離子色譜法測定依達(dá)拉奉注射液中亞硫酸鹽

王春霞，蓋成，王子夢，苗會娟，馬寧

（河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，石家莊 050200）

依達(dá)拉奉，化學(xué)名3-甲基-1-苯基-2-吡啶啉-5-酮，是以苯肼和乙酰乙酸乙酯為原料合成的吡唑啉酮類化合物，具有強(qiáng)大的自由基清除作用，可作用于腦梗死前期，抑制腦水腫、縮小腦梗死區(qū)、減輕神經(jīng)癥候群的發(fā)作、抑制遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞的死亡及腦缺血性腦血管障礙的出現(xiàn)，保護(hù)腦組織的結(jié)構(gòu)和功能[1-4]。相關(guān)研究證實(shí)依達(dá)拉奉注射液對急性腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損起到一定的的改善作用[5?7]。

依達(dá)拉奉注射液輔料中含有亞硫酸鈉，亞硫酸鹽對于人體有害，如果合成過程中或者制劑所用輔料中添加了亞硫酸鹽，質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)中需要設(shè)置對亞硫酸鹽的殘留量檢查項(xiàng)，依達(dá)拉奉注射液的指定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為YBH09282009，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定采用對樣品進(jìn)行回流后滴定的方法測定亞硫酸鹽的含量，此方法樣品處理過于復(fù)雜，且蒸餾的終點(diǎn)難以把握，容易出現(xiàn)蒸餾未完成、有效成分損失等問題，且專屬性差，準(zhǔn)確度不高。離子色譜(HPIC)測定陰離子的原理在于，當(dāng)水樣隨淋洗液通過陰離子分離柱時，由于各組分對低容量強(qiáng)堿性陰離子樹脂的親和力不同而分開，被分離的陰離子在流經(jīng)抑制柱(強(qiáng)酸型陽離子樹脂)時被轉(zhuǎn)變?yōu)楦唠妼?dǎo)的酸，淋洗液則轉(zhuǎn)變?yōu)槿蹼妼?dǎo)的酸或水，用電導(dǎo)檢測器測量生成的酸型陰離子[8?11]。筆者采用離子色譜法測定依達(dá)拉奉注射液中亞硫酸鹽含量，專屬性好，精密度高，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效離子色譜儀：DIONEX ICS-6000 型，美國賽默飛科技公司。

電子分析天平：XS105型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

依達(dá)拉奉注射液：批號分別為210603、210604、210605、210811、210812、210813、211024、211025、211026，規(guī)格均為20 mL，依達(dá)拉奉質(zhì)量為30 mg，某藥企提供。

亞硫酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：20 μg/mL(以亞硫酸根離子計)，產(chǎn)品編號BW73875-3，北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司。

硫酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：1 000 μg/L，產(chǎn)品編號BW62875，北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司。

甲醛溶液：質(zhì)量濃度37%，編號R00005-3，北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司。

氫氧化鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：(1) Dionex IonPac AS11-HC 柱(250 mm×4.6 mm，7.5 μm，美國戴安科技有限公司)陰離子交換分析柱；(2) AG23-HC陰離子交換保護(hù)柱；柱溫：25 ℃；淋洗液：15 mmol/L氫氧化鉀溶液，流量為1.0 mL/min；檢測器：電導(dǎo)檢測器；檢測器溫度：30 ℃；抑制器：自動再生抑制模式；抑制電流：40 mA；進(jìn)樣體積：25 μL。

1.3 溶液制備

空白溶液：精密量取甲醛2.7 mL，置于1 000 mL 容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，作為空白溶液。

空白輔料溶液：分別稱取除亞硫酸鈉外的其它輔料(包括鹽酸半胱氨酸)適量，按照依達(dá)拉奉注射液配方，用空白溶液同法制備。

系統(tǒng)適用性溶液：精密量取硫酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和亞硫酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各2 mL，置于同一50 mL容量瓶中，用空白溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻。

亞硫酸鈉系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取亞硫酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01、0.1、1、5、5、5、5 mL，分別置于100、100、100、200、100、50、25 mL容量瓶中，用空白溶劑稀釋至標(biāo)線，搖勻。

