超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛羊肉中瘦肉精

孫麗，邢海艷，吳義春，趙燕，周義國(guó)，孟慶順

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇淮安 223000）

瘦肉精是一類藥物的統(tǒng)稱，能夠抑制動(dòng)物脂肪生成，促進(jìn)瘦肉生長(zhǎng)的物質(zhì)都可以稱為瘦肉精。能夠?qū)崿F(xiàn)此類功能的物質(zhì)主要是一類叫做β-受體激動(dòng)劑(也稱β-興奮劑)的藥物，其中較常見的有鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等。β-受體激動(dòng)劑類藥物進(jìn)入牲畜體內(nèi)后能夠改變養(yǎng)分的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)，尤其是促進(jìn)骨路肌蛋白瘦肉質(zhì)的合成，加速脂肪的轉(zhuǎn)化和分解，提高牲畜的瘦肉率[1]。但由于瘦肉精在動(dòng)物體內(nèi)吸收快，代謝慢，人食用瘦肉精殘留量較高的動(dòng)物產(chǎn)品后，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如呼吸困難、心跳加速、頭暈頭疼等癥狀，嚴(yán)重時(shí)能引起心臟病、高血壓等疾病[2?4]。目前我國(guó)瘦肉精監(jiān)管的對(duì)象主要是飼料和豬肉，牛羊肉由于其檢測(cè)技術(shù)的相對(duì)缺乏，存在較高的瘦肉精檢出風(fēng)險(xiǎn)[5?6]。隨著我國(guó)居民肉類消費(fèi)結(jié)構(gòu)逐漸升級(jí)，以及受非洲豬瘟的影響，牛羊肉消費(fèi)需求不斷增加，因此為了確保牛羊肉的食品質(zhì)量與安全，亟需開展測(cè)定其瘦肉精的方法研究。

當(dāng)前瘦肉精的測(cè)定方法主要有膠體金試紙條法[7?8]、酶聯(lián)免疫法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10?11]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12?14]等。膠體金試紙條法和酶聯(lián)免疫法是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的快篩方法，此方法具有操作簡(jiǎn)便、快捷、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但存在難以一次分析多個(gè)化合物且會(huì)出現(xiàn)一定假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要復(fù)雜的衍生化步驟以增強(qiáng)目標(biāo)物的揮發(fā)性，且分析物不穩(wěn)定、分析耗時(shí)較長(zhǎng)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以其高靈敏度和專一性測(cè)定目標(biāo)物，近幾年來在瘦肉精檢測(cè)方法研究中應(yīng)用越來越多。筆者建立了一種準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)單的測(cè)定牛羊肉中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺3種瘦肉精含量的方法，為食品安全監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：AB QQQ4000+型，美國(guó)AB SCIEX公司。

電子天平：XS205DU 型，感量為0.01 mg，梅特勒托利多科技(中國(guó))有限公司。

高速冷凍離心機(jī)：MULTIFUGE-X1R 型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

超聲波清洗器：KH7200DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

超純水機(jī)：GenPure Pro 型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：各組分質(zhì)量濃度均100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。

克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3 內(nèi)標(biāo)溶液：質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。

甲酸：色譜純，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

乙酸銨：色譜級(jí)，上海麥克林生化科技股份有限公司。

獸藥殘留專用提取包：日本島津公司。

獸藥殘留專用凈化管：日本島津公司。

牛羊肉樣品：市售。

實(shí)驗(yàn)用氣：自制高純氮?dú)猓兌却笥?9.9%。

1.2 溶液配制

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：各組分質(zhì)量濃度均為10 μg/mL，準(zhǔn)確移取克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標(biāo)線。

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：各組分質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，準(zhǔn)確移取克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL至10 mL容量瓶中，以甲醇稀釋并定容至標(biāo)線。

混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3質(zhì)量濃度均為10 μg/mL，準(zhǔn)確移取克倫特羅-D9 內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL、沙丁胺醇-D3 內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL 至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標(biāo)線。

混合內(nèi)標(biāo)中間液：克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，準(zhǔn)確移取混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液1 mL 至10 mL 容量瓶中，以甲醇稀釋并定容至標(biāo)線。

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.04 mL，加入混合內(nèi)標(biāo)中間液100 μL 至10 mL 容量瓶中，以空白基質(zhì)溶液(陰性樣品溶液)定容至標(biāo)線，得3 種組分質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度均為10 ng/mL。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜儀

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱[100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流動(dòng)相：A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸銨)，B 相為甲醇；流動(dòng)相流量：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；淋洗方式：梯度淋洗，淋洗程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度淋洗程序

