基于Hippo/YAP信號通路探究粉防己堿抗乳腺癌耐藥機制

辛國松，王毛毛，侯妍秀，楊 燚，于 淼，季宇彬，李文蘭，李海茹

基于Hippo/YAP信號通路探究粉防己堿抗乳腺癌耐藥機制

辛國松1, 2，王毛毛1，侯妍秀1，楊 燚1，于 淼1, 2，季宇彬1, 2，李文蘭1, 2，李海茹3*

1. 哈爾濱商業(yè)大學 藥物工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076 2. 國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076 3. 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086

研究粉防己堿通過調(diào)控Hippo/Yes-相關蛋白同源癌蛋白（homologous oncoproteins Yes-associated protein，YAP）信號通路抗乳腺癌多重耐藥的分子機制。采用CCK-8法檢測粉防己堿對乳腺癌MCF-7/ADR細胞增殖的影響；采用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率；采用細胞集落實驗檢測細胞克隆形成能力；采用Transwell實驗檢測細胞侵襲能力；采用Western blotting檢測細胞耐藥外排蛋白[P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）、多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）]，Hippo通路關鍵節(jié)點蛋白[YAP1、大腫瘤抑制激酶1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1）、哺乳動物不育系20樣激酶1（mammalian Sterile20-like kinase 1，MST1）、轉錄共活化因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）]和凋亡關鍵蛋白[半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、細胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）]表達。粉防己堿對MCF-7/ADR細胞具有增殖抑制作用，半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值為14.20 μmol/L；粉防己堿能夠改變細胞形態(tài)，部分細胞出現(xiàn)凋亡跡象；粉防己堿顯著誘導MCF-7/ADR細胞發(fā)生凋亡（＜0.01），抑制細胞的增殖分化和侵襲能力，顯著下調(diào)P-gp、BCRP、MRP1、YAP1、TAZ和Bcl-2蛋白表達（＜0.01），顯著上調(diào)MST1、LATS1、Caspase-3、Cyt-C和Bax蛋白表達（＜0.01）。粉防己堿能夠通過下調(diào)MCF-7/ADR細胞P-gp、BCRP和MRP1蛋白表達，抑制外排蛋白活性，增加細胞內(nèi)粉防己堿含量蓄積；并通過激活Hippo信號通路，上調(diào)MST1蛋白表達，激活LATS1，進而調(diào)控下游靶點YAP1和TAZ表達，進一步上調(diào)Caspase-3、Cyt-C和Bax蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達，啟動細胞凋亡程序，發(fā)揮抗腫瘤作用。

粉防己堿；乳腺癌；阿霉素；耐藥性；Hippo/YAP信號通路

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。據(jù)統(tǒng)計，2020年女性乳腺癌已經(jīng)超越肺癌成為全球癌癥發(fā)病率最高的癌種。2020年全球新增乳腺癌患者達到226萬例，死亡68萬例，分別占全球新發(fā)癌癥病例和死亡病例的11.7%和6.8%，乳腺癌成為女性因癌癥死亡的主要原因[1-2]。我國乳腺癌發(fā)病率在近30年中每年增長2%～3%，成為威脅女性健康的“頭號癌癥殺手”，衛(wèi)生部已將乳腺癌列為我國腫瘤防治的重點之一[3-4]。

