表面增強拉曼散射技術(shù)對白酒中克百威殘留的定性檢測

譚文淵，陳雨琴，付大友，王壽峰，明紅梅

（四川理工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

酒精飲品的釀制原料來源于農(nóng)產(chǎn)品，可能因農(nóng)產(chǎn)品中含有少量氨基甲酸酯類農(nóng)藥而被引入。氨基甲酸酯類農(nóng)藥是在20世紀(jì)50—60年代發(fā)展起來的有機合成殺蟲劑[1-3]。該類農(nóng)藥是一類以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來的農(nóng)藥，其結(jié)構(gòu)特性是分子中含有一個N-甲基基團(tuán)，具有選擇性強、分解快、殘留期短、低毒、高效等特點，代表品種有克百威、西維因、涕滅威、葉蟬三、巴沙等，這些農(nóng)藥能誘發(fā)良性或惡性腫瘤，特別是肺癌與肝癌[4-7]。隨著人們對食品安全越來越廣泛的關(guān)注，對酒精飲料中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的測定研究具有極為重要的意義。

目前農(nóng)殘含量的測定方法中高效液相色譜法是檢測氨基甲酸酯類農(nóng)殘的傳統(tǒng)方法[8]，但紫外檢測器不夠靈敏。由于在普通拉曼光譜測量中，一般物質(zhì)分子的信號很微弱，使其應(yīng)用受到限制。表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）技術(shù)可使普通拉曼信號增強，SERS作為一種靈敏度高的定性分析技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到工業(yè)控制、生物傳感器及食品分析檢測領(lǐng)域，符合快速檢測的要求[9-16]。本研究采用SERS技術(shù)對白酒中的克百威殘留進(jìn)行定性檢測，該方法快速、簡便、結(jié)果可靠[17-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 種酒精飲料，均購買自四川省自貢市沃爾瑪超市，1號：乙醇體積分?jǐn)?shù)58%（產(chǎn)地北京）；2號：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%（產(chǎn)地上海）；3號：乙醇體積分?jǐn)?shù)43%（產(chǎn)地上海）。

氯金酸（HAuCl4·3H2O） 上海精細(xì)化工材料研究所；檸檬酸三鈉（NaC6H2O7） 重慶北碚化學(xué)試劑廠；抗壞血酸 重慶川東化工試劑廠；克百威 國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心（沈陽）；2,6-二氯醌-4-氯亞胺 成都市科龍化工試劑廠；實驗中所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計 美國珀金埃爾默公司；激光顯微拉曼光譜儀 賽默飛世爾科技公司；掃描探針顯微鏡日本精工電子株式會社；恒溫磁力攪拌器 上海越眾儀器設(shè)備有限公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；微量進(jìn)樣器 上海佳安分析儀器廠。所有玻璃容器用配制的王水浸泡24 h后，用蒸餾水將其洗凈，再用制得的雙蒸水沖洗兩次后干燥、待用。

1.3 方法

1.3.1 拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置

激發(fā)波長780 nm，分辨率4.7～8.7 cm－1，10 倍物鏡；波長拉曼光譜范圍0～3 200 cm－1，光柵400 gr/mm，功率18 mW，50 μm針孔光柵。

1.3.2 金溶膠的制備及表征

1.3.2.1 金溶膠的制備

將0.85 mL 1%氯金酸溶液加入至100 mL雙蒸水中，劇烈攪拌加熱至沸騰，再加入1.5 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌。加入還原劑25 s左右，反應(yīng)液呈現(xiàn)微弱的藍(lán)色，隨著反應(yīng)的進(jìn)行溶液變?yōu)樽霞t色，隨后停止加熱并繼續(xù)攪拌至溶液冷卻至室溫，得金溶膠（Au NPS），用棕色容量瓶避光于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹19-21]。

