葛根素抑制自噬改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷作用研究＊

趙裕沛，朱益敏，徐小勇，賀彬嬋，閔海燕，王 嫘

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 南京 210017；2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)藥研究院 南京 210028）

肝臟是感染早期損傷靶標(biāo)之一，其功能障礙是多器官功能障礙的關(guān)鍵標(biāo)志之一，也是重癥監(jiān)護(hù)病房患者常見(jiàn)死因[1]。肝損傷不僅會(huì)導(dǎo)致肝功能衰竭，造成急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF），還會(huì)加重整體病情，影響預(yù)后，甚至導(dǎo)致死亡。ALF 病程迅速，病死率高，目前臨床缺乏有效干預(yù)手段。針對(duì)早期肝損害的預(yù)防或治療可有效改善預(yù)后[1-3]。

葛根始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“葛根，消渴，身大熱，嘔吐，諸痹，起陰氣，解諸毒”，是豆科植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的干燥根，味甘辛性涼，歸肺胃經(jīng)，常用于外感熱病、麻疹、脾胃系統(tǒng)疾病等，并可用于解酒。葛根素（Puerarin，PUE）是一種來(lái)源于中藥葛根的異黃酮類(lèi)單體化合物，因具有多種生物活性，如抑制氧化應(yīng)激、改善胰島素水平、減輕炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡等，常用于多種疾病的治療，包括糖尿病腎病、心腦血管疾病、骨骼生成異常、老年癡呆及腫瘤[4-5]。葛根素對(duì)慢性代謝性疾病的肝臟損傷表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用[6-7]。在急性肝損傷研究中，LPS 可引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[4-5]。LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是目前常用的肝臟損傷機(jī)制研究模型[4-5,8]。葛根素可通過(guò)降低細(xì)胞死亡率，改善肝損表型，但具體分子機(jī)制仍未完全闡明[9]。

本研究利用LPS 誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，在刺激30 min 后，采用葛根素干預(yù)治療，評(píng)估葛根素對(duì)模型小鼠肝臟病理表型的改善作用，并進(jìn)一步探討相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組

SPF 雄性C57BL/6J 小鼠（6 周齡，20-25 g）18 只，購(gòu)于江蘇省集萃藥康生物科技股份有限公司。所有購(gòu)買(mǎi)小鼠在SPF 條件下，維持飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（Normal contrast，NC），肝損模型組（LPS）和葛根素干預(yù)組（LPS+PUE），每組6只。

本研究所涉相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照動(dòng)物福利進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循科技部的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南》，并嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（南京大學(xué)，倫理批準(zhǔn)文號(hào)：IACUC-2003071）進(jìn)行。小鼠處理參考文獻(xiàn)方法[8,10]，具體如下：肝損模型組小鼠（腹腔注射10 mg·kg-1LPS），葛根素干預(yù)組（腹腔注射10 mg·kg-1LPS，30 min 后，腹腔注射100 mg·kg-1葛根素），正常組（腹腔注射，等體積PBS溶液）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

人肝細(xì)胞系LO2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)條件為：添加10%（v/v）胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基，維持37℃，5% CO2的培養(yǎng)條件，每2 天更換1 次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%-70%密度時(shí)，將LO2 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6 孔板，進(jìn)行以下處理：LPS（100 ng·mL-1）處理30 min 后，加入濃度葛根素溶液（20 μmol·L-1），處理24 h 后，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，進(jìn)行特定蛋白質(zhì)表達(dá)水平測(cè)定。

1.3 主要試劑

脂多糖（美國(guó)Sigma 公司）；葛根素注射液（廣州白云山天心制藥股份有限公司）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）ELISA 劑盒（上海麥約爾生物技術(shù)有限公司）；二辛酸（Bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；ECL Plus 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑、P53抗體、Elite ABC 試劑盒、3,3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物、蛋白酶及磷酸酶抑制劑、RIPA 裂解液（美國(guó)Millipore 公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清，青霉素鏈霉素（美國(guó)Gibco 公司）；TLR4 抑制劑TAK-242（美國(guó)Sigma公司）；Cleaved Caspase3、Beclin1、p62、LC3、磷酸甘 油 醛 脫 氫 酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、肌纖蛋白（Actin）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；TRIzol 試劑，iScript cDNA合成試劑盒（中國(guó)Vazyme公司）。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定肝酶活性

小鼠處理24 h 后，異氟烷麻醉，眼球取血后，2000 r·min-1離心10 min，取上層血清，根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作說(shuō)明，檢測(cè)小鼠血清ALT 和AST活性。

1.5 HE染色、免疫組化、免疫熒光分析

小鼠經(jīng)斷頸處死后，取肝臟左葉約2 cm3組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，剩余肝組織放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。固定的肝組織經(jīng)石蠟包埋后切片，經(jīng)蘇木精和伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行肝組織形態(tài)學(xué)觀察。

