夏天無(wú)片對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元凋亡的影響＊

陳 喬，余海燕，李俊波，李佳麗，徐文菲，胡卓瑤

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；2. 萍鄉(xiāng)衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 萍鄉(xiāng) 337006）

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是指由原發(fā)或繼發(fā)性腦血管病變引起的腦組織缺血缺氧，以記憶認(rèn)知減退、日常生活障礙等為主要臨床表現(xiàn)的綜合征。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道[1]，至2040 年全球癡呆患病人數(shù)預(yù)計(jì)增長(zhǎng)到8100萬(wàn)，其中VD約占比20%，僅次于阿爾茨海默?。s60%），嚴(yán)重困擾中老年人身心健康。作為迄今唯一可以防治的癡呆類型，探尋其有效治療途徑意義重大。

中藥夏天無(wú)（Corydalis Decumbentis Rhizoma，CDR）具有活血舒筋、除濕通絡(luò)之功[2]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)夏天無(wú)對(duì)抗血小板聚集作用明顯[3]，同時(shí)可顯著降低血液流變及流速指標(biāo)，對(duì)治療缺血性腦血管疾病療效顯著[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，夏天無(wú)可減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而改善VD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。張惠琴等[6]發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能是與下調(diào)VD 模型大鼠海馬組織中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）水平有關(guān)，而對(duì)其他凋亡相關(guān)蛋白Bax 及B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）表達(dá)的調(diào)節(jié)作用未見(jiàn)報(bào)道。本課題應(yīng)用夏天無(wú)片干預(yù)VD 模型大鼠，旨在進(jìn)一步探討其抑制神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

藥品均購(gòu)于江西省中醫(yī)院藥房，夏天無(wú)片由江西天施康公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.3 g/片，每粒含原阿片堿不少于0.9 mg，批號(hào)：20010101；尼莫地平片由亞寶藥業(yè)公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.02 g/片，批號(hào)：170606。配制：將夏天無(wú)片經(jīng)研磨后加入適量蒸餾水配置成20 mg·mL-1、40 mg·mL-1、80 mg·mL-1三種濃度的混懸液，尼莫地平片以同法配置成濃度為1 mg·mL-1的混懸液，將所有混懸液置于4℃下保存，用前加熱搖勻。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡SD健康雄性大鼠84只，體質(zhì)量180-220 g，采購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(贛)2018-0003，合格證號(hào)：0002396，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：JZLLSC20220574。

1.3 試劑與儀器

TUNEL 熒光試劑盒（凱基生物，KGA7061）；Bcl-2抗體（安諾倫，26593-1-AP）；Bax 兔單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，A19684）；SABC 免疫組化試劑盒（博士德，SA1022）；DAB 顯色試劑盒（博士德，AR1022）；Morris 水迷宮裝置（北京藥物研究所）；石蠟包埋、切片機(jī)（德國(guó) Leica）；Western blot 電泳電轉(zhuǎn)裝置（上海天能）；Advanced 3.2 圖像軟件（德國(guó)麥克奧迪公司）。

1.4 造模方法

VD大鼠模型采用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（2-VO）法[7]制備。所有大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，無(wú)異常，隨機(jī)選取14 只劃為假手術(shù)對(duì)照組。剩余大鼠術(shù)前禁食12 h，正常飲水，7%水合氯醛（0.35 g·kg-1）腹腔注射進(jìn)行麻醉，經(jīng)備皮、消毒后，分離一側(cè)頸總動(dòng)脈，分別結(jié)扎近心端及遠(yuǎn)心端，并從中間剪斷，術(shù)后于創(chuàng)口處撒入阿莫西林防止傷口感染。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈，但不進(jìn)行結(jié)扎。1 周后按照以上方法對(duì)另一側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行處理。

1.5 分組與給藥

據(jù)臨床人用劑量折算大鼠用量，設(shè)為夏天無(wú)中劑量組，各組間按等比排列[8]。造模完成后采用雙盲法將70 只大鼠隨機(jī)均分為模型對(duì)照組、尼莫地平組（0.3 g·kg-1），夏天無(wú)高（0.8 g·kg-1）、中（0.4 g·kg-1）、低（0.2 g·kg-1）劑量組。經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)后，于造模后第2天進(jìn)行動(dòng)物灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)40 天。假手術(shù)對(duì)照組及模型對(duì)照組灌予2 mL去離子水。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)

給藥結(jié)束后采用Morris 水迷宮進(jìn)行空間定位、定向能力檢測(cè)。為讓大鼠提前熟悉水迷宮環(huán)境，需在實(shí)驗(yàn)前1 天，讓其自由游泳2 min。開(kāi)始定位航行試驗(yàn)時(shí)，池中放入平臺(tái)，觀察記錄大鼠找到平臺(tái)所需時(shí)間（逃避潛伏期）。連續(xù)5天，每日2次。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，觀察統(tǒng)計(jì)大鼠穿越原平臺(tái)區(qū)域次數(shù)。

