘檢測領域。目前國內(nèi)外利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測茶葉中草甘膦和草銨膦殘留的方法報道較少，我國目前尚無茶葉中檢測草銨膦的國家標準，而GB 2763—2016中所推薦的茶葉中草甘膦的檢測標準SN/T 1923—2007《進出口食品中草甘膦殘留量的檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》實際運用時步驟繁瑣、耗時長，回收率不穩(wěn)定，定量限偏高。因而亟待建立一種實用且快速檢測草甘膦和草銨膦的分析方法。考慮到超高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法的高靈敏度、高效率、精確性[23-24]，本研究采用NaOH溶液提取樣品中的草甘膦和草銨膦殘留，提取液經(jīng)氯甲酸（9-芴甲基）酯（9-fluorenylmethyl chlorformate，F(xiàn)MOC-Cl）衍生反應后，用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，采用外標法定量，建立茶葉中草甘膦和草銨膦藥物殘留的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉 市購；草甘膦（C5H18N3O4P，CAS號：77182-82-2，純度≥99.3%）、草銨膦（C5H18N3O4P，CAS號：1071-83-6，純度≥99.3%） 北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；FMOC-Cl（純度≥99%） 北京百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Tedia公司；甲酸銨（質(zhì)譜純） 美國Fisher Scientific公司；N-丙基乙二胺（N-(n-propyl) ethyenediamine，PSA，粒度40 μm） 美國Supelco Analytical公司；氫氧化鈉（分析純） 成都金山化學試劑有限公司；鹽酸（36%～38%，優(yōu)級純） 西隴科學股份有限公司；硼酸鈉（Na2B4O7?10H2O，純度≥99.5%） 天津市永大化學試劑有限公司；超純水。

1.2 儀器與設備

UPLC H-Class/TQ-S Micro超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；氮氣發(fā)生器 英國Peak公司；H2050R高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SCQ-151104E超聲波清洗器 上海聲彥超聲波儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩箱江蘇科析儀器有限公司；DH500B II電熱恒溫培養(yǎng)箱天津市泰斯特儀器有限公司；VORTEX2渦旋振蕩儀德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

草銨膦、草甘膦標準儲備溶液（1.0 mg/mL）：分別精確稱取草銨膦、草甘膦標準品各1 0.0 mg于10 mL容量瓶中，用水溶解后定容10 mL。放置于0～4 ℃冰箱，有效期6 個月。

草銨膦、草甘膦標準中間工作溶液（10.0 μg/mL）：分別吸取0.1 mL草銨膦、草甘膦標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，用水定容至10 mL。放置于0～4 ℃冰箱，有效期1 個月。

草銨膦、草甘膦混合標準工作溶液（1.0 μg/mL）：分別吸取1.0 mL草銨膦、草甘膦標準中間工作溶液于10 mL容量瓶中，用水定容10 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 樣品制備

將茶葉樣品放入粉碎機中粉碎，樣品全部過425 μm的標準網(wǎng)篩，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標明標記，于－18 ℃保存。

1.3.2.2 樣品提取

精密稱?。?±0.01）g試樣，置于50 mL離心管中，加入10 mL 0.05 mol/L NaOH溶液，渦旋混勻1 min；室溫水浴振蕩提取20 min，經(jīng)10 000 r/min離心5 min，上清液用濾紙過濾至10 mL離心管中得提取液I；取2 mL提取液I加入1 mol/L HCl溶液20 μL，渦旋混勻后10 000 r/min離心5 min得提取液II，將提取液II倒入預先稱好0.2 g PSA的10 mL離心管中，并立即渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min得提取液III。取1 mL的提取液III置于10 mL離心管中，加入0.2 mL的硼酸鈉緩沖溶液（50 g/L），搖勻后再加入0.2 mL FMOC-Cl（20 g/L）衍生試劑，渦旋混勻振搖后置37 ℃靜置過夜，衍生后的樣品經(jīng)10 000 r/min離心5 min后，過水系濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；樣品溫度20 ℃；流動相：A為5 mmol/L甲酸銨-甲醇溶液，B為5 mmo/L甲酸銨溶液；梯度洗脫模式；流速0.4 mL/min；進樣量1 μL。洗脫程序參見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源；正離子掃描，多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氣氮氣流速1 000 L/h，離子源溫度150 ℃，錐孔氣流量50 L/h，毛細管電壓3.0 kV，碰撞氣為氬氣。 其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測試重復平行實驗6 次，數(shù)據(jù)在Waters公司的MassLynx V4.1軟件下采集，采用MassLynx V4.1SCN945處理方法對檢測結(jié)果進行定性定量處理分析和并采用Origin 9.0進行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑和提取方式的選擇

