基于IL-6/STAT3通路探討參芪復(fù)方對(duì)缺血性心力衰竭大鼠Th17/Treg平衡的影響＊

史勝楠，苗 蘭，李 磊，馬彥雷，孟紅旭，史 躍，王培利，劉建勛＊＊

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院/國(guó)家中醫(yī)心血管病醫(yī)學(xué)研究中心 北京 100091）

缺血性心力衰竭（Ischemic heart failure，IHF）是由于冠狀動(dòng)脈病變引起管腔狹窄導(dǎo)致血液灌流受阻使心肌處于長(zhǎng)期缺血狀態(tài)，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能受損而表現(xiàn)出的一組臨床綜合征，是發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家心血管發(fā)病率和死亡率的主要原因[1]。目前，IHF的治療策略是在預(yù)防或減少心臟缺血負(fù)擔(dān)的基礎(chǔ)上延緩心室重構(gòu)，如早期的血運(yùn)重建術(shù)及神經(jīng)內(nèi)分泌激素抑制劑的應(yīng)用[2]。這些治療方案的不斷優(yōu)化在一定程度上降低了IHF的發(fā)病率，但再住院率仍居高不下，住院后的5年生存率僅為25%[3]。同時(shí)，在藥物的長(zhǎng)期使用中，電解質(zhì)、體液代謝紊亂等不良反應(yīng)也導(dǎo)致了患者依從性變差，臨床遠(yuǎn)期療效大打折扣。因此，探尋IHF新的治療策略和靶點(diǎn)具有重要意義。

近年來(lái)，IHF 被認(rèn)為是一種慢性免疫系統(tǒng)激活的狀態(tài)[4]，在心臟缺血性損傷發(fā)生的早期階段，輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Regulatory cell，Treg）作為CD4+T 效應(yīng)細(xì)胞亞群之一，可以共同協(xié)調(diào)死亡心肌細(xì)胞的清除，參與瘢痕肉芽組織形成，并通過(guò)分泌促血管生成、促存活和抗炎介質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)隨后的心臟修復(fù)和炎癥消退[5]。然而持續(xù)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)會(huì)使得白細(xì)胞介素-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（Interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3，IL-6/STAT3）信號(hào)通路異常激活，促使Th17 細(xì)胞過(guò)度分化，同時(shí)抑制Treg 細(xì)胞分化，導(dǎo)致Th17/Treg 細(xì)胞失衡[6]，誘導(dǎo)不利的心臟重塑，加速IHF的發(fā)展。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6/STAT3 信號(hào)通路維持Th17/Treg 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡可能是防治IHF 的靶點(diǎn)之一。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為IHF屬于“胸痹”、“喘證”等范疇，其發(fā)生和發(fā)展與“氣”的功能失調(diào)有關(guān)。心氣與宗氣虧虛，導(dǎo)致血瘀、痰飲、寒凝等病理產(chǎn)物堆積心脈，出現(xiàn)心悸、胸悶、喘憋等癥狀。疾病后期氣、血、水濕、痰瘀互為因果，形成惡性循環(huán)。因此，益氣是斬?cái)嗖涣疾±懋a(chǎn)物的基礎(chǔ)，是恢復(fù)心主血脈功能的前提。參芪復(fù)方是本課題組通過(guò)總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)合正交設(shè)計(jì)和劑量篩選配制而成，以人參、黃芪為主藥，人參補(bǔ)益心肺宗氣；黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)，利水消腫。前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明參芪復(fù)方在改善IHF 大鼠心功能、減輕心肌纖維化方面具有良好藥效[7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪多糖可以提高免疫抑制模型小鼠Treg 比例，降低CD4+T 細(xì)胞數(shù)量，抑制IL-17 分泌活性[8]；人參皂苷CK 可以減少TNF-α、IL-6含量，增加Treg 細(xì)胞含量，減輕心梗小鼠心臟炎癥損傷[9]。但是參芪復(fù)方對(duì)于IHF 模型大鼠IL-6/STAT3 通路及Th17/Treg 免疫平衡的影響目前還未有明確報(bào)道，本研究通過(guò)構(gòu)建IHF大鼠模型，對(duì)此進(jìn)行初步研討。