1.7 取材

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從各組中隨機(jī)抽取7 只進(jìn)行灌注固定，余下大鼠采取頸椎脫臼取海馬組織冷凍備用。

1.8 HE染色、TUNEL及免疫組織化學(xué)染色、

腦組織依次經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，浸蠟，石蠟包埋后，行冠狀位切片，厚4 μm，嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)染色步驟操作。HE 染片在400 倍光鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。TUNEL 采用熒光顯微鏡下隨機(jī)3 個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。運(yùn)用兔抗鼠Bax、Bcl-2 多克隆抗體（滴度均為1∶200）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下隨機(jī)3 個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。

1.9 Western blot蛋白表達(dá)檢測(cè)

各組大鼠依次進(jìn)行海馬組織蛋白抽提，BCA 法蛋白濃度測(cè)定，加熱變性。采用SDS-PAGE 電泳，上樣量為30 μg，PVDF 膜濕轉(zhuǎn)1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，Bax、Bcl-2（1:1500）一抗4℃孵育過(guò)夜。羊抗兔IgG（1∶8000）二抗孵育1 h，高靈敏度化學(xué)發(fā)光顯影。Image J測(cè)定灰度值，以β-actin（1∶50000）為參照計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，除定位航行實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量多因素方差分析[9]外，其余數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布選用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 夏天無(wú)片對(duì)VD模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

2.1.1 夏天無(wú)片對(duì)VD模型大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響

結(jié)果顯示，第1 天各組大鼠平均逃避潛伏期無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型組大鼠自第2 天起平均逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05 或P＜0.01）；較模型組，尼莫地平組平均逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05 或P＜0.01），夏天無(wú)各劑量組平均逃避潛伏期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），尤以夏天無(wú)高、中劑量組效果明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間平均逃避潛伏期的比較（n=14）

2.1.2 夏天無(wú)片對(duì)VD模型大鼠空間記憶能力的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠在90 s 內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.01），有極顯著性差異；較模型組，夏天無(wú)低劑量組與模型組差異不明顯（P＞0.05），夏天無(wú)中、高劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)較于模型組明顯增加（P＜0.01），尼莫地平組平均逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05或P＜0.01），治療組組間無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的比較（n=14）

2.2 夏天無(wú)片對(duì)VD模型大鼠海馬CA1區(qū)病理改變的影響

假手術(shù)組大鼠錐體細(xì)胞排列緊密，胞膜完整，胞漿豐富，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，核仁清晰明顯。模型組與假手術(shù)組比較，錐體細(xì)胞層變薄，神經(jīng)元排列松散紊亂，數(shù)目明顯減少，結(jié)構(gòu)不同程度受損，部分細(xì)胞胞膜破裂，細(xì)胞核深染，染色質(zhì)固縮甚至裂解。與模型組比較，各治療組上述病理改變不同程度上有所改善，夏天無(wú)中、高劑量組更為明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色(×400)

2.3 夏天無(wú)片對(duì)VD模型大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

紅色熒光即為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)未見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞。模型組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組相比顯著增多（P＜0.01）；較模型組，尼莫地平組海馬CA1 區(qū)凋亡細(xì)胞明顯減少（P＜0.01），經(jīng)夏天無(wú)片干預(yù)后，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量較模型組大鼠明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中夏天無(wú)低劑量組（P＜0.05），高、中劑量組（P＜0.01）。見(jiàn)圖4和表1。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bax、Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元比較（個(gè)，，n=7）

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bax、Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元比較（個(gè)，，n=7）

注：與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

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圖4 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL染色(×200)

2.4 夏天無(wú)片對(duì)VD 模型大鼠海馬CA1 區(qū)Bax、Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元的影響

棕黃色顆粒為Bax、Bcl-2 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，主要分布在胞質(zhì)區(qū)。與假手術(shù)相比，模型組海馬CA1 區(qū)Bcl-2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.01），較模型組，尼莫地平組海馬CA1 區(qū)Bcl-2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.05），夏天無(wú)中、高劑量組則較模型組有顯著增加（P＜0.01）；模型組較假手術(shù)組Bax 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.01），夏天無(wú)高劑量組及尼莫地平組則較模型組顯著減少（P＜0.01）。見(jiàn)圖5、圖6和表1。

圖5 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2免疫組化染色(×400)

圖6 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bax免疫組化染色(×400)