草甘膦和草銨膦極性較大且易溶于水，難溶于大多數(shù)有機溶劑，因此常采用強極性溶劑進行提取，如水[25]、水-二氯甲烷[19]、0.2%甲酸-水（0.2∶99.8，V/V）[26]和氫氧化鉀[4]等，本研究比較水、水-二氯甲烷、0.2%甲酸-水、0.05 mol/L氫氧化鉀、0.05 mol/L氫氧化鈉5 種溶劑提取，每種提取溶劑進行6 個平行實驗，以平均值作為結(jié)果進行判斷；結(jié)果表明氫氧化鈉提取效果最好，可能是在堿性環(huán)境下，草甘膦等會反應生成效應的鹽，可提高其溶解率，而且茶多酚更易氧化生成沉淀，已達到凈化的目的[4]。因此提取試劑選擇氫氧化鈉溶液提取，見圖1。

圖1 提取溶劑的選擇Fig. 1 Selection of extraction solvent

提取效率方面，采用空白樣品加標（1 mg/kg）的方法比較超聲提取、靜置提取和振蕩提取3 種提草甘膦和草銨膦取方式的提取效果，每種提取方法進行6 個平行實驗，取平均值作為結(jié)果判斷，結(jié)果表明提取效率振蕩提?。境曁崛。眷o置提?。淮送庠谡袷幪崛〉那疤嵯?，采用不同濃度的氫氧化鈉溶液（0.01～0.1 mol/L）提取樣品，0.05 mol/L氫氧化鈉提取效果最佳，見圖2。

圖2 提取溶劑氫氧化鈉溶液濃度優(yōu)化Fig. 2 Optimization of NaOH concentration

2.1.2 HCl濃度的優(yōu)化

圖3 HCl溶液濃度的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of HCl concentration

采用空白樣品加標（1 mg/kg）的方式，樣品采用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液提取，取提取液I 2 mL于10 mL離心管中，加入20 μL 0～10 mol/L不同濃度HCl溶液調(diào)節(jié)酸度，按照1.3.2節(jié)提取，每個濃度重復6 次，取平均值作為結(jié)果進行判斷。如圖3所示，提取液I未加HCl溶液時，回收率在50%左右，同時雜峰相對較多，而當HCl溶液添加濃度為1 mol/L時，回收率最高，在92%左右。原因可能是HCl打破了原有茶湯中的電解質(zhì)平衡，在離子效應、電解質(zhì)作用和共沉效應等共同作用下，茶多酚、氨基酸、糖類等聚合成大分子物質(zhì)形成絡合物而沉淀凈化效果提高[27]。因此選擇1 mol/L HCl溶液。

2.1.3 凈化條件優(yōu)化

樣品0.05 mol/L氫氧化鈉提取，經(jīng)1 mol/L HCl溶液處理后，取2 mL提取液II空白加標（0.1 μg/mL），經(jīng)不凈化、0.2 g PSA、0.2 g C18凈化粉、QuEChERS法、HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱凈化，按照1.3.2節(jié)方法衍生，每種凈化條件進行6 個平行實驗，取平均值作為結(jié)果判斷，結(jié)果如圖4所示。樣品經(jīng)0.2 g PSA凈化后，有效去除樣品中的色素以及雜質(zhì)，其回收率較其余幾種凈化效果好，回收率達95%左右，凈化效果最好且操作簡單、節(jié)省時間，適合大批量樣品檢測。因此采取0.2 g PSA對樣品進行凈化。

圖4 凈化條件選擇Fig. 4 Selection of clean-up sorbent

空白樣品經(jīng)1.3.2節(jié)方法提取后，得提取液II，采用空白提取液加標（0.1 μg/mL）的方式進行，添加0～0.5 g PSA，凈化衍生后上機檢測。比較不同用量PSA對凈化效果的影響，結(jié)果如圖5所示。當用量為0.2 g時，回收率最高，94%左右，繼續(xù)添加用量則無明顯變化，因此PSA用量選擇0.2 g。