防己又稱粉防己、漢防己，是一種常用的中藥，其主要成分為粉防己堿，在中醫(yī)中廣泛用于治療哮喘、痢疾發(fā)燒等疾病。主要具有抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病、抗高血壓、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗瘧疾蟲、抗血小板等藥理作用，近年來粉防己堿的抗腫瘤作用受到眾多研究者的關注。臨床發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞具有極強的增殖分化、侵襲和轉移的能力，阿霉素是臨床上治療乳腺癌的常用藥物，但阿霉素治療乳腺癌過程中易產(chǎn)生耐藥性，難以達到良好的臨床治療效果。因此目前急需尋找能夠抑制乳腺癌細胞對阿霉素耐藥性的方法和途徑，進一步提高阿霉素的臨床療效[5-7]。導致乳腺癌多重耐藥的機制為藥物外排蛋白在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）供能的條件下將進入細胞的藥物排出胞外，減少藥物在癌細胞內(nèi)的富集，降低藥效，引起癌細胞中的多重耐藥性。乳腺癌多重耐藥產(chǎn)生的主要耐藥蛋白為P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP），是評價和衡量乳腺癌細胞多重耐藥特性強弱的指數(shù)[8-11]。中藥具有整體觀念、高效低毒、多靶點作用調(diào)控的特點，相關研究表明多種中藥活性成分都能夠通過調(diào)控藥物外排蛋白表達、促進腫瘤細胞凋亡逆轉乳腺癌多重耐藥，表現(xiàn)出對乳腺癌多重耐藥的抑制作用[12-13]。而且相關研究還發(fā)現(xiàn)粉防己堿能夠通過調(diào)控Yes-相關蛋白同源癌蛋白1（homologous oncoproteins Yes-assoc iated protein 1，YAP1）表達從而介導Hippo信號通路誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，推測粉防己堿可以通過介導乳腺癌多重耐藥外排蛋白，增加乳腺癌細胞內(nèi)粉防己堿和阿霉素的蓄積，進而降低YAP表達，激活Hippo信號途徑誘導乳腺癌細胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，實現(xiàn)臨床應用價值[14-18]。

1 材料

1.1 細胞株

乳腺癌MCF-7/ADR細胞由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究員質(zhì)控中心提供。

1.2 藥品與試劑

胎牛血清（批號0201021）購自浙江杭天生物科技公司；粉防己堿（質(zhì)量分數(shù)為98%，批號L1607039）購自阿拉丁試劑有限公司；CCK-8試劑盒（批號C0043）、PMSF（批號ST505）、HRP標記山羊抗大鼠IgG二抗（批號A0192）、Western blotting及IP細胞裂解液（批號072318180723）、30% Acr-Bis（批號093018181017）購自碧云天生物技術有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號AD123707271）購自美國HyClone公司；二甲基亞砜（批號20200901）購自天津中和盛泰化工有限公司；碘化丙啶（PI）染液（批號R20285）美國Sigma公司；聚山梨酯-20（批號20190207）購自美國Biotopped公司；Tris（批號181127）購自美國Amresco公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號P0015）、兔抗YAP1抗體（批號bs-52418R）、兔抗大腫瘤抑制激酶1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1）抗體（批號bs-2904R）、兔抗哺乳動物不育系20樣激酶1（mammalian Sterile 20-like kinase 1，MST1）抗體（批號bs-3504R）、兔抗轉錄共活化因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）抗體（批號bs-12367R）購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗P-gp抗體（批號WL01338）、兔抗BCRP抗體（批號WL03192）、兔抗MRP1抗體（批號WL01027）、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號WL01114）、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號WL02512）、兔抗細胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗體（批號WL04963）、兔抗B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號WL01506）、兔抗Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號WL02385）購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.3 儀器

ECO-170P-230型細胞培養(yǎng)箱（美國NBS公司）；Adventurer萬分之一電子天平（美國OHAUS公司）；Model 680型酶標儀（美國NBS公司）；EPICS-XL型流式細胞儀、AllegraTM64R型低溫高速離心機（美國Beckman-Coulter公司）；熒光顯微鏡（德國Leica公司）；680型全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）；微量移液器（芬蘭百得公司）；標準型PB-10型pH計（德國Sartorius公司）；GIS-2019型Tannon凝膠成像系統(tǒng)（天能科技有限公司）；DYY-7C型電泳儀、M344039型垂直電泳轉印槽（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 細胞復蘇及傳代培養(yǎng)

將MCF-7/ADR細胞從?80 ℃冰箱取出，水浴加熱融化，加入2 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，1500 r/min離心5 min，棄去上清，重懸細胞，平均分到2個培養(yǎng)瓶中，加入5 mL細胞培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長勢良好時進行傳代，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，再加入胰蛋白酶溶液消化，反復吹打得細胞懸液，分裝到2個細胞培養(yǎng)瓶中，加入5 mL細胞培養(yǎng)液，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 CCK-8法檢測粉防己堿對MCF-7/ADR細胞增殖的影響