1 資料與方法

1.1 藥物

參芪復(fù)方由人參3 g、黃芪30 g 組成（河北百草康神藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為：2003011、2009012）。復(fù)方制備方法如下：①分別按照人參、黃芪1:10 的原料配比稱取人參、黃芪，加藥材10 倍重量的水煎煮3 次，每次2 h，每次煎煮藥液經(jīng)過(guò)濾去渣后合并，攪拌均勻；②將步驟①所得的濾液進(jìn)行真空濃縮，濃縮到以水作參考密度，60℃時(shí)相對(duì)密度為（1.05-1.10）g·cm-3的稠膏（出膏率為48%）再加入適量糊精（生藥與糊精重量比為10:1），攪拌均勻，過(guò)100 目篩，取篩下物進(jìn)行常規(guī)噴霧干燥，得到參芪復(fù)方。陽(yáng)性對(duì)照藥：福辛普利（規(guī)格10 mg，中美上海施貴寶制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19980197）。

1.2 動(dòng)物

雄性SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量（190±10）g，許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（25±2）℃，濕度（50%±6%），光照12 h，晝夜交替，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，倫理批件號(hào)為2019XLC016-2。

1.3 試劑

ELISA 試劑盒：IL-17A（美國(guó)abbkine，貨號(hào)：KET9005）、IL-6、TNF-α（美國(guó)raybio，貨號(hào)：ELRTNFa-1、ELR-1L6-1）、IL-10（中國(guó)酶免，貨號(hào)：MM-0195R1）；一抗FOXP3、RORγt（美國(guó)proteintech，貨號(hào)：22228-1-AP、13205-AP）；一抗IL-6、STAT3、STAT3（phospho S727）（英國(guó)abcam，貨號(hào)：ab9324、ab68153、ab32143）；流式抗體CD4-PerCP、CD3-FITC、IL-17-PE、CD25-PE、FoxP3-APC（美國(guó)eBioscien，貨號(hào)：46-0040-82、11-0030-82、12-7177-81、12-0390-82、17-5773-82）；RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（含10% FBS）（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：PM150110B）、Leukocyte Activation Cocktail（美國(guó)BD，貨號(hào)：550583）、破膜固定緩沖液套件（德國(guó)Thermo Fisher，貨號(hào)：00-5523-00）。

1.4 儀器

Vevo2100 型高分辨率超聲影像系統(tǒng)（加拿大Vissual Sonics）；酶標(biāo)儀/酶聯(lián)免疫分析儀（美國(guó)博騰Epoch2）；電泳儀、小垂直電泳槽、凝膠成像儀（美國(guó)博樂(lè)1645050、1658001、DOC XR+）；FACS 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD FACS Canto Plus）；37℃，5% CO2孵箱（德國(guó)Thermo Fisher）。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物造模及分組

大鼠術(shù)前1 天禁食水，采用結(jié)扎冠脈左前降支制備心梗后心衰模型[9]，麻醉大鼠后將其四肢仰臥位固定至鼠板，左胸部脫毛，行氣管插管，接入小動(dòng)物呼吸機(jī)；隨后沿左側(cè)第4 肋間開(kāi)胸，鈍性分離肌肉，擴(kuò)胸器撐開(kāi)肋骨暴露心臟，剪開(kāi)心包，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界1-2 mm 處無(wú)創(chuàng)縫線穿線，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支作為模型組，假手術(shù)組只穿線不接扎；以結(jié)扎部位以下心肌變白，搏動(dòng)減弱且心電圖出現(xiàn)ST段弓背向上明顯抬高為成功標(biāo)志；縫合，在傷口處涂抹青霉素。待大鼠蘇醒后取出氣管插管，送至動(dòng)物房，恢復(fù)正常飲食飲水。造模成功大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、參芪復(fù)方低、中、高劑量組、福辛普利組各10只，假手術(shù)組10只。

