不同氧濃度微環(huán)境中腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為變化觀察

馮鵬程，曹奕強(qiáng)，湯蕩，宋海，龍江，王永剛

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外一科，昆明650000

腫瘤微環(huán)境具有低氧、低pH、高壓等特點(diǎn)，在腫瘤的自我更新、分化、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物進(jìn)程中，缺氧微環(huán)境的形成具有顯著影響，酸性代謝產(chǎn)物堆積可導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)中各種細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，并引起治療耐受，導(dǎo)致患者預(yù)后不良［1-2］。了解膠質(zhì)瘤與其所處微環(huán)境的關(guān)系對(duì)于改善膠質(zhì)瘤的治療前景具有重要意義。我們的前期研究顯示，在顱內(nèi)移植神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠中，高壓氧能夠促進(jìn)顱內(nèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和血管生成，抑制細(xì)胞凋亡［3］。既往多數(shù)研究通過(guò)建立低氧或高氧微環(huán)境，認(rèn)為膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、侵襲與氧微環(huán)境密切相關(guān)［4-7］，但缺少低氧與高氧微環(huán)境中膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為變化的對(duì)比。2022年3月—7月，我們通過(guò)模擬細(xì)胞生長(zhǎng)所處的氧微環(huán)境，觀察高氧、低氧、極低氧濃度中U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購(gòu)于昆明動(dòng)物研究所。胎牛血清（美國(guó)Gibco）；青霉素/鏈霉素、胰酶、DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基（大連美倫生物）；CCK-8試劑盒（日本同仁研究所）；結(jié)晶紫（北京索萊寶）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD）；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（江蘇碧云天）；Cell Staining Buffer購(gòu)于（美國(guó)Biolegend）；488標(biāo)記山羊抗兔IgG（武漢賽維爾）；TRIzol試劑盒（美國(guó)Ambion）。CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo），酶標(biāo)板自動(dòng)讀數(shù)儀（美國(guó)BIO-RAD），倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Motic），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD），實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀（美國(guó)Bio-Rad）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取U251細(xì)胞，加入含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度接近80%，進(jìn)行1∶3胰酶消化傳代，取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組與干預(yù)處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化，以3×103/孔接種到96孔板，分為極低氧組、低氧組、常氧組、高氧組，分別置于5%極低氧條件（37 ℃，5% CO2，5% O2）、10.5%低氧條件（37 ℃，5% CO2，10.5% O2）、21%常氧條件（37 ℃，5% CO2，21% O2）、42%高氧條件（37 ℃，5%CO2，42% O2）中培養(yǎng)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。各組分別于第0、24、48、72、96 h取出1塊孔板，棄上清液，每孔加入10 μL CCK-8，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，于450 nm處測(cè)定OD值。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取各組培養(yǎng)72 h的貼壁細(xì)胞，加入0.25% EDTA胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS漂洗，用1× Binding Buffer將細(xì)胞重懸至1×106/mL；轉(zhuǎn)移100 μL細(xì)胞懸液（105個(gè)）至離心管，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min。加入300 μL 1× Binding Buffer，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。使用Flowjo軟件分析流式結(jié)果，F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)?？偟蛲雎?早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.6 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。取各組培養(yǎng)72 h的細(xì)胞，加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基中。將Matrigel膠預(yù)先用培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?00 μL平鋪于Transwell小室底部多聚碳酸膜上，37 ℃干燥過(guò)夜。取5×104/孔細(xì)胞懸液200 μL接種于Transwell上室，500 μL無(wú)血清培養(yǎng)基加入Transwell小室下室。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，待細(xì)胞貼壁更換培養(yǎng)基，上室用PBS清洗后添加無(wú)血清培養(yǎng)基，下室添加含10% FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。取出用甲醇固定10 min，0.4%結(jié)晶紫溶液染色20 min，PBS漂洗。封片，倒置相差顯微鏡（×100）下觀察，分別選取上下左右及中間5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。

1.7 細(xì)胞HIF-1α mRNA檢測(cè) 采用qPCR法。取各組培養(yǎng)72 h的細(xì)胞，用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用CFX96實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀進(jìn)行qPCR反應(yīng)。引物序列：HIF-1α上游5′-AAACAGAGCAGGAAAAGGAG-3′，下游5′-TCAAAGCGACAGATAACACG-3′；GAPDH上游5′-CCCAT-CACCATCTTCCAGG-3′，下游5′-CATCACGCCACAGTTTCCC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 細(xì)胞ROS水平檢測(cè) 采用DCFH-DA熒光探針染色。用無(wú)血清培養(yǎng)液按照1∶1 000稀釋DCFHDA，使其終濃度為10 μmol/L。取各組培養(yǎng)72 h的細(xì)胞，加入稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次，去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。收集細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shaprio-Wilk法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各組細(xì)胞均有不同程度的增殖趨勢(shì)（F=18.651，P＜0.01）。與常氧組比較，極低氧組、低氧組、高氧組在24、48、72、96 h的增殖能力均降低（P均＜0.05）；低氧組在48、72、96 h的增殖能力高于極低氧組和高氧組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況比較（）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況比較（）