MCF-7/ADR細胞以2×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入1、2、4、8、16、32 μmol/L粉防己堿100 μL，對照組加入100 μL培養(yǎng)基，每組設置6個平行孔。將96孔板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測吸光度（）值。

2.3 倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察粉防己堿對MCF-7/ADR細胞形態(tài)的影響

MCF-7/ADR細胞以3×104/mL接種于6孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設置對照組和粉防己堿（7、14、28 μmol/L）組，各給藥組加入1 mL粉防己堿，對照組加入1 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，用倒置顯微鏡觀察并拍照；每孔中加入1 mL多聚甲醛固定1 h，棄去上清液，沖洗后加入200 μL Hoechst 33258染色液，水浴加熱30 min后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.4 流式細胞儀檢測粉防己堿對MCF-7/ADR細胞凋亡的影響

按“2.3”項下方法進行分組和給藥，培養(yǎng)48 h后，吸取上清液，加入胰蛋白酶消化后離心，棄去上清液，加入70%冰乙醇，固定24 h后離心。加入Annexin V和PI染液800 μL，用尼龍網(wǎng)將染色后的細胞過濾。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.5 集落實驗檢測粉防己堿對MCF-7/ADR細胞克隆能力的影響

取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的MCF-7/ADR細胞，PBS洗滌后加入胰蛋白酶消化，離心后棄去上清液，重懸細胞，用臺盼蘭染色后以1×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12～18 h。PBS清洗后，按“2.3”項下方法進行分組和給藥，連續(xù)培養(yǎng)7 d后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌后用甲醇固定10 min。洗滌后用吉姆薩染液染色，洗滌干燥后置于倒置顯微鏡下觀察細胞集落形成率并拍照。

2.6 Transwell實驗檢測粉防己堿對MCF-7/ADR細胞侵襲能力的影響

MCF-7/ADR細胞以1×105/mL接種于6孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h。按“2.3”項下方法進行分組和給藥，培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，每孔加入0.1 mL 10%甲醇溶液，固定細胞30 s。吸去甲醇溶液，每孔加入0.1 mL結晶紫染液，室溫孵育20 min。棄去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分。自然干燥或37 ℃烘干后在顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞耐藥蛋白、Hippo通路和凋亡相關蛋白表達的影響

按“2.3”項下方法進行分組和給藥，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，加入含PMSF的細胞裂解液，裂解30 min后離心15 min，取上清液，煮沸使蛋白變性，采用BCA試劑盒定量蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉2 h后加入一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入二抗，室溫孵化2 h，洗膜后加入化學發(fā)光試劑，顯影并用顯色儀拍照。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞增殖的影響

如圖1所示，粉防己堿對MCF-7/ADR細胞具有增殖抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為14.20 μmol/L，并參考IC50值設定后續(xù)粉防己堿給藥劑量為7、14、28 μmol/L。

3.2 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞形態(tài)的影響

采用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡觀察粉防己堿對MCF-7/ADR細胞形態(tài)的影響，如圖2所示，與對照組比較，粉防己堿使腫瘤細胞形態(tài)有一定改變，隨著給藥濃度的增加，細胞大部分變圓漂浮于培養(yǎng)基中，并且出現(xiàn)凋亡小體，且細胞膜破碎明顯，細胞排列稀疏，細胞核的熒光強度最強。

與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.3 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞凋亡的影響

如圖3所示，與對照組比較，各劑量粉防己堿組MCF-7/ADR細胞凋亡率均顯著升高（＜0.01），呈劑量相關性。

3.4 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞克隆能力的影響

單個MCF-7/ADR細胞在體外持續(xù)增殖6代以上，其后代形成1個細胞集落，且每個克隆均包含50個細胞以上，大小為0.3～1.0 mm。如圖4所示，對照組腫瘤細胞的集落數(shù)量較多，粉防己堿給藥組集落數(shù)量較少，且呈劑量相關性。表明粉防己堿可以抑制MCF-7/ADR細胞的克隆形成能力。