1.5.2 給藥

全省而言，陜西延安、渭南、咸陽(yáng)、寶雞、銅川、榆林六個(gè)蘋果主產(chǎn)區(qū)蘋果全部遭受倒春寒凍害，這次低溫凍害降溫幅度大、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，為50年不遇的極端災(zāi)害性天氣，凍害期間正值蘋果花期，導(dǎo)致全省大范圍果樹(shù)遭受凍害，對(duì)果品產(chǎn)量、質(zhì)量造成了多年來(lái)極為罕見(jiàn)的嚴(yán)重影響。

根據(jù)課題組臨床試驗(yàn)用藥劑量按照體表面積換算法[10]得出大鼠的給藥劑量，參芪復(fù)方低、中、高劑量分別為1.66、3.33、4.99 g·kg-1，福辛普利片1.05 mg·kg-1。各給藥組連續(xù)灌胃5 周，每日1 次，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.5.3 HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變

心超檢測(cè)后，開(kāi)胸取出大鼠心臟，用冰浴生理鹽水沖洗，切取部分左室前壁心肌組織固定于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)不同濃度的乙醇溶液逐級(jí)脫水，二甲苯中透明，石蠟缸浸蠟，倒入模具，進(jìn)行包埋切片；將切片依次放入二甲苯、無(wú)水乙醇中梯度脫蠟；蘇木素浸染6 min，自來(lái)水洗2 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，水洗7 min，伊紅染2 min，流水快速?zèng)_洗，切片依次進(jìn)行無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照，進(jìn)行圖像采集分析[11]。

1.5.4 心臟超聲檢測(cè)大鼠心功能

末次給藥結(jié)束后麻醉大鼠，將胸部左側(cè)鎖骨至肋下緣進(jìn)行脫毛處理。在備皮處涂抹醫(yī)用超聲耦合凝膠，用探頭定位在乳頭肌水平長(zhǎng)軸切面，頻率設(shè)定17.5 MHz，進(jìn)行M 型超聲檢查。選用左室收縮末期內(nèi)徑（LVDs）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮末期容積（LVESV）、左室舒張末期容積（LVEDV）評(píng)價(jià)左心室重塑情況，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、每搏輸出量（SV）、心輸出量（CO）、短軸縮短率（LVFS）評(píng)價(jià)心功能情況，以上指標(biāo)均連續(xù)測(cè)量3個(gè)周期，取平均值。

1.5.5 ELISA 檢測(cè)大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10含量

腹主動(dòng)脈取血后，靜置30 min，低溫高速離心機(jī)以4℃，3000 r·min-1離心10 min，取上層血清-80℃凍存?zhèn)溆?。采用ELISA 法檢測(cè)血清IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10水平，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒方法進(jìn)行操作。

1.5.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠脾臟及外周血Th17、Treg含量

摘取大鼠脾臟，用冰浴生理鹽水沖洗，研磨過(guò)濾至流式管，以1500 r·min-1離心5 min，棄上清，用PBS重懸后分為兩管。一管用細(xì)胞刺激劑（含蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）進(jìn)行體外刺激，37℃，5% CO2孵育箱培養(yǎng)6 h后用PBS 洗滌1 次，依次加入5 μL CD4、CD3 抗體，室溫避光孵育20 min后離心棄上清，加入1 mL細(xì)胞破膜緩沖液Ⅰ，室溫避光孵育1 h；加入2 mL 細(xì)胞破膜緩沖液Ⅱ混勻，1500 r·min-1離心5 min，棄上清；加入5 μL抗大鼠IL-17A 抗體，室溫避光孵育30 min，加細(xì)胞破膜緩沖液Ⅱ 2 mL，1500 r·min-1離心5 min，棄上清，加入400 μL PBS 重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)；另一管進(jìn)行Treg 檢測(cè)，按上述步驟先進(jìn)行CD4、CD25染色，然后用細(xì)胞核膜試劑盒操作說(shuō)明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破核膜處理，加入5 μL FoxP3 抗體，孵育30 min，PBS 重懸上機(jī)檢測(cè)。大鼠外周血檢測(cè)方法同上，其中加入細(xì)胞膜表面抗體孵育后，需進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，余步驟同前。

1.5.7 免疫組化觀察大鼠心肌組織IL-6、STAT3、p-STAT3表達(dá)