注：與常氧組比較，*P＜0.01；與低氧組比較，△P＜0.05。

組別極低氧組低氧組常氧組高氧組細(xì)胞OD值96 h 1.307 ± 0.087*△1.637 ± 0.092*2.666 ± 0.063 1.390 ± 0.097*△0 h 0.372 ± 0.341 0.356 ± 0.020 0.367 ± 0.015 0.364 ± 0.017 24 h 0.592 ± 0.058*0.592 ± 0.037*0.930 ± 0.053 0.612 ± 0.033*48 h 0.804 ± 0.053*△1.206 ± 0.120*1.603 ± 0.097 0.938 ± 0.046*△72 h 1.119 ± 0.110*△1.420 ± 0.043*2.031 ± 0.164 1.169 ± 0.117*△

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較 與常氧組比較，極低氧組、低氧組、高氧組細(xì)胞總凋亡率均升高；與低氧組比較，極低氧組和高氧組細(xì)胞總凋亡率升高（P均＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 不同氧濃度下各組細(xì)胞的凋亡情況（%，）

表2 不同氧濃度下各組細(xì)胞的凋亡情況（%，）

注：與常氧組比較，*P＜0.01；與低氧組比較，△P＜0.01。

組別極低氧組低氧組常氧組高氧組總凋亡率30.87 ± 0.50*△3.49 ± 0.20**2.44 ± 0.31 22.15 ± 1.17*△晚期凋亡率14.10 ± 1.14 1.74 ± 0.05 1.00 ± 0.12 1.78 ± 0.23早期凋亡率16.77 ± 0.75 1.75 ± 0.15 1.45 ± 0.21 20.37 ± 1.26

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較 極低氧組、低氧組、常氧組、高氧組細(xì)胞侵襲數(shù)量分別為（180 ± 24）、（282 ± 24）、（451 ± 31）、（257 ± 30）個(gè)。與常氧組比較，極低氧組、低氧組、高氧組細(xì)胞侵襲數(shù)量均減少（P均＜0.01）；與低氧組比較，極低氧組和高氧組細(xì)胞侵襲數(shù)量減少（P均＜0.05）。

2.4 各組細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較 極低氧組、低氧組、常氧組、高氧組細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)水平分別為1.002 ± 0.073、0.500 ± 0.028、0.209 ±0.001、0.367 ± 0.017。與常氧組比較，極低氧組、低氧組、高氧組細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)水平均升高（P均＜0.01）；與低氧組比較，極低氧組表達(dá)水平升高、高氧組表達(dá)水平降低（P＜0.05或＜0.01）。

2.5 各組細(xì)胞ROS水平比較 極低氧組、低氧組、常氧組、高氧組DCF熒光強(qiáng)度分別為91.17 ± 0.32、9.07 ± 0.28、6.25 ± 0.22、82.33 ± 0.73。與常氧組比較，低氧組、極低氧組、高氧組中細(xì)胞ROS水平均升高（P均＜0.01）；與低氧組比較，極低氧組和高氧組細(xì)胞ROS水平升高，且極低氧組高于高氧組（P均＜0.01）。

3 討論

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前其治療以手術(shù)切除為主，輔以化療和放療等治療。由于大腦對(duì)化療分子耐藥或敏感性差，腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后不良，中位總生存期為14.4個(gè)月［8］。通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞氧微環(huán)境，以HIF及其下游信號(hào)通路為治療靶點(diǎn)，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。氧是包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的各種細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧可抑制裸鼠皮下膠質(zhì)瘤組織生長(zhǎng)［9］；另有研究表明，高壓氧可促進(jìn)小鼠顱內(nèi)移植神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［10］。而微環(huán)境中氧濃度對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響尚缺乏深入研究。在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，由于腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，無(wú)法及時(shí)建立血管網(wǎng)，造成膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)處于缺氧且酸性物質(zhì)積聚的微環(huán)境中［11］。低氧微環(huán)境下的腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)改變代謝、增強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移、激活耐藥基因來(lái)提高適應(yīng)性。