A-倒置顯微鏡下細胞形態(tài)(×100) B-熒光顯微鏡下細胞形態(tài)(×200)

圖3 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞凋亡的影響(, n = 3)

圖4 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞克隆能力的影響(×40)

3.5 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞侵襲能力的影響

如圖5所示，與對照組比較，粉防己堿給藥組紫色區(qū)域呈劑量相關性地減少，且顏色明顯變淺。表明粉防己堿能夠顯著抑制MCF-7/ADR細胞的侵襲能力。

3.6 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞耐藥蛋白、Hippo通路和凋亡相關蛋白表達的影響

3.6.1 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞耐藥蛋白表達的影響 如圖6所示，粉防己堿各劑量組能夠有效降低MCF-7/ADR細胞P-gp、BCRP和MRP1蛋白表達水平（＜0.01），且呈劑量相關性。

3.6.2 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞Hippo通路關鍵調(diào)控蛋白表達的影響 如圖7所示，與對照組比較，粉防己堿各劑量組MCF-7/ADR細胞中MST1和LATS1蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），YAP1和TAZ蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01），且呈劑量相關性。

3.6.3 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞凋亡相關蛋白表達的影響 如圖8所示，與對照組比較，粉防己堿各劑量組MCF-7/ADR細胞中Caspase-3、Cyt-C和Bax蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01），且呈劑量相關性。

圖5 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞侵襲能力的影響(×100)

圖6 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞P-gp、BCRP和MRP1蛋白表達的影響(, n = 3)

圖7 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞YAP1、TAZ、LATS1和MST1蛋白表達的影響(, n = 3)

圖8 粉防己堿對MCF-7/ADR細胞Caspase-3、Cyt-C、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

乳腺癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，其增殖、分化、侵襲、轉移等特性使其在臨床上難以得到有效治療。阿霉素是目前臨床上廣泛使用的一種抗腫瘤藥物，但由于其在抗腫瘤作用下容易發(fā)生耐藥性，導致療效不佳。如何克服乳腺癌的耐藥性是目前亟待解決的問題。根據(jù)有關文獻報道，乳腺癌產(chǎn)生多重耐藥的機制為在ATP供能的情況下，藥物外排蛋白會將進入細胞的藥物排出胞外，減少了藥物在腫瘤細胞中的富集，進而降低了藥效，產(chǎn)生了腫瘤細胞的耐藥性，P-gp、MRP及BCRP是評估乳腺癌多重耐藥特征的重要指標[19-21]。中藥具有高效、低毒、多靶點、多通路調(diào)控的作用特點，其多個有效成分能夠調(diào)控外排蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞凋亡，進而逆轉多藥耐藥，因此篩選一種中藥活性組分逆轉乳腺癌多重耐藥機制潛力巨大。相關研究表明，粉防己堿可以有效地逆轉腫瘤對卡鉑、順鉑、紫杉醇等的耐藥性，因此，推測粉防己堿可能是通過調(diào)節(jié)乳腺癌多藥耐藥外排蛋白的活性，提高藥物在胞內(nèi)的蓄積，并誘導腫瘤細胞凋亡，從而起到抗腫瘤作用[22-24]。

本研究采用CCK-8法檢測粉防己堿的IC50值，利用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡等觀察粉防己堿對腫瘤細胞形態(tài)的影響，并通過流式細胞儀測定了其對腫瘤細胞凋亡的影響，結果表明粉防己堿對腫瘤細胞的生長有顯著影響，并具有一定的劑量相關性。表明粉防己堿能夠有效抑制乳腺癌對阿霉素的耐藥性。為探究粉防己堿對腫瘤細胞增殖分化和侵襲能力的影響，進行細胞集落實驗和Transwell實驗。結果顯示，粉防己堿能夠抑制乳腺癌細胞克隆形成能力，有效降低腫瘤細胞增殖分化和侵襲能力。為進一步探究粉防己堿在MCF-7/ADR細胞中逆轉多藥耐藥的機制，利用Western blotting對耐藥蛋白P-gp、BCRP、MRP1的表達進行檢測。結果表明，粉防己堿可以通過下調(diào)P-gp、BCRP和MRP1蛋白表達水平，減少腫瘤細胞膜蛋白的外排，提高阿霉素在腫瘤細胞內(nèi)的蓄積，從而提高藥物的療效，并通過阻斷P-gp蛋白所介導的多重耐藥通路，達到逆轉乳腺癌細胞對阿霉素耐藥的目的。