將心肌組織切片依次浸入二甲苯、梯度乙醇中脫蠟，水洗后，檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液煮8 min（STAT3采用EDTA 抗原修復(fù)液），自然冷卻后用PBS 溶液洗滌3 次；切片放入3% H2O2，室溫避光孵育15 min，水洗3 次；在組化圈內(nèi)滴加3% BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，在切片上滴加用PBS 按比例稀釋好的一抗（IL-6 1∶800，STAT3 1∶800、p-STAT3 1∶800），平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜；PBS 清洗3 次后加入二抗（HRP標(biāo)記），室溫孵育50 min；PBS 清洗后，切片稍甩干，加入DAB 顯色液10 min 后終止顯色；蘇木素復(fù)染1 min，水洗返藍(lán)；脫水后中性樹(shù)膠封片、掃描，HALO 數(shù)字病理圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積[12]。

1.5.8 Western blot檢測(cè)大鼠心肌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt、FoxP3蛋白含量

采用RIPA裂解液提取大鼠心肌組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將20 μg 蛋白樣品加入12% SDSPAGE 凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜完全浸至3% BSA-TBST 中封閉。封閉結(jié)束后根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量裁膜，并先后在稀釋于5%脫脂奶粉-TBST 溶液的一抗（IL-6 1∶1000、STAT3 1∶2000、p-STAT3 1∶1000、RORγt 1∶2000、FoxP3 1∶2000 稀釋）和含HRP 的二抗中孵育。孵育結(jié)束后TBST 洗膜，ECL 暗室顯色。通過(guò)Image J 軟件對(duì)所測(cè)蛋白條帶進(jìn)行分析，用內(nèi)參的灰度值作為比較，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并計(jì)算相對(duì)百分?jǐn)?shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，方差不齊應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 說(shuō)明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變

HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織排列緊密有序，心肌細(xì)胞形S態(tài)完整，未見(jiàn)間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠心肌纖維排列紊亂、斷裂，心肌間隙增大，部分肌纖維斷裂，見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。參芪復(fù)方組大鼠的心肌損傷得到一定改善，心肌纖維排列較為整齊，肌纖維斷裂溶解情況緩解（圖1）。

圖1 心肌HE染色（HE，×200）

2.2 心臟超聲

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVEF、LVFS、SV、CO 均顯著下降，LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV 均明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，參芪復(fù)方組大鼠LVEF、LVFS、SV、CO 均有不同程度提升（P＜0.01 或P＜0.05）；參芪復(fù)方組大鼠LVDs、LVESV 均顯著降低（P＜0.01）（表1-2）。

表1 參芪復(fù)方對(duì)IHF大鼠心功能的影響（）

表1 參芪復(fù)方對(duì)IHF大鼠心功能的影響（）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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表2 參芪復(fù)方對(duì)IHF大鼠心室結(jié)構(gòu)的影響（）

表2 參芪復(fù)方對(duì)IHF大鼠心室結(jié)構(gòu)的影響（）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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綜合心肌組織病理形態(tài)變化、心功能和心室結(jié)構(gòu)指標(biāo)評(píng)價(jià)，參芪復(fù)方高劑量組初步顯示出較好的改善效果，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇參芪復(fù)方高劑量組進(jìn)行其他水平的檢測(cè)。

2.3 參芪復(fù)方對(duì)大鼠脾臟及外周血Th17、Treg細(xì)胞的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脾臟與外周血的Th17 細(xì)胞明顯升高，Treg 細(xì)胞明顯減少，Th17/Treg 細(xì)胞比顯著升高（P＜0.01）；參芪復(fù)方組大鼠脾臟與外周血的Th17 細(xì)胞水平顯著下降，Treg 細(xì)胞升高，同時(shí)伴隨Th17/Treg 細(xì)胞比的顯著下降（P＜0.01 或P＜0.05）（表3-4，圖2-3）。

表3 參芪復(fù)方對(duì)大鼠脾臟Th17、Treg細(xì)胞含量的影響（，n=6）

表3 參芪復(fù)方對(duì)大鼠脾臟Th17、Treg細(xì)胞含量的影響（，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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表4 參芪復(fù)方對(duì)大鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞含量的影響（，n=6）