缺氧微環(huán)境中細(xì)胞的增殖和凋亡與缺氧程度有一定的關(guān)聯(lián)。涂蕓琥等［4］研究表明，適度低氧微環(huán)境可促進(jìn)U251細(xì)胞體外生長(zhǎng)。而嚴(yán)重低氧環(huán)境可誘導(dǎo)相關(guān)基因突變，細(xì)胞為了更好地適應(yīng)環(huán)境，會(huì)啟動(dòng)相關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。本研究通過(guò)建立不同氧濃度微環(huán)境下的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在常氧下增殖能力最強(qiáng)，凋亡率最低，侵襲能力最強(qiáng)；而低氧（10.5%氧濃度）條件下較高氧、極低氧細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)更好、凋亡率更低、侵襲力更強(qiáng)；極低氧環(huán)境較低氧環(huán)境細(xì)胞凋亡率升高。這種低氧調(diào)控機(jī)制可能與HIF-1調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)性基因的表達(dá)有關(guān)。在缺氧條件下，HIF-1α被激活并調(diào)控VEGF等轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并刺激細(xì)胞發(fā)生侵襲，還負(fù)責(zé)維持未分化表型的腫瘤細(xì)胞［13］。

研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)暴露于高壓氧環(huán)境中可促進(jìn)顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，抑制細(xì)胞凋亡［14］。本研究結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，高氧組細(xì)胞增殖能力較常氧組減弱；高氧組的總凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率均升高，細(xì)胞更易凋亡；高氧組細(xì)胞侵襲數(shù)量較常氧組減少。以上結(jié)果提示，高氧處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制其增殖和侵襲。膠質(zhì)瘤組織內(nèi)微血管密度的增加、微血管形態(tài)的改變往往在病理評(píng)估上表示惡性侵襲程度增加。STUHR等［9］報(bào)道，高氧環(huán)境能夠抑制大鼠移植膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，經(jīng)高氧干預(yù)后，腫瘤中心平均血管密度明顯降低，腫瘤血管直徑顯著減少，隨之腫瘤的侵襲性也降低。LEE等［15］發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞給予高氧處理后，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化水平下降，c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化水平上升，提示高氧可能通過(guò)JNK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究表明，高氧聯(lián)合化療可有效抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，從而誘導(dǎo)其對(duì)化療再敏感［16］，通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2、O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶等化療抗性相關(guān)蛋白的表達(dá)，提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性。YAHARA等［17］報(bào)道，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者給予增強(qiáng)放療+高氧治療后，其2年平均生存率高于采取常規(guī)療法的患者，提示高氧能夠提高放療對(duì)腫瘤的殺傷作用，從而改善患者預(yù)后。

HIF-1是一種異二聚體蛋白，由β亞基和氧調(diào)節(jié)的α亞基組成。在常氧條件下，特定的脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白以氧和α-酮戊二酸為底物，合成HIF-1α亞基。而在低氧環(huán)境下，缺氧通過(guò)激活PI3K/AKT通路，抑制HIF-1α翻譯后羥基化反應(yīng)或增加ROS的線(xiàn)粒體產(chǎn)生，從而提高HIF-1α的穩(wěn)定性，促進(jìn)其與HIF-1β的二聚化。這種二聚化決定了復(fù)合物的激活和與缺氧反應(yīng)元件序列5-（A/G）CGTG-3的連續(xù)結(jié)合，從而增加轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和耐藥性等過(guò)程［18-19］。本研究結(jié)果顯示，低氧組細(xì)胞ROS水平較極低氧組和高氧組明顯降低；與低氧組比較，呈現(xiàn)極低氧組表達(dá)水平升高、高氧組表達(dá)水平降低兩種變化趨勢(shì)。這是由于高氧暴露往往改善微環(huán)境缺氧，通常增加HIF-1α蛋白降解，導(dǎo)致HIF-1α蛋白水平下降所導(dǎo)致。低氧腫瘤微環(huán)境可能與適度的ROS生成有關(guān)，而高水平的ROS可以干擾HIF-1α調(diào)節(jié)過(guò)程。YOKOE等［20］研究表明，在缺氧時(shí)，HIF-1α可以逃避pVHL的識(shí)別，從而穩(wěn)定存在于缺氧環(huán)境中，并通過(guò)PI3K信號(hào)通路和缺氧激活的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)VEGF蛋白合成。也有研究認(rèn)為，HIF-1α磷酸化后也可誘導(dǎo)VEGF靶基因轉(zhuǎn)錄。VEGF過(guò)表達(dá)與其受體結(jié)合后激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成。新生血管可以為膠質(zhì)瘤提供營(yíng)養(yǎng)、氧氣，排出代謝廢物，并刺激膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，加速膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移［21］。

綜上所述，膠質(zhì)瘤細(xì)胞適合生存在正常氧濃度微環(huán)境中，極低氧和高氧微環(huán)境均不適合膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；微環(huán)境氧濃度的改變可以引發(fā)ROS/HIF-1信號(hào)通路明顯變化，從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲能力。未來(lái)我們將進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究這些信號(hào)通路變化及其相互影響，為基于HIF的分子靶向治療策略的研發(fā)提供依據(jù)。