以Hippo信號通路為切入點，深入探究粉防己堿對MCF-7/ADR細胞的影響及其分子作用機制。采用Western blotting對Hippo通路中的關鍵節(jié)點蛋白MST1、YAP1、LATS1、TAZ進行分析，發(fā)現(xiàn)粉防己堿能夠激活Hippo通路上的MST1蛋白，從而提高MST1的表達水平，激活LATS1，活化的LATS1對下游靶基因YAP1和TAZ進行調(diào)控，將其磷酸化，降低其含量，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和分化[25-26]。Caspase-3、Cyt-C、Bax、Bcl-2是調(diào)節(jié)凋亡的重要蛋白，Bax和Bcl-2二者通過形成同源和異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡。Caspase-3可以通過抑制凋亡抑制物，破壞細胞結構使蛋白喪失功能，Cyt-C可以介導細胞凋亡[27-31]。采用Western blotting檢測凋亡蛋白Caspase-3、Cyt-C、Bax、Bcl-2表達的變化。結果顯示，粉防己堿能夠通過上調(diào)Caspase-3、Cyt-C和Bax蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達，誘導細胞發(fā)生凋亡，表明粉防己堿能夠誘導MCF-7/ADR細胞發(fā)生凋亡，啟動細胞凋亡程序。

綜上，粉防己堿可能通過降低P-gp、BCRP、MRP1蛋白在腫瘤細胞內(nèi)的表達，抑制腫瘤外排蛋白表達活性，增加粉防己堿與阿霉素在乳腺癌細胞中的含量蓄積；并進一步激活Hippo信號通路，上調(diào)MST1蛋白表達，活化LATS1，調(diào)節(jié)YAP1，并促進YAP1的磷酸化，通過下調(diào)YAP1和TAZ的表達，抑制乳腺癌細胞增殖分化，促進乳腺癌細胞凋亡，從而達到抗腫瘤的目的。本研究為解決臨床乳腺癌對阿霉素的耐藥性提供新的研究思路和方法參考，也為粉防己堿的進一步研究與開發(fā)奠定基礎和提供數(shù)據(jù)支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] DeSantis C, Siegel R, Bandi P,. Breast cancer statistics, 2011 [J]., 2011, 61(6): 408-418.

[2] WHO. Global health estimates 2020: Deaths by cause, age, sex, by country and by region, 2000-2019 [EB/OL]. [2021-02-20]. https://www.who.int/data/gho/data/themes/mortality- and global-health-estimates/ghe-leading-causes-of-death.

[3] Fan L, Goss P E, Strasser-Weippl K. Current status and future projections of breast cancer in Asia [J]., 2015, 10(6): 372-378.

[4] 杜建姝. 中國乳腺癌現(xiàn)狀 [J]. 世界最新醫(yī)學信息文摘, 2019, 19(46): 371-372.

[5] Cao J, Zhang M D, Wang B,. Chemoresistance and metastasis in breast cancer molecular mechanisms and novel clinical strategies [J]., 2021, 11: 658552.

[6] Shi R Z, He Y F, Wen J,. Epithelial cell adhesion molecule promotes breast cancer resistance protein-mediated multidrug resistance in breast cancer by inducing partial epithelial-mesenchymal transition [J]., 2021, 45(8): 1644-1653.

[7] 林慧, 吉麗銀, 符策崗. 乳腺癌化療耐藥的分子機制 [J]. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2022, 31(2): 194-201.

[8] Pan Y, Chen Q, Li N,. CTAB reversed drug-resistance mediated by AMPK-HIF-1 alpha-P-gp pathway in breast cancer [J]., 2020, 49(2): 154-155.

[9] Li W J, Chen X H, Zeng J C,. Theoretical insight into the multiple interactions of quinazoline inhibitors with breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) [J]., 2020, 38(14): 4336-4343.