圖5 PSA用量優(yōu)化Fig. 5 Optimization of PSA dosage

2.1.4 衍生條件優(yōu)化

空白樣品經(jīng)1.3.2節(jié)發(fā)法提取后，得提取液III，采用空白提取液加標（0.1 μg/mL）的方式進行，添加0.2 mL 20～100 g/L硼酸鈉緩沖溶液，加入0.2 mL FMOC-Cl（20 g/L）衍生后上機檢測，比較不同濃度硼酸鈉緩沖溶液對衍生效果的影響，每種衍生條件進行6 個平行實驗，取平均值作為結(jié)果判斷，結(jié)果如圖6所示。當添加質(zhì)量濃度為50 g/L時，回收率最高，96%左右。同樣采用空白提取液加標（0.1 μg/mL）的方式，加入0.2 mL 50 g/L硼酸鈉緩沖溶液，再加入質(zhì)量濃度5～50 g/L FMOC-Cl衍生試劑，比較不同濃度FMOC-Cl對衍生效果的影響，結(jié)果如圖7所示，衍生試劑質(zhì)量濃度為20 g/L時，衍生效果最好，回收率達96%左右。

圖6 硼酸鈉緩沖溶液質(zhì)量濃度優(yōu)化Fig. 6 Optimization of concentration of Na2B4O7·10H2O

圖7 FMOC-Cl質(zhì)量濃度優(yōu)化Fig. 7 Optimization of FMOC-Cl concentration

圖8 25 ℃（a）和37 ℃（b）條件下衍生時間的優(yōu)化Fig. 8 Optimization of derivatization time at 25 (a) and 37 ℃(b)

提取液加標（0.1 μg/mL）的方式進行，比較不同衍生時間對衍生效果的影響。分別比較37 ℃衍生2、4、8、12、16、20 h和25 ℃衍生2、4、8、12、16、20 h，每個衍生時間進行6 個平行實驗，取平均值作為結(jié)果判斷，結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明37 ℃衍生過夜（12 h以上）效果最好，回收率達95%以上，之后時間增長也無明顯增加，因此衍生時間為37 ℃衍生過夜（12 h以上）。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

分別采用Waters ACQUITY UPLC BEH C8、Waters ACQUITY UPLC BEH C18、Waters ACQUITY UPLC HSS T3進行分析，發(fā)現(xiàn)Waters ACQUITY UPLC BEH C8不適合草甘膦和草銨膦的分析；采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18分析時，目標峰與雜峰出現(xiàn)部分重疊，分離差，且存在拖尾比較嚴重，因此也不適用于草甘膦和草銨膦的分析；而采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3分析時，目標峰與雜峰完全分離，峰形較好，無拖尾現(xiàn)象，因而選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3進行分析。

2.2.2 流動相的優(yōu)化

此外，還比較甲醇-水、甲醇-5mmo/L甲酸銨溶液、乙腈-水、乙腈-5 mmo/L甲酸銨溶液、甲醇-5mmo/L甲酸銨溶液、乙腈-5mmo/L甲酸銨溶液、5 mmol/L甲酸銨/甲醇-5 mmo/L甲酸銨溶液、5 mmol/L甲酸銨/乙腈-5 mmo/L甲酸銨溶液對目標物的色譜峰及離子化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mmol/L甲酸銨/甲醇-5 mmo/L甲酸銨溶液作為流動相對2種化合物的分離度較好，峰形較好，且目標化合物的響應較高，于溶劑中加甲酸銨有利于目標化合物離子化，從而提高靈敏度，所以選擇5 mmol/L甲酸銨/甲醇-5 mmo/L甲酸銨溶液作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將2 種藥物用超純水分別配成300 μg/L的標準溶液1.0 mL，依次加入0.2 mL硼酸鈉緩沖溶液（50 g/L）和0.2 mL FMOC-Cl（20 g/L）進行衍生，衍生后經(jīng)高速冷凍離心機離心后過0.22 μm濾膜，不經(jīng)色譜柱，采用電噴霧離子源的正離子模式掃描，MRM模式，直接質(zhì)譜進樣，進行母離子掃描和子離子掃描，通過自動和手動,調(diào)諧相結(jié)合，優(yōu)化二級碎片離子信息，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量，獲得定性離子和定量離子最佳質(zhì)譜條件，具體見表2。

2.4 基質(zhì)效應和標準曲線繪制

基質(zhì)效應（matrix effect，ME）指樣品中的其他成分對待測物測定值的影響，即基質(zhì)對分析方法準確測定分析物的能力的干擾。根據(jù)基質(zhì)對檢測信號響應值的不同影響，基質(zhì)效應可分為基質(zhì)增強效應和減弱效應。由于草甘膦和草銨膦的極性很大，實驗采取堿溶液進行提取，提取過程中被提取出來的有機或無極分子（如無機鹽、酚類、色素和脂類），還有前處理過程中引入的緩沖鹽、衍生劑和溶解液等[19]。采用提取后添加法[28]，通過比較以水為溶劑和以空白提取液為溶劑分別配制0.005、0.010、0.050、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 μg/mL的配制系列標準溶液，按照1.3.2節(jié)處理，以標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。比較基質(zhì)與空白溶劑標準曲線的斜率，從而評估二者的基質(zhì)效應。由表3可知，2種藥物質(zhì)量濃度在0.005～0.50 μg/mL范圍內(nèi)時，各標準曲線相關系數(shù)（R2）均大于0.995，見表3。0.10 μg/mL的純水標液和空白基質(zhì)衍生后的色譜圖見圖9。