亞硫酸鈉對照品溶液：精密量取亞硫酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5 mL，置于200 mL容量瓶中，用空白溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻。

硫酸鈉對照品溶液：精密量取硫酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)2 mL，置于100 mL容量瓶中，用空白溶液稀釋至刻線，搖勻。

依達(dá)拉奉注射液樣品溶液：精密量取依達(dá)拉奉注射液1 mL，置于50 mL 容量瓶中，用空白溶液稀釋至刻線，搖勻。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

取亞硫酸鹽對照品溶液和依達(dá)拉奉注射液樣品溶液，按照1.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖峰面積，按照外標(biāo)法計算樣品中亞硫酸鹽的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

離子色譜法測定亞硫酸鹽，一般會選用Dionex IonPac AS11-HC或者Dionex IonPac AS23-HC色譜柱[12]，選用Dionex IonPac AS11-HC 色譜柱時，一般采用氫氧化鉀溶液或者氫氧化鈉溶液作為淋洗液[13?14]，而Dionex IonPac AS23-HC 色譜柱常用于淋洗液中含有碳酸根的系統(tǒng)中。實(shí)驗(yàn)考察了以上兩種色譜柱，結(jié)果表明，采用Dionex IonPac AS11-HC 色譜柱檢測時，各色譜峰的分離度良好，且色譜峰對稱性好，故選擇Dionex IonPac AS11-HC 色譜柱。依達(dá)拉奉分子進(jìn)入離子色譜柱后難以洗脫，會縮短色譜柱的使用壽命，故用C18填料的小柱過濾依達(dá)拉奉注射液樣品溶液，以除去依達(dá)拉奉大分子，可以有效地保護(hù)色譜柱。

2.2 淋洗液濃度的選擇

在離子色譜系統(tǒng)中，淋洗液的組成、質(zhì)量濃度及流量都是影響測定結(jié)果至關(guān)重要的因素。其中，淋洗液的濃度與被測離子的色譜保留時間息息相關(guān)[15?16]。選用氫氧化鉀溶液作為淋洗液，調(diào)整其濃度，考察不同濃度的淋洗液對于檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明，氫氧化鉀溶液濃度為10 mmol/L時，色譜峰有前延現(xiàn)象，淋洗液濃度為15、20 mmol/L 時，色譜峰形狀規(guī)則，且能與其它雜質(zhì)色譜峰峰很好的分離。在保證分離效果的前提下盡量選擇低濃度的溶液，故選擇氫氧化鉀溶液的濃度為15 mmol/L。

2.3 柱溫的選擇

在離子色譜系統(tǒng)中，柱溫對于被測組分的色譜保留時間和色譜峰形有很大影響，不同的離子在柱溫變化時呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。分別柱溫為20、25、30、35 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，記錄色譜圖，結(jié)果表明，柱溫為25 ℃時色譜峰峰形對稱性好，且系統(tǒng)中各色譜峰之間的分離度好，色譜保留時間適宜。故選擇柱溫為25 ℃。

2.4 稀釋液的選擇

實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲醛溶液作為保護(hù)液(稀釋液)，一方面，甲醛可與亞硫酸鹽形成復(fù)合物，使其不被氧化，從而保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而甲醛濃度太高，容易被抑制器的電流電離而產(chǎn)生信號，也會影響測定的準(zhǔn)確性。故需要優(yōu)化甲醛溶液的濃度。分別實(shí)驗(yàn)考察了0.1%的甲醛和1%的甲醛溶液作為保護(hù)液時的色譜分離效果。結(jié)果顯示，采用1%的甲醛作為保護(hù)液時，甲醛被抑制器電離后，在色譜圖中呈現(xiàn)一個較大的拖尾色譜峰，影響亞硫酸根離子的測定結(jié)。而采用0.1%的甲醛溶液作為保護(hù)液時，亞硫酸根離子的測定不受影響。故選擇使用0.1%的甲醛溶液作為保護(hù)液。