[10] Raman D, Cimpean A M, De Miglio M R. Editorial: Drug resistance in breast cancer-mechanisms and approaches to overcome chemoresistance [J]., 2023, 12: 1080684.

[11] 羅錦琳, 歐陽慧婷, 鄒聯(lián)洪, 等. 乳腺癌內(nèi)分泌耐藥機制的研究進展 [J]. 實用預防醫(yī)學, 2022, 29(4): 510-512.

[12] Tarapcsák S, Szalóki G, Telbisz á,. Interactions of retinoids with the ABC transporters P-glycoprotein and breast cancer resistance protein [J]., 2017, 7: 41376.

[13] Khan A, Ali L, Wei D Q. Editorial: Breast cancer resistance, biomarkers and therapeutics development in the era of artificial intelligence [J]., 2022, 9: 1034990.

[14] Watanabe A, Momo, Tanaka K,. Drug-drug interaction between apalutamide and atorvastatin through breast cancer resistance protein in an outpatient [J]., 2022, 60(8): 367-369.

[15] Yan C, Yang H J, Su P,. OTUB1 suppresses Hippo signaling via modulating YAP protein in gastric cancer [J]., 2022, 41(48): 5186-5198.

[16] 王明珠, 周陽, 何凱桐, 等. Hippo通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機制的研究進展 [J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2022, 30(16): 3061-3064.

[17] 于文靜. 粉防己堿通過Hippo通路抗肝癌作用機制研究 [D]. 哈爾濱: 哈爾濱商業(yè)大學, 2020.

[18] Liu X F, Han Q, Rong X Z,. ANKHD1 promotes proliferation and invasion of non?small?cell lung cancer cells via regulating YAP oncoprotein expression and inactivating the Hippo pathway [J]., 2020, 56(5): 1175-1185.

[19] Zattoni I F, Delabio L C, Dutra J P,. Targeting breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2): Functional inhibitors and expression modulators [J]., 2022, 237: 114346.

[20] Wang J, Gan C P, Retmana I A,. P-glycoprotein (MDR1/ABCB1) and breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) limit brain accumulation of the FLT3 inhibitor quizartinib in mice [J]., 2019, 556: 172-180.

[21] Lu J, Wang Y C, Shi Z J,. 3-Acetyl-11-keto-beta-boswellic acid decreases the malignancy of taxol resistant human ovarian cancer by inhibiting multidrug resistance (MDR) proteins function [J]., 2019, 116: 108992.

[22] N Bhagya. Network pharmacology based investigation on the mechanism of tetrandrine against breast cancer [J]., 2023, 3(1): 100381.

[23] Samsuzzaman M, Jang B C. Growth-suppressive and apoptosis-inducing effects of tetrandrine in SW872 human malignant liposarcoma cells via activation of Caspase-9, down-regulation of XIAP and STAT-3, and ER stress [J]., 2022, 12(6): 843.

[24] 楊燚, 王毛毛, 于淼, 等. 基于網(wǎng)絡藥理學、分子對接和體外實驗探討防己生物堿類活性成分逆轉乳腺癌耐藥的作用機制 [J]. 中草藥, 2023, 54(9): 2841-2851.

[25] 任宇亮, 吳慧, 左春妹, 等. Hippo信號通路在乳腺癌發(fā)生、轉移和治療中的作用 [J]. 湖北醫(yī)藥學院學報, 2022, 41(6): 646-651.

[26] 祝景偉, 佟經(jīng)偉, 許培權. Hippo信號通路中TAZ、YAP在三陰性乳腺癌中的表達及意義 [J]. 陜西醫(yī)學雜志, 2020, 49(8): 940-943.

[27] 張娜娜. Caspase-3和Bcl-2表達與乳腺癌細胞凋亡及其臨床病理特征的相關性分析 [J]. 實用癌癥雜志, 2021, 36(10): 1609-1613.

[28] 劉斌, 游金輝. 乳腺癌與Bcl-2、Caspase-3的相關性研究與應用 [J]. 川北醫(yī)學院學報, 2017, 32(4): 638-642.

