高效液相色譜法同時測定益腎保健酒中9種有效成分

陳彥和，胡楊，李先芝，2，毛瓊麗，劉洋，石豪，嚴玲，朱艷

（1.勁牌有限公司，湖北大冶 435100；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435100）

我國擁有悠久的酒文化和中醫(yī)藥文化，保健酒是我國傳統(tǒng)酒文化和中醫(yī)藥文化有機結(jié)合的產(chǎn)物，迄今已有3 600多年的歷史，是我國酒文化歷史長河中的重要組成部分[1]。保健酒是以白酒為基礎(chǔ)，通過加入可食用或者藥食兩用的輔料進行加工、調(diào)配而成具有某些保健功能的一種配制酒?，F(xiàn)代醫(yī)學表明，酒精的過量攝入會對肝腎造成損傷[2?3]，但保健酒中的抗氧化物質(zhì)對人體的肝腎有一定的保護作用[4?5]，基于此，保健酒日趨得到消費者的青睞。董琪等[6]選取桑椹、桑葉、桑枝和亳桑皮4種原料，制備了亳桑保健酒。那廣寧等[7]以苦瓜汁與蘋果菠蘿混合果汁為原料，選用釀酒酵母及植物乳桿菌作為發(fā)酵菌種定向發(fā)酵苦瓜保健酒，抗氧化試驗結(jié)果表明，苦瓜保健酒有一定的抗氧化活性，且其抗氧化化性與皂苷質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。李大成等[8]以新鮮甘蔗皮為主要功能保健原料，用浸泡法生產(chǎn)具有抗氧化活性的甘蔗皮保健酒。陸世廣等[9?11]對中國勁酒進行了研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國勁酒具有緩解疲勞、增強免疫力、緩解腎陽虛證等功效。

益腎保健酒是一款在研產(chǎn)品，以清香型白酒為基酒，以當歸、肉桂、淫羊藿等3味藥材為原料，按照一定配比，經(jīng)過數(shù)字化提取精制而成。當歸是一種常見的具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便功效的中藥材[12]，現(xiàn)代研究表明，當歸中的主要成分為有機酸類、苯酞類、多糖類、黃酮類等[13?15]。此外，也有大量研究發(fā)現(xiàn)，當歸在保肝護腎方面有顯著效果[16?17]。肉桂是主要生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種藥食兩用的植物，其主要成分為揮發(fā)油、多酚類、糖苷類、萜類、黃酮類等[18?20]。研究表明肉桂在改善腎陽虛方面有顯著效果[21?22]。淫羊藿苷等黃酮類是淫羊藿藥材中的主要化合物，淫羊藿中的黃酮類成分對腎臟具有保護效果[23?24]。

目前，關(guān)于益腎保健酒的研究較少。筆者建立高效液相色譜法測定益腎保健酒中5-羥甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯9種有效成分含量，以期為益腎保健酒的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：UltiMate 3000型，美國賽默飛世爾科技公司。

數(shù)控超聲波清洗儀：SK1200H 型，上?？茖С晝x器有限公司。

電子分析天平：SQP 型，感量為0.001 mg，德國賽多利斯公司。

超純水儀：PURELAB classic UV 型，英國ELGA公司。

乙腈、磷酸：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

甲醇、乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

益腎保健酒樣品：5批，勁牌有限公司。

9種化合物對照品：相關(guān)信息見表1。

表1 9種化合物對照品信息

實驗用水：GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Sepax HP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，蘇州賽分科技有限公司)；流動相：(A)乙腈，(B) 0.1%(體積比)磷酸溶液，流量為1.0 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見表2；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進樣體積：10 μL。

表2 梯度洗脫程序

1.3 實驗步驟

1.3.1 溶液配制

9 種目標物單一對照品儲備液：分別精密稱取5-羥甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯對照品適量，分別置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容，質(zhì)量濃度 分 別 為290、889.02、6 876.1、298.9、304.29、761.932、817.656、471.128 4、609.5 mg/L。

9 種目標物混合對照品溶液：分別精密吸取上述單一對照品儲備液適量，用甲醇溶液稀釋成5-羥甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為87、44.451 0、260.283 0、149.45、304.29、380.966、327.062、94.226、304.750 mg/L的混合對照品溶液。

1.3.2 樣品處理

采用一次性注射器直接吸取益腎保健酒樣品適量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3.3 定量方法

根據(jù)5-羥甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯對照品的色譜保留時間，對益腎保健酒樣品中的5-羥甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯成分進行定性分析，利用標準曲線外標法定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