2.5 夏天無(wú)片對(duì)VD 模型大鼠海馬Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬Bcl-2/Bax 水平降低，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異（P＜0.01）；夏天無(wú)各劑量組及尼莫地平組相較于模型組Bcl-2/Bax水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)圖7。

圖7 各組大鼠海馬Bcl-2/Bax水平（n=7）

3 討論

VD 高發(fā)人群為中老年，伴有不同程度智力及認(rèn)知功能障礙表現(xiàn)。中醫(yī)將其歸屬于“癡呆”、“呆病”等范疇。清代王清任有言：“靈機(jī)記性不在心，在腦。高年無(wú)記性者，髓海漸空也?！卑V呆病位在腦，髓空為其基本病機(jī)。腦為髓海，元神之府，腦榮則靈機(jī)而有生氣。精血同源，精賴血得以生，精充則化髓有源，腦有所養(yǎng)。中醫(yī)所謂“久病必虛，久病必瘀”。

中國(guó)藥典載夏天無(wú)具有活血通絡(luò)之功，用于血管性癡呆治療，符合中醫(yī)“淤血去則新血生”的觀點(diǎn)。夏天無(wú)片由單味中藥夏天無(wú)制成，生物堿類是夏天無(wú)的主要化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，夏天無(wú)具有鎮(zhèn)痛、提高記憶力等多種作用。近年來(lái)，對(duì)于夏天無(wú)的作用研究越來(lái)越重視，夏天無(wú)對(duì)血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶障礙有一定改善作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)夏天無(wú)片干預(yù)VD 發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間推移各劑量組能不同程度上改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)于其病理改變也不同程度上有所改善，再次驗(yàn)證了夏天無(wú)片防治VD的療效。

海馬是大腦中與認(rèn)知與記憶功能相關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū)之一。研究發(fā)現(xiàn)[10]，海馬通過(guò)經(jīng)典的三突觸通路對(duì)腦內(nèi)信息進(jìn)行編碼儲(chǔ)存，CA1 區(qū)作為突觸通路的主要輸出端，參與記憶形成的整個(gè)過(guò)程。電生理實(shí)驗(yàn)表明[11]，CA1區(qū)錐體細(xì)胞對(duì)包括缺血缺氧、應(yīng)激等刺激的反應(yīng)更加敏感。阻斷腦血流時(shí)，CA1 區(qū)微循環(huán)血容量減少，且明顯低于海馬體其它分區(qū)?？梢?jiàn)，海馬CA1區(qū)可作為衡量藥物對(duì)缺血性血管性癡呆療效的一個(gè)主要觀察區(qū)。所以，本課題組從神經(jīng)元凋亡角度，選擇海馬CA1 區(qū)為觀察對(duì)象，進(jìn)一步探討了夏天無(wú)對(duì)神經(jīng)元保護(hù)的可能作用機(jī)制。

凋亡是細(xì)胞自發(fā)的程序性死亡，生物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持有賴于體內(nèi)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)平衡。Bcl-2、Bax 是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)控蛋白，其中Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的調(diào)控蛋白，Bax 是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的調(diào)控蛋白。研究表明，Bcl-2和Bax表達(dá)水平的高低與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)，Bcl-2與Bax的比值決定細(xì)胞的存活能力。Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高時(shí)，抑制細(xì)胞凋亡；Bax 蛋白表達(dá)水平升高時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，腦缺血缺氧可引起細(xì)胞凋亡，經(jīng)夏天無(wú)片干預(yù)治療后，VD 大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量可有效減少。本課題組進(jìn)一步采用免疫組化和蛋白印跡生物學(xué)實(shí)驗(yàn)從定位、定性、定量等方面對(duì)Bax、Bcl-2蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VD 模型大鼠相較于假手術(shù)組，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目增多，Bcl-2、Bax陽(yáng)性神經(jīng)元皆增多，Bcl-2/Bax水平降低，證實(shí)了2-VO 造模方法引起腦組織缺血缺氧最終可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡，造成記憶認(rèn)知能力損害。夏天無(wú)片則可明顯提高Bcl-2/Bax 水平，增加Bcl-2 陽(yáng)性神經(jīng)元而減少Bax 陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)，減弱海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡效應(yīng)，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，從而起到防治血管性癡呆的療效。

綜上，夏天無(wú)片有效治療血管性癡呆的機(jī)制可能是通過(guò)提高海馬Bcl-2/Bax 水平，發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，進(jìn)而減少細(xì)胞程序性死亡，達(dá)到神經(jīng)元保護(hù)作用。但本研究?jī)H從Bax，Bcl-2 基因角度闡明了凋亡的淺層機(jī)理，而對(duì)有關(guān)夏天無(wú)片抑制神經(jīng)元凋亡的具體作用通路并未涉及，以期后續(xù)實(shí)驗(yàn)作深入探討。