表4 參芪復(fù)方對(duì)大鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞含量的影響（，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜ 0.01。

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圖2 脾臟流式細(xì)胞檢測(cè)代表圖（左：Th17，右：Treg）

圖3 外周血流式細(xì)胞檢測(cè)代表圖（左：Th17，右：Treg）

2.4 參芪復(fù)方對(duì)大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10水平的影響

與假手術(shù)相比，模型組大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-α 含量顯著上升，IL-10 顯著下降（P＜0.01）；參芪復(fù)方給藥后可顯著降低IL-17A、IL-6、TNF-α 水平（P＜0.01），提高IL-10水平（P＜0.05）（表5）。

表5 參芪復(fù)方對(duì)大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10平的影響（）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.5 免疫組化檢測(cè)大鼠心肌組織IL-6、STAT3、p-STAT3的表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3陽(yáng)性面積增加（P＜0.05）；與模型組相比，參芪復(fù)方組大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3表達(dá)有不同程度下降（P＜0.05）（表6，圖4）。

表6 各組大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果比較（，n=6，%）

表6 各組大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果比較（，n=6，%）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05。

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圖4 心肌組織IL-6、STAT3、p-STAT3免疫組化（×200倍）

2.6 參芪復(fù)方對(duì)大鼠心肌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)相比，模型組大鼠心肌IL-6、STAT3、RORγ 蛋白表達(dá)均升高，F(xiàn)oxp3 表達(dá)下降（P＜0.05）；而復(fù)方參芪可有效降低IL-6、STAT3、RORγ 蛋白表達(dá)，增加Foxp3表達(dá)（P＜0.05）（圖5）。

圖5 各組IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt、FxoP3蛋白表達(dá)比較

3 討論

中醫(yī)藥在治療IHF方面有著獨(dú)特的理論和豐富的經(jīng)驗(yàn)支撐，在改善患者預(yù)后、提高生存質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用[13]。多項(xiàng)研究表明人參、黃芪的有效成分可以通過(guò)抗氧化、改變血管舒縮功能、減少血小板粘附、影響離子通道、改變自主神經(jīng)遞質(zhì)釋放和改善血脂譜等多機(jī)制、多靶點(diǎn)途徑發(fā)揮心臟保護(hù)作用[14-15]。為了觀察參芪復(fù)方對(duì)IHF 的治療效果，本研究采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制備了心力衰竭模型，結(jié)果提示參芪復(fù)方可以減輕大鼠缺血性損傷導(dǎo)致的心肌組織病理?yè)p傷，心肌纖維排列紊亂得到改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。另外通過(guò)心超評(píng)估大鼠心功能和心臟結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)參芪復(fù)方高劑量組大鼠LVEF、LVFS、LVDs、LVESV 均有明顯改善，說(shuō)明參芪復(fù)方在治療IHF方面具有良好的藥效。

心臟由心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等組成[16]。在穩(wěn)態(tài)條件下，非心肌細(xì)胞表現(xiàn)出靜止的表型，當(dāng)發(fā)生缺血性損傷后，非心肌細(xì)胞活化作用于心臟發(fā)揮雙面作用。其中，CD4+T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在HF 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。首先，抗原呈遞細(xì)胞識(shí)別了受損的心肌細(xì)胞釋放出來(lái)的自身抗原蛋白，隨后，幼稚CD4+T淋巴細(xì)胞通過(guò)MHCⅡ類分子產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)，原始抗原的幼稚CD4+T 細(xì)胞被激活，最終分化為具有不同表型的亞群[17]。在MI 早期階段，CD4+T 淋巴細(xì)胞亞群能夠促進(jìn)瘢痕形成，防止心臟破裂；然而，持續(xù)激活的亞群細(xì)胞可能以自身免疫反應(yīng)的方式靶向心臟，促進(jìn)心臟肥大、纖維化、重塑和衰竭[3]。