利用儀器上自帶的Chromeleon7軟件用于處理色譜圖、繪制標準曲線，利用Excel軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)對樣品溶液進行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-羥甲基糠醛在285 nm 處響應(yīng)最強，阿魏酸在322 nm 處有較強吸收，肉桂醛在280 nm處有較強吸收，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I在270 nm處響應(yīng)最強，藁本內(nèi)酯最大吸收波長為281 nm。綜合各組分紫外吸收情況，確定采用檢測波長280 nm同時測定5-羥甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯，在此波長下基線較穩(wěn)定，未見明顯漂移。

2.1.2 色譜柱

分別考察了Waters T3-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo Syncronis-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sepax HP-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)對9種目標物的分離效果。結(jié)果表明，當使用Waters T3-C18柱時，肉桂醛與朝藿定A 色譜峰不能有效分離，其余兩種色譜柱均能有效分離以上9 種有效成分，相同條件下Sepax HP-C18柱色譜峰形最好，且未見其它雜質(zhì)的干擾，因此選擇Sepax HP-C18柱。

2.1.3 流動相選擇

分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液三種流動相體系，結(jié)果表明，以乙腈-水作為流動相時，阿魏酸成分未出峰。乙腈的傳質(zhì)阻力小于甲醇，乙腈和甲醇分別用同樣的比率與水混合時，乙腈的洗脫能力更強，當使用甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相時，寶藿苷I 與藁本內(nèi)酯峰未能洗脫，因此選用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相。

2.2 色譜分離效果

分別精密吸取9種目標物混合對照品溶液及樣品溶液，按照1.2色譜條件進樣檢測，色譜圖見圖1。由圖1可知，9種目標物混合對照品及樣品在相同時間均有色譜峰出現(xiàn)，且各色譜峰之間分離度大于1.5，分離效果良好，表明益腎保健酒中含有5-羥甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯這9種有效成分。

圖1 混合對照品溶液及益腎保健酒樣品溶液色譜圖

2.3 線性方程與檢出限

將9 種目標物混合對照品溶液稀釋成5 個不同濃度水平的混合對照品工作溶液，按照1.2色譜條件進樣測定，以各目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(y)，建立標準曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

將9 種目標物對照品溶液進行適當稀釋，制得一系列不同濃度的溶液，分別進樣測定，以信噪比3對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限，信噪比10對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限。9 種目標物線性范圍、線性方程、方法檢出限和定量限結(jié)果見表3。結(jié)果表明，9 種目標物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表3 9種目標物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 精密度試驗

取同一批次益腎保健酒樣品，按照1.3.2方法處理樣品6 份，按1.2 色譜條件進樣檢測，記錄色譜峰面積，測定數(shù)據(jù)見表4。由表4可知，9種目標物色譜峰面積的相對標準偏差分別為0.34%、0.39%、0.51%、0.29%、0.33%、0.57%、0.80%、1.13%、1.00%，均小于2%，表明該方法精密度良好。

表4 益腎保健酒中9種目標成分的精密度試驗結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一益腎保健酒樣品溶液，分別放置0、15、30、46、76、104 h，按1.2 色譜條件進樣檢測，記錄色譜峰面積，測定結(jié)果見表5。由表5可知，9種目標物色譜峰面積的相對標準偏差分別為0.59%、1.19%、0.33%、1.49%、0.66%、0.62%、0.78%、0.79%、0.12%，表明益腎保健酒樣品溶液中各成分在室溫條件下放置104 h穩(wěn)定性良好。

表5 益腎保健酒中9種目標物的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6 加標回收試驗

精密量取已知含量的同一益腎保健酒5 mL 至10 mL 容量瓶中，分別按照樣品中各成分含量的不同水平加入對應(yīng)對照品適量，用35%乙醇定容。按1.2 色譜條件進行測定，計算各成分加標回收率，結(jié)果見表6。由表6可知，9種目標物的平均加標回收率 分 別 為 97.00%、99.98%、95.87%、97.74%、101.73%、98.46%、101.50%、99.53%、96.12%。表明該方法準確度較高。

表6 益腎保健酒中9種目標物的加標回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

采用高效液相色譜測定益腎保健酒中5-羥甲基糠醛、阿魏酸、肉桂醛、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、藁本內(nèi)酯的含量，該方法操作簡便，重復性好，準確度高，可為益腎保健酒生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控及品質(zhì)評價提供參考依據(jù)。