選擇P53 免疫組化抗體孵育，4℃過(guò)夜，Elite ABC試劑盒和DAB 底物進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察P53的表達(dá)水平。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TRIzol 試劑從組織樣品分離提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（iScript cDNA 合成試劑盒），使用SYBR green PCR Master Mix 定量檢測(cè)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平，所用儀器為viia 7 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems）。應(yīng)用ΔΔct 法計(jì)算對(duì)應(yīng)比值并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣品進(jìn)行3 次重復(fù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次。表1為所用引物的序列信息。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.7 蛋白質(zhì)Western blot檢測(cè)

取20 mg凍存組織，研磨后，加入200 μL含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解15 min。4℃離心機(jī)13 300 r·min-1離心20 min，取蛋白上清后，根據(jù)BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒的操作說(shuō)明，檢測(cè)提取的蛋白濃度，加SDS 蛋白變性緩沖液，100℃，5 min。取50 μg 變性蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE 垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，與目的蛋白的一抗孵育（4℃過(guò)夜）后，洗脫，與相應(yīng)二抗孵育（室溫1 h），ECL 發(fā)光顯影并定量分析。使用Image J 軟件（NIH，Bethesda，MD，USA）通過(guò)光密度測(cè)定法定量條帶的強(qiáng)度（相對(duì)蛋白水平）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示，各組間比較采用完全隨機(jī)方法分析（One-way ANOVA），P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素顯著改善LPS誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷

HE 檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，LPS（20 mg·kg-1）腹腔注射小鼠24 h 后，小鼠肝臟組織表現(xiàn)出嚴(yán)重的病理異常（圖1A），有肝臟組織結(jié)構(gòu)破壞、肝組織充血、水腫、炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)。檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，LPS模型組小鼠血清中ALT 和AST 的水平顯著高于對(duì)照組，提示模型組織肝臟受損嚴(yán)重（圖1B）。在給予葛根素處理后，上述肝組織病理特征和血清肝損指標(biāo)，均得到顯著改善，提示葛根素顯著改善了LPS 誘導(dǎo)的肝臟組織損傷（圖1）。

圖1 葛根素改善LPS誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷

2.2 葛根素有效抑制LPS 誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織炎癥水平

隨后，檢測(cè)了小鼠肝臟組織中炎癥相關(guān)指標(biāo)的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照小鼠相比，LPS誘導(dǎo)的肝損模型小鼠的肝臟組織中，促炎因子IL-6、TNF-α、IFNγ 的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，而抗炎因子IL-10 則顯著降低，在葛根素干預(yù)后，上述炎癥因子水平均得到逆轉(zhuǎn)，提示葛根素能有效地抑制炎癥因子的產(chǎn)生（圖2）。

圖2 葛根素改善小鼠肝臟炎癥狀態(tài)

2.3 葛根素抑制小鼠肝臟組織中LPS 刺激引起的細(xì)胞凋亡

為了探索葛根素改善肝臟損傷的機(jī)制，首先對(duì)不同處理組小鼠肝臟組織進(jìn)行細(xì)胞死亡相關(guān)分子的表達(dá)水平檢測(cè)。比較發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，LPS模型小鼠的肝組織內(nèi)，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子P53 表達(dá)顯著增強(qiáng)（圖3A），且凋亡指示蛋白cleaved-caspase3（cl.Cas3）蛋白表達(dá)水平也顯著增加，提示LPS刺激肝臟細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生。而葛根素干預(yù)后，模型小鼠肝臟中的P53 和cl.Cas3 的水平顯著降低，提示葛根素抑制了LPS 刺激的肝臟凋亡（圖3B）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LPS 誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞的過(guò)度凋亡參與肝損發(fā)生發(fā)展，葛根素干預(yù)處理可通過(guò)顯著降低凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，抑制肝臟的細(xì)胞凋亡。這提示葛根素具有良好的護(hù)肝作用。

圖3 葛根素抑制小鼠肝臟組織中LPS刺激引起的細(xì)胞死亡

2.4 葛根素抑制LPS 誘導(dǎo)的肝臟組織中自噬過(guò)度激活

有研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，減少肝細(xì)胞死亡來(lái)治療小鼠的急性肝衰竭[11]，也有研究發(fā)現(xiàn)自噬可通過(guò)調(diào)控炎癥相關(guān)因子在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型發(fā)揮作用[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，本課題組檢測(cè)了小鼠肝臟組織中自噬相關(guān)因子p62，Beclin1 和LC3B 的mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示在LPS處理組中，LC3 和Beclin1 表達(dá)顯著增加，而自噬抑制指標(biāo)p62 則明顯降低，提示LPS 處理后的24 h 內(nèi)，肝臟組織自噬水平顯著增強(qiáng)，可能是造成肝臟細(xì)胞死亡的原因之一。在此基礎(chǔ)上，給予葛根素處理，可明顯抑制肝組織中Beclin1 和LC3 的表達(dá)，增加p62 的表達(dá)（圖4A）。與mRNA 一致，