1.3.2.2 金溶膠的表征

Au NPS的吸收光譜測量：用紫外分光光度計獲得，掃描波長范圍為300～700 nm。Au NPS的粒徑測量：用掃描探針顯微鏡獲得。Au NPS滴于云母片表面，將其吹干，制成原子力顯微鏡樣本，對其形貌進(jìn)行表征。Au NPS SERS表征：羅丹明B（R6G）是檢驗SERS增強效果常用的染料探針分子，用1×10－4mol/L R6G溶液檢驗Au NPS的SERS增強效果。將R6G溶液與Au NPS以1∶7均勻混合20 min[22-23]。

1.3.3 Au@Ag NPS的制備及表征

1.3.3.1 Au@Ag NPS制備方法

在編號1～6的燒杯中加入10 mL備用的Au NPS作為種子溶液，并取1.5 mL 0.1 mol/L抗壞血酸溶液攪拌均勻，然后在常溫條件下以30 s/drop的速率分別逐滴加入0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mL硝酸銀溶液，同時劇烈攪拌至滴完后30 min，得不同Ag殼厚度的Au@Ag NPS[24-26]。每次用的Au@Ag NPS是實驗前新配制的。

1.3.3.2 Au@Ag NPS表征

Au@Ag NPS的吸收光譜測量：將合成的Au@Ag NPS進(jìn)行吸光度的檢測，掃描波長范圍為300～700 nm。Au@Ag NPS的SERS表征：將1×10－4mol/L R6G溶液依次與1～6不同Ag殼厚度Au@Ag NPS以1∶7均勻混合20 min，測定拉曼譜圖。Au@Ag NPS的背景信號：將雙蒸水與SERS增強效果最好的Au@Ag NPS以1∶7均勻混合20 min，測定拉曼譜圖。Au@Ag NPS的粒徑測量：對SERS表征效果最好的Au@Ag NPS形貌進(jìn)行表征。

1.3.4 克百威的SERS增強的測定

將200×10－6mol/L克百威乙醇溶液與SERS增強效果最好的Au@Ag NPS以1∶7均勻混合20 min，測定拉曼譜圖。

1.3.5 生成絡(luò)合物的實驗條件的測定

1.3.5.1 顯色劑及NaOH用量對拉曼強度的影響

在1～5號的燒杯中各加入1 mL 200×10－6mol/L克百威乙醇溶液，再依次加入5 g/L 2,6-二氯醌-4-氯亞胺0.150、0.200、0.225、0.250、0.275 mL，最后各加入525 μL 0.5 mol/L NaOH溶液。反應(yīng)5 min后，裝樣于核磁管測定拉曼譜圖。在重新編號1～5的燒杯中各加入1 mL 200×10－6mol/L克百威乙醇溶液，0.225 mL 5 g/L 2,6-二氯醌-4-氯亞胺，再依次加入0.5 mol/L NaOH溶液500、525、550、575、600 μL。反應(yīng)5 min后，裝樣于核磁管測定拉曼譜圖。

1.3.5.2 時間對拉曼強度的影響

在裝有0.1 mL的200×10－6mol/L克百威乙醇溶液中加入5 g/L 2,6-二氯醌-4-氯亞胺0.225 mL及0.5 mol/L氫氧化鈉溶液0.525 mL。裝樣于核磁管中，測定反應(yīng)時間為0、5、10、15、20 min的拉曼譜圖。

1.3.6 絡(luò)合物SERS增強實驗條件的測定

1.3.6.1 與絡(luò)合物混合最佳Ag殼厚度的測定

制備出6 種不同Ag殼厚度的Au@Ag NPS，編號1～6。在編號1～6小燒杯中，按生成絡(luò)合物測定的最佳比例加入2,6-二氯醌-4-氯亞胺和氫氧化鈉溶液，待最佳反應(yīng)時間后，按絡(luò)合物與Au@Ag NPS體積比為1∶7依次將1～6 Au@Ag NPS加入1～6小燒杯中。待溶液均勻混合20 min后，裝樣于核磁管測定拉曼譜圖。