1.3.2 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧電離源(ESI)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；碰撞氣壓力：48.3 kPa；氣簾氣壓力：241.3 kPa；霧化氣壓力：413.7 kPa；輔助加熱氣壓力：379.2 kPa；霧化電壓：5 500 V；離子傳輸溫度：550 ℃；克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺及內(nèi)標(biāo)物克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品預(yù)處理

稱取5 g 均勻樣品，置于50 mL 離心管中，加入50 μL 混合內(nèi)標(biāo)中間液，然后加入5 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸乙腈溶液，均質(zhì)1 min，加入獸藥殘留專用提取包，快速振搖渦旋提取2 min，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。取離心后的樣品上清液加入到凈化管中，渦旋2 min，以13 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清液作為樣品溶液。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

在1.3儀器工作條件下，對(duì)克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做空白試驗(yàn)。以克倫特羅、沙丁胺醇特征離子色譜峰的峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物特征離子色譜峰的峰面積比值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的克倫特羅、沙丁胺醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，采用內(nèi)標(biāo)法定量；以萊克多巴胺特征離子色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的萊克多巴胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液、混合內(nèi)標(biāo)中間液進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定最佳的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)、去簇電壓和碰撞電壓，優(yōu)化結(jié)果見1.3.2。

2.2 液相條件的優(yōu)化

分別以純水、0.1%甲酸溶液、5 mmol 乙酸銨溶液、0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸銨)為水相，以甲醇和乙腈為有機(jī)相，考察了不同流動(dòng)相組合時(shí)目標(biāo)物的色譜圖，各目標(biāo)物色譜峰特點(diǎn)見表3。

表3 不同流動(dòng)相的出峰情況

結(jié)果表明，水相流動(dòng)相選擇0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸銨)，有機(jī)相選擇甲醇時(shí)，3 種瘦肉精的峰形對(duì)稱，無(wú)拖尾，響應(yīng)值高，線性關(guān)系好，流動(dòng)相中添加甲酸可提高目標(biāo)化合物的離子化效率，添加乙酸銨可調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，使目標(biāo)化合物色譜峰形對(duì)稱。因此選擇0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸銨)與甲醇作為流動(dòng)相，色譜圖見圖1和圖2。

圖1 克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子色譜圖

圖2 混合內(nèi)標(biāo)溶液的總離子色譜圖

2.3 色譜柱的選擇

由于克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺均屬于極性化合物，常用C18色譜柱進(jìn)行色譜分離。分別使用Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱[100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，沃 特 世 科 技(上 海)有 限 公 司]、Phenomenex KINEVEXR C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司)、Thermo AcclaimTMTrinityTMB1 C18柱(100 mm ×2.1 mm，3 μm，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱[100 mm ×3 mm，2.7 μm，安捷倫科技(中國(guó))有限公司]4 種型號(hào)色譜柱對(duì)3 種瘦肉精的分離效果進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱分離效果最好，峰形對(duì)稱，無(wú)拖尾，因此選擇Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱。

2.4 線性范圍和定量限

按1.5 實(shí)驗(yàn)步驟分別測(cè)定克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以空白樣品（加標(biāo)準(zhǔn)溶液）的3倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，3 種瘦肉精質(zhì)量濃度在0.1～4.0 ng/mL 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998，檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg。

表4 3種瘦肉精的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

向牛羊肉陰性樣品中添加克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，使樣品中3 種目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均分別為0.2、0.4、2.0 μg/kg，每個(gè)點(diǎn)平行制備6 份，同時(shí)做空白試驗(yàn)，按照1.5 實(shí)驗(yàn)步驟處理樣品，測(cè)定樣品中克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺，結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表5 可知，3 種瘦肉精平均回收率為65.3%～105.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.95%～9.65%(n=6)，空白試驗(yàn)中未檢出克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 方法比對(duì)

對(duì)從市場(chǎng)抽檢的103 批牛羊肉樣品檢測(cè)，代表性的羊排樣品色譜圖如圖3，在這些樣品檢測(cè)過程中未發(fā)現(xiàn)有干擾目標(biāo)物測(cè)定的雜質(zhì)峰。103批牛羊肉的檢測(cè)結(jié)果見表6，其中3批羊肉、1批羊排和1批牛肉檢出克倫特羅，與按標(biāo)準(zhǔn)方法[15]處理相比，結(jié)果誤差均在10%之內(nèi)，滿足檢測(cè)需求。

圖3 羊排樣品總離子色譜圖

表6 牛羊肉中瘦肉精含量檢測(cè)結(jié)果比較 μg/kg

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)牛羊肉中3 種瘦肉精進(jìn)行提取凈化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)牛羊肉樣品中瘦肉精殘留量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。該方法實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單，分離效果好，靈敏度高，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可以更加簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的測(cè)定牛羊肉樣品中的瘦肉精，為食品監(jiān)管和檢測(cè)提供新的方法。