[29] 裴巖巖, 李雅, 閆春生, 等. 黃芪甲苷通過Bax/Bcl-2/ Caspase-3信號通路誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的機制研究 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2019, 30(9): 1077-1082.

[30] Jiang X F, Liu Y S, Zhang G J,.-emodin induces breast tumor cell apoptosis through upregulation of miR-15a/miR-16-1 that suppresses BCL2 [J]., 2020, 2020: 5108298.

[31] Li Y N, Ning Ni, Song Lei,. Derivatives of deoxypodophyllotoxin induce apoptosis through Bcl-2/ Bax proteins expression [J]., 2021, 21(5): 611-620.

Mechanism of tetrandrine against drug resistance in breast cancer based on Hippo/YAP signaling pathway

XIN Guo-song1, 2, WANG Mao-mao1, HOU Yan-xiu1, YANG Yi1, YU Miao1, 2, JI Yu-bin1, 2, LI Wen-lan1, 2, LI Hai-ru3

1. Engineering Research Center for Medicine, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China 2. National Ministry of Education Anti-tumor Natural Drug Engineering Research Center, Harbin 150076, China 3. Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China

To study the molecular mechanism of tetrandrine against multidrug resistance in breast cancer by regulating Hippo/homologous oncoproteins Yes-associated protein (YAP) signaling pathway.CCK-8 method was used to detect the effect of tetrandrine on proliferation of MCF-7/ADR cells; Inverted microscopy and fluorescence microscopy were used to observe cell morphology; Flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate; Cell colony assay was used to detect cell clone formation ability; Transwell experiment was used to detect cell invasion ability; Western blotting was used to detect expressions of resistance efflux proteins [P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (BCRP) and multidrug resistance associated protein (MRP)], Hippo pathway key node proteins [YAP1, large tumor suppressor kinase 1 (LATS1), mammalian Sterile 20-like kinase 1 (MST1), transcriptional co activator with PDZ binding motif (TAZ)], and apoptosis key proteins [cysteine aspartate protease-3 (Caspase-3), cytochrome C (Cyt-C), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and Bcl-2 associated X protein (Bax)].Tetrandrine had a proliferative inhibitory effect on MCF-7/ADR cells, with a half inhibitory concentration (IC50) value of 14.20 μmol/L; Tetrandrine could change cell morphology and some cells showed signs of apoptosis; Tetrandrine significantly induced apoptosis in MCF-7/ADR cells (< 0.01), inhibited cell proliferation, differentiation and invasion ability, significantly down-regulated the expressions of P-gp, BCRP, MRP1, YAP1, TAZ and Bcl-2 proteins (< 0.01), and significantly up-regulated the expressions of MST1, LATS1, Caspase-3, Cyt-C and Bax proteins (< 0.01).Tetrandrine can inhibit efflux protein activity and increase intracellular accumulation of tetrandrine by down-regulating the expressions of P-gp, BCRP and MRP1 proteins in MCF-7/ADR cells. And tetrandrine exerts anti-tumor effects by activating Hippo signaling pathway, upregulation of MST1 protein expression, activation of LATS1, and regulation of downstream target YAP1 and TAZ expressions, further upregulation of Caspase-3, Cyt-C, and Bax protein expressions, down-regulation of Bcl-2 protein expression, initiation of cell apoptosis program.

tetrandrine; breast cancer; adriamycin; drug resistance; Hippo/YAP pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)18 - 5960 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.014

2023-04-18

中國博士后面上項目（2021MD703828）；黑龍江省自然科學基金優(yōu)秀青年項目（YQ2022H002）；黑龍江省博士后資助項目（LBH-Z20172）；哈爾濱商業(yè)大學產(chǎn)業(yè)化項目支持計劃（XL0086）

辛國松（1984—），男，副研究員，博士（博士后），碩士生導師，研究方向為抗腫瘤中藥藥理學。E-mail: 13766801150@163.com

李海茹（1988—），女，副教授，博士（博士后），碩士生導師，研究方向為中藥藥理學。

[責任編輯 李亞楠]