1.3.6.2 Au@Ag NPS與絡(luò)合物最佳混合比例的測定

在編號1～6小燒杯中按生成絡(luò)合物測定的最佳比例加入2,6-二氯醌-4-氯亞胺和氫氧化鈉溶液，待最佳反應(yīng)時間后，依次按絡(luò)合物與Au@Ag NPS體積比為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10加入最佳厚度的Au@Ag NPS。待溶液均勻混合20 min后，裝樣于核磁管測定拉曼譜圖。

1.3.6.3 Au@Ag NPS與絡(luò)合物最佳混合時間的測定

在燒杯中按生成絡(luò)合物測定的最佳比例加入2,6-二氯醌-4-氯亞胺和氫氧化鈉溶液，待最佳反應(yīng)時間后，按測定的最佳混合比例加入最佳粒徑的Au@Ag NPS，均勻混合。將裝樣于核磁管中，測定溶液混合5、10、15、20、25、30 min的拉曼譜圖。

1.3.7 克百威檢測下限

將200×10－6mol/L稀釋為不同濃度的克百威乙醇溶液，按生成絡(luò)合物測定的最佳比例加入2,6-二氯醌-4-氯亞胺和氫氧化鈉溶液，待最佳反應(yīng)時間后，按絡(luò)合物的SERS增強最佳測定條件混合，裝樣于核磁管測定拉曼譜，直至得不到拉曼特征峰。

1.3.8 樣品測定

將樣品按生成絡(luò)合物測定的最佳比例加入2,6-二氯醌-4-氯亞胺和氫氧化鈉溶液，待最佳反應(yīng)時間后，按絡(luò)合物的SERS增強最佳測定條件混合，裝樣于核磁管測定拉曼譜圖。

1.3.9 增強因子的計算

表面增強拉曼光譜的增強因子是表征SERS效應(yīng)最重要的數(shù)據(jù)之一，所以表面增強拉曼光譜基底性能的優(yōu)劣可以用增強因子來衡量，增強因子越高，說明表面增強拉曼光譜的增強性能越好。SERS測試的用基于化學(xué)分析的增強因子的計算公式為：

式中：EF為增強因子；ISERS和INR分別為有SERS基底存在的拉曼光譜峰強度和沒有基底存在的普通拉曼光譜峰強度；CSERS和CNR分別為SERS檢測和普通拉曼光譜測試的檢測分子濃度[27]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與圖像處理方法

采用OMNIC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用TQ Analyst?軟件進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)的光譜處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金溶膠的紫外表征圖

新合成的Au NPS及在4 ℃貯存6 d后的Au NPS的紫外-可見光譜圖如圖1所示?？芍潞铣葾u NPS最大吸收峰波長為520 nm，峰值為0.92，峰寬為75 nm，峰寬較窄，說明納米粒子粒徑均勻，分散性好；貯存6 d后的Au NPS最大吸收峰波長為520 nm，峰值為0.906，峰寬75 nm。通過比較，波長沒有變化，未出現(xiàn)紅、藍(lán)移的情況；ΔA=－0.014，變化不大，穩(wěn)定性較好；峰寬較窄且無變化，說明其粒徑分布較好，分散性較好。故制備的Au NPS穩(wěn)定性較好，適合作為制備Au@Ag NPS的種子溶液。

圖1 Au NPS紫外-可見光譜對比圖Fig. 1 UV-vis spectrum of Au NPS

2.2 Au@Ag NPS的表征

2.2.1 Au@Ag NPS的紫外表征

由圖2可知，由于Ag沉積在Au核上，兩者互相影響，導(dǎo)致Au NPS的最大吸收峰（520 nm）發(fā)生了藍(lán)移，隨著Ag殼厚度的增加，代表Ag NPS的最大吸收峰（400 nm左右）逐漸變高，而且也發(fā)生了紅移。