2.5 專屬性

取空白溶液、輔料空白溶液、亞硫酸鈉對照品溶液、依達(dá)拉奉注射液樣品溶液和硫酸鈉對照品溶液分別注入離子色譜儀，色譜圖如圖1 所示。結(jié)果表明，亞硫酸根離子和硫酸根離子能有效分離，且色譜條件對樣品分析無干擾。

圖1 離子色譜圖

2.6 線性關(guān)系

精密量取亞硫酸鈉系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各25 μL，分別按1.2 色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以亞硫酸鈉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.098 09x-0.088 74，r=0.999 8，亞硫酸鈉的質(zhì)量濃度在0.1～200 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 定量限及檢出限

精密量取亞硫酸根對照品溶液，逐級稀釋后測定，直至信噪比約為10，對應(yīng)的亞硫酸根對照品溶液的質(zhì)量濃度即為亞硫酸根定量限。精密量取定量限試驗(yàn)最低濃度溶液3 mL，置于10 mL 容量瓶中，用空白溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，取該溶液25 μL，注入離子色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，計算方法的檢出限[17?19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法亞硫酸根離子定量限為0.072 μg/mL，檢出限為0.027 μg/mL。

2.8 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密量取依達(dá)拉奉注射液樣品1 mL，置于50 mL 容量瓶中，用空白溶液稀釋至標(biāo)線，搖勻，平行制備9份依達(dá)拉奉注射液樣品溶液，每3份為一組，每組分別加入1 000 μg/mL的硫酸鈉溶液標(biāo)注物質(zhì)0.8、1.0、1.2 mL，并用空白溶劑稀釋至標(biāo)線，搖勻；精密量取上述溶液注入離子色譜儀，記錄色譜圖；計算亞硫酸根離子的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。由表1 可知，亞硫酸鹽的回收率為98.5%～100.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%(n=9)。該方法滿足驗(yàn)證要求，精密度、準(zhǔn)確度良好。

表1 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新鮮配制的亞硫酸鈉對照品溶液(質(zhì)量濃度為20 μg/mL)和依達(dá)拉奉注射液加標(biāo)樣品溶液，在室溫下放置2、4、6、8 h后，精密量取不同放置時間的上述溶液注入離子色譜儀，記錄色譜圖，色譜峰峰面積測定值見表2。由表2可知，亞硫酸鈉對照品溶液及依達(dá)拉奉注射液加標(biāo)樣品溶液放置8 h時，亞硫酸根離子的色譜峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.4%和0.2%，表明亞硫酸根離子在水溶液中相當(dāng)穩(wěn)定。

表2 亞硫酸鈉對照品與依達(dá)拉奉注射液加標(biāo)樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測定

取依達(dá)拉奉注射液樣品9 批，按照原標(biāo)準(zhǔn)中蒸餾后剩余滴定的方法和離子色譜法兩種方法分別測定，結(jié)果見表3。由表3 可知，原標(biāo)準(zhǔn)方法測定的亞硫酸鹽的含量均低于離子色譜法測定的含量，說明原標(biāo)準(zhǔn)中存在反應(yīng)不完全或者降解的現(xiàn)象。經(jīng)計算，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，不同批號樣品測試的F值均小于F0.05(5,5)，說明兩種方法的精密度相同；t檢驗(yàn)中，P值均小于0.01，說明兩種方法的準(zhǔn)確度存在顯著性差異。根據(jù)加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果可以確定，離子色譜法測定結(jié)果準(zhǔn)確度較高。

表3 亞硫酸鹽質(zhì)量濃度檢測結(jié)果

3 結(jié)語

建立了離子色譜法測定依達(dá)拉奉注射液中的亞硫酸鹽的方法，通過篩選色譜柱和淋洗液、調(diào)整淋洗液的濃度、柱溫等條件，獲得了最佳離子色譜檢測條件。與原標(biāo)準(zhǔn)中的依達(dá)拉奉注射液樣品溶液先回流后進(jìn)行剩余滴定的方法相比，省略了繁瑣的樣品處理過程，避免了原檢測方法中被測成分的反應(yīng)不完全或者降解現(xiàn)象。離子色譜法專屬性好，靈敏度高，耐用性好，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為藥品中亞硫酸鹽的測方法定提供了新的選擇。