表3 2 種化合物的線性方程、相關系數(shù)、加標回收率、相對標準偏差=10）和基質(zhì)效應Table 3 Linear equations, correlation coeffificients, spiked recoveries,relative standard deviations (RSDs) and matrix effect for analytes ( = 10)

圖9 化合物離子流色譜圖Fig. 9 Total ion current chromatograms for GLY and GLUF from samples

基質(zhì)效應/%=（空白基質(zhì)標曲的斜率-溶劑標曲的斜率）/溶劑標曲的斜率×100[29-30]。│ME│＜0，表明基質(zhì)的存在抑制了目標化合物的響應值；ME=0，表明基質(zhì)的存在對該目標化合物的響應無影響；ME＞0，說明基質(zhì)的存在增強了目標化合物的響應?；|(zhì)效應按其絕值大小可分為3個等級[31-32]：│ME│＞50%，為強基質(zhì)效應；20%＜│ME│≤50%，為中等強度基質(zhì)效應；0%＜│ME│≤20%，為弱基質(zhì)效應。從基質(zhì)標與溶劑標的響應相差很大，基質(zhì)效應比較明顯。從表3可以看出，草甘膦、草銨膦ME值＜0，意味著基質(zhì)的存在抑制了目標化合物的響應值；當添加量為1 mg/kg時，采用溶劑標曲計算該方法提取2 種化合物回收率在中為51.2%～70.7%，而基質(zhì)匹配標曲計算該方法提取2 種化合物的回收率為88.2%～96.6%，可知草甘膦、草銨膦均為中等強度基質(zhì)效應，因此采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量測定。

2.5 準確度和精密度實驗結(jié)果

采用基質(zhì)匹配標準溶液-外標法定量，取茶葉空白樣品基質(zhì)（1±0.01）g，分別添加3 個水平的草甘膦和草銨膦化合物，加標量0.08、0.10、1.0、2.0 mg/kg和4.0 mg/kg，按照1.3.2節(jié)的方法進行操作，每個加標水平重復10 次，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，綠茶空白基質(zhì)樣品在0.08、0.10、1.0、2.0 mg/kg和4.0 mg/kg 5 個添加量的草甘膦和草銨膦化合物，進行添加回收加標實驗，草甘膦的回收率為75.6%～95.2%，相對標準偏差為3.24%～8.38%（n=10），草銨膦的回收率為76.0%～96.6%，相對標準偏差為3.05%～7.85%（n=10）。說明該方法對茶葉中草甘膦和草銨膦化合物藥物殘留的測定均有良好的準確度和精密度，符合殘留分析的要求。

2.6 檢出限和定量限測定結(jié)果

采用不含草甘膦和草銨膦的空白基質(zhì)樣品提取液逐級稀釋草銨膦和草甘膦標準溶液，當定量離子對和定性離子對的信噪比為3時所對應的草銨膦和草甘膦的含量為0.05 mg/kg，當信噪比為10時，所對應的草銨膦和草甘膦含量為0.08 mg/kg，選擇符合一定的準確度和精密度要求的最低濃度，采用加標回收進行驗證。實驗結(jié)果見表3，因此2 種藥物的檢出限為0.05 mg/kg；定量限為0.08 mg/kg。

2.7 樣品測定結(jié)果

采用優(yōu)化后的前處理方法和分析條件對所抽的200 批綠茶樣品進行草甘膦和草銨膦藥物殘留檢測，以保留時間、離子比率進行定性分析，以定量離子對進行定量分析。其中20 批樣品有檢出草甘膦含量依次為0.085～0.65 mg/kg，15 批樣品檢出草銨膦0.12～0.45 mg/kg，均未超過相關規(guī)定限量。

3 結(jié) 論

本研究是采用氫氧化鈉溶液 提取樣品中的草甘膦和草銨膦藥物殘留，HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，經(jīng)PSA凈化，F(xiàn)MOC-Cl衍生化，正離子MRM測定，外標法定量。優(yōu)化后的方法提取效率高、凈化效果好，提高工作效率。方法能對茶葉中的草甘膦和草銨膦藥物殘留進行定性和定量分析，方法具有較高的回收率、良好的精密度、較高準確度，選擇性好，操作快速、簡便，滿足實際工作需求。