2.2.2 Au@Ag NPS的SERS表征

1×10－4mol/L R6G與6 種不同Ag殼厚度的Au@Ag NPS的SERS增強光譜如圖3所示，每個Ag殼厚度的Au@Ag NPS都能夠得到R6G的特征拉曼峰。增強效應(yīng)最好的是4號Ag殼厚度的Au@Ag NPS。采集1×10－4mol/L R6G溶液及Au NPS與4號Au@Ag NPS對1×10－4mol/L R6G增強效果如圖4所示，因為R6G溶液濃度比較小，所以光譜圖中并沒有得到R6G的特征峰；Au NPS對1×10－4mol/L R6G增強效果不好，Au@Ag NPS增強效果更好，和Au@Ag NPS相比，Au NPS的增強效果幾乎忽略不計。所以本實驗采用Au@Ag NPS粒子作為SERS基底。

圖3 基于不同Ag殼厚度Au@Ag NPS的R6G SERS譜圖Fig. 3 R6G SERS spectra of Au@Ag NPS with different Ag shell thicknesses

圖4 1×10－4 mmooll/L R6G的拉曼譜圖及兩種粒子對R6G的SERRSS譜圖Fig. 4 Raman spectra of 1×10-4 mol/L R6G and SERS spectra of two kinds of nanoparticles

2.2.3 金溶膠及Au@Ag NPS原子力顯微鏡表征

圖5 Au NPS掃描探針顯微圖Fig. 5 Scanning probe micrograph of Au NPS

從圖5可以看出，納米粒子分布均勻，經(jīng)粒徑分析得納米粒子的粒徑均在30 nm左右。將增強效果最好的第4號Au@Ag NPS做原子力顯微鏡表征，其結(jié)果如圖6所示。可以清晰地反映核殼結(jié)構(gòu)，黑色代表Au核，Au核外面的就是銀殼，而且納米粒子分散均勻，經(jīng)粒徑分析，粒徑為37 nm左右，與圖2對比可知增強效果好的Au@Ag NPS的Ag殼厚度為7 nm。

圖6 Au@Ag NPS探針掃描顯微圖Fig. 6 Scanning probe micrograph of Au@Ag NPS

2.3 Au@Ag NPS的背景信號

圖7 Au@Ag NPS拉曼譜圖Fig. 7 Roman spectrum of Au@Ag NPS

由圖7可知，以雙蒸水作為空白的SERS譜圖基本沒有信號，說明制備的Au@Ag NPS對所采集的樣品SERS信號基本上沒有背景信號的干擾。

2.4 克百威的SERS增強

圖8 固體及200×10－6 mol/L克百威普通拉曼譜圖Fig. 8 Ordinary Raman spectra of solid carbofuran and 200 × 10-6 mol/L carbofuran

分別采集固體克百威和200×10－6mol/L克百威乙醇溶液的拉曼光譜圖如圖8所示，固體克百威光譜圖中，得到1 610、1 447、1 268、1 163、1 060、775、548 cm－1這幾個特征峰。而由于200×10－6mol/L克百威乙醇溶液濃度小，所以采集的拉曼光譜圖中并沒有出現(xiàn)特征峰。用2,6-二氯醌-4-氯亞胺將克百威與Au@Ag NPS偶合在一起，先用2,6-二氯醌-4-氯亞胺與克百威生成絡(luò)合物，再將絡(luò)合物與Au@Ag NPS混合在一起，從而將克百威與Au@Ag NPS偶合在一起發(fā)生等離子體共振，得到SERS增強信號[28]。

2.5 絡(luò)合物測定條件的選擇

2.5.1 顯色劑及NaOH用量的選擇

分別測量不同2,6-二氯醌-4-氯亞胺及NaOH用量下絡(luò)合物的拉曼譜圖，以1 180 cm－1左右的拉曼特征峰作為分析的依據(jù)，繪制特征峰強度隨2,6-二氯醌-4-氯亞胺及NaOH用量的變化的曲線圖，由圖9可知，隨2,6-二氯醌-4-氯亞胺用量的改變，2,6-二氯醌-4-氯亞胺用量為225 μL時，特征峰信號最強，故確定1 mL克百威的2,6-二氯醌-4-氯亞胺用量為225 μL。特征峰強度隨NaOH用量的改變而變化，當(dāng)NaOH用量為525 μL時，特征峰信號最強，所以確定1 mL克百威的NaOH用量為525 μL。