Th17 與Treg 細(xì)胞作為CD4+T 細(xì)胞的效應(yīng)亞群之一，它們?cè)诓煌募?xì)胞因子和信號(hào)通路刺激下進(jìn)行分化、擴(kuò)增并作用于心臟產(chǎn)生不同效應(yīng)[18-19]。二者可以相互轉(zhuǎn)化、相互制衡，它們之間的平衡對(duì)于控制炎癥和改善心臟免疫微環(huán)境具有重要作用。Th17 細(xì)胞的特征是分泌促炎因子IL-17介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及自身免疫疾病[20-21]；還能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子，而炎癥介導(dǎo)的間質(zhì)纖維化會(huì)增加心肌僵硬度，促進(jìn)IHF的發(fā)生。HF患者中循環(huán)Th17細(xì)胞的升高與左心室功能障礙呈正相關(guān)，且與不良預(yù)后高度相關(guān)[22]。Treg 細(xì)胞主要分泌IL-10 等抗炎因子，高表達(dá)叉頭核蛋白3（Foxp3）轉(zhuǎn)錄因子，是抑制免疫炎癥反應(yīng)和維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要媒介[23]。急性心肌梗死后小鼠心臟和縱隔淋巴結(jié)中的Tregs 增加并能夠促進(jìn)心肌組織修復(fù)；臨床研究也報(bào)告了Tregs的低水平與心血管疾病的高風(fēng)險(xiǎn)之間存在正相關(guān)，可作為心衰惡化患者再住院的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。本研究發(fā)現(xiàn)IHF 大鼠外周血與脾臟中Th17 與Treg 細(xì)胞處于失衡態(tài)勢(shì)，以促炎表現(xiàn)Th17 細(xì)胞為主要表達(dá)，同時(shí)伴隨著炎性因子IL-17A、IL-6、TNF-α 的升高和抑炎因子IL-10 的降低。而參芪復(fù)方可以有效抑制IHF 大鼠炎癥反應(yīng)，促使Th17/Treg 平衡向Treg 偏移，改善這一病理態(tài)勢(shì)。

Th17 細(xì)胞的分化取決于自身的轉(zhuǎn)錄因子類視黃醇孤兒核受體（RORγt），并受IL-6 的調(diào)節(jié)[24-25]。IL-6能夠與可溶性IL-6R 形成復(fù)合物，與細(xì)胞膜上gp130分子結(jié)合，導(dǎo)致STAT3 通路激活[26]，誘導(dǎo)RORγt 的表達(dá)，并誘導(dǎo)Foxp3 過(guò)度表達(dá)減少對(duì)ROR-γt 的抑制，促進(jìn)幼稚CD4+T 細(xì)胞分化為Th17 細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致Th17和Treg 細(xì)胞之間的免疫功能失調(diào)。因此，靶向IL-6/STAT3 信號(hào)通路，激活Tregs 和抑制Th17 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)療法可能是防治IHF 的一種有效策略。人參、黃芪及其有效成分在不同疾病中能夠發(fā)揮不同的功效，有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK 能夠通過(guò)抑制STAT3 的磷酸化調(diào)控人肝癌細(xì)胞凋亡[27]；人參皂苷Rb1 可以激活STAT3 通路抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減輕川崎病小鼠的心肌損傷[28]；黃芪甲苷可以通過(guò)抑制IL-6/STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)反復(fù)呼吸道感染大鼠的Th17/Treg 細(xì)胞平衡[29]。而國(guó)內(nèi)外關(guān)于中藥參芪復(fù)方通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6/STAT3 通路對(duì)IHF 心肌損傷發(fā)揮免疫保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道。所以本研究初次驗(yàn)證了參芪復(fù)方可以通過(guò)抑制IL-6/STAT3通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用，免疫組化和Western Blot 結(jié)果分別顯示參芪復(fù)方可以抑制IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt 的蛋白表達(dá)，增加Foxp3的蛋白表達(dá)。

綜上述，參芪復(fù)方可抑制IL-6/STAT3 表達(dá)，抑制Th17 細(xì)胞過(guò)度分化，促使Th17/Treg 平衡向Treg 修復(fù)表型偏移、減輕炎癥反應(yīng)、緩解心肌損傷、改善心臟功能，下調(diào)IL-6/STAT3信號(hào)通路表達(dá)可能是其起效的分子機(jī)制之一，更確切的詳盡作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究與論證。