圖9 特征峰強度隨顯色劑用量及NaOH用量變化曲線Fig. 9 Effect of dosage of color developer and NaOH on characteristic peak intensity

2.5.2 測定時間的選擇

測量不同時間下絡(luò)合物的拉曼譜圖，根據(jù)測得的光譜圖，以1 180 cm－1左右的拉曼特征峰作為分析的依據(jù)，繪制特征峰強度隨時間的變化如圖10所示。特征峰強度隨著時間的變化發(fā)生了變化，在反應(yīng)5 min時，特征峰強度最大。

圖10 特征峰強度隨時間變化曲線Fig. 10 Time course curve of characteristic peak intensity

2.6 絡(luò)合物SERS增強測定條件的選擇

2.6.1 最佳Ag殼厚度的選擇

由圖11可以看出，與R6G一樣，同樣是第4號7 nm Ag殼厚度的Au@Ag NPS具有最強的拉曼增強效應(yīng)。綜合R6G和絡(luò)合物的SERS結(jié)果，基于Au@Ag NPS的拉曼增強效應(yīng)與Ag殼有關(guān)，則7 nm Ag殼厚度的Au@Ag NPS具有最強等離子體共振而具有最強的SERS效應(yīng)。

圖11 不同Ag殼厚度Au@Ag NPS絡(luò)合物SERS譜圖Fig. 11 SERS spectra of Au@Ag NPS complexes with different thicknesses of Ag shell

2.6.2 最佳比例的選擇

圖12 絡(luò)合物溶液與Au@Ag NPS不同比例混合SERS譜圖Fig. 12 SERS spectra of mixtures of the complex with Au@Ag NPS at different proportions

由圖12可知，隨比例的改變特征峰強度也發(fā)生變化，其中當(dāng)絡(luò)合物溶液與Au@Ag NPS以1∶7的比例混合時，SERS增強效果最好。

2.6.3 最佳時間的選擇

測量絡(luò)合物溶液與Au@Ag NPS混合時間的SERS譜圖，以1 193 cm－1左右的拉曼特征峰作為分析的依據(jù)，繪制特征峰強度隨時間的變化的曲線如圖13所示，隨著時間的延長，特征峰強度先增大再逐漸減小，在20 min時，測得的特征峰強度最大，SERS增強效果最好。

圖13 絡(luò)合物與Au@Ag NPS混合時間變化Fig. 13 Effect of mixing time between Au@Ag NPS and the complex on Raman intensity

2.7 絡(luò)合物SERS增強光譜分析

為了更好地分析絡(luò)合物的特征峰，采集固體2,6-二氯醌-4-氯亞胺的固體拉曼譜圖，固體克百威的拉曼譜圖，按最佳選擇條件生成的絡(luò)合物溶液的拉曼譜圖及其SERS譜圖如圖14所示，絡(luò)合物的主要特征峰有：1 618、1 443、1 347、1 180、1 045、8 68、460、37 cm－1；固體克百威的主要特征峰有：1 610、1 445、1 268、1 170、1 056、775、545 cm－1；固體2,6-二氯醌-4-氯亞胺的主要特征峰有：1 674、1 621、1 512、1 295、913 cm－1，根據(jù)查閱相關(guān)資料[29-30]，可知絡(luò)合物有幾處峰與克百威相似而2,6-二氯醌-4-氯亞胺沒有，如1 443、1 180、1 045 cm－1，所以此化合物能夠用來代表克百威進(jìn)行SERS增強的研究。SERS譜圖峰形尖銳且基線平滑，表明合成的Au@Ag NPS對克百威和2,6-二氯醌-4-氯亞胺生成的絡(luò)合物具有很強的拉曼增強作用。被增強后的主要拉曼峰位于1 570、1 333、1 193、381 cm－1，而且在2 157 cm－1處還出現(xiàn)了新的峰，與非SERS譜圖中1 618、1 347、1 180、370 cm－1幾處對應(yīng)峰相比較可以發(fā)現(xiàn)：出峰的位置發(fā)生了偏移，說明在吸附之后，絡(luò)合物分子的結(jié)構(gòu)信息發(fā)生了一定的改變[31]。

圖14 SERS和普通拉曼譜圖Fig. 14 SERS and normal Raman spectra of the complex

表1 絡(luò)合物，固體克百威，固體顯色劑拉曼譜圖中的峰位歸屬Table 1 Raman peak position assignment of the complex, solid carbofuran and solid color developer

2.8 克百威檢測下限的確定

圖15 不同濃度克百威SERS譜圖Fig. 15 SERS spectra of carbofuran at different concentrations

由圖15可以看出，在1×10－12mol/L時，2 157、1 570、1 193 cm－1這3 個特征峰仍十分明顯，隨著克百威濃度減小，特征峰強度也在不斷減小，濃度低至1×10－18mol/L時完全無信號，1×10－17mol/L時信號極其微弱，SERS譜圖上幾乎無增強信號，所以Au@Ag NPS對克百威的檢測下限為1×10－16mol/L。

2.9 樣品的測定結(jié)果

圖16 酒樣SERS譜圖Fig. 16 SERS spectra of Chinese liquors

由圖16可以看出，3 個酒樣譜圖中均出現(xiàn)克百威與2,6-二氯醌-4-氯亞胺生成的絡(luò)合物特征峰2 162、1 570、1 194 cm－1，說明這3 個酒樣均含有一定量的克百威。

2.10 增強因子的計算

為了確定克百威在Au@Ag NPS中的增強效果，現(xiàn)根據(jù)圖14絡(luò)合物的普通拉曼以及SERS譜圖和圖15不同濃度克百威的SERS譜圖，由于2 157 cm－1的特征峰是新增的，普通拉曼圖中沒有這個峰，1 570 cm－1在固體克百威和2,6-二氯醌-4-氯亞胺中都有相對應(yīng)的特征峰，而1 193 cm－1是克百威有相對應(yīng)的峰但2,6-二氯醌-4-氯亞胺沒有的，所以把1 193 cm－1作為特征峰估計增強因子。表面拉曼增強檢測ISERS為760 AU，CSERS為1×10－12mol/L；普通拉曼檢測INR為844 AU，CNR為2×10－4mol/L。將CSERS、ISERS、CNR、INR代入式（1）進(jìn)行計算，得出制備的Au@Ag NPS對克百威的增強因子為2×108。這說明制備的Au@Ag NPS對克百威的增強效果很明顯。

3 結(jié) 論

本實驗制備的兩種納米粒子：Au NPS、不同Ag殼厚度Au@Ag NPS，通過探測分子R6G比較Au NPS和不同Ag殼厚度Au@Ag NPS的SERS增強效果。結(jié)果表明7 nm Ag殼厚度Au@Ag NPS增強效果最好，可作為SERS增強基底。其次，引入2,6-二氯醌-4-氯亞胺做標(biāo)記物，用2,6-二氯醌-4-氯亞胺將克百威與Au@Ag NPS偶合在一起，在堿性條件下，先將2,6-二氯醌-4-氯亞胺與克百威生成藍(lán)綠色絡(luò)合物，再與Au@Ag NPS混合，對絡(luò)合物進(jìn)行普通拉曼采集以及SERS信號采集最佳條件討論，并對光譜的譜峰進(jìn)行比較和歸屬。最后，用最佳方法對不同濃度克百威-乙醇溶液SERS檢測，得出Au@Ag NPS對克百威的檢測下限為1×10－17mol/L，計算得到Au@Ag NPS增強因子為2×1012。并用此方法檢測3 種酒精飲料中是否含有克百威，結(jié)果表明，3 種酒精飲料均含有一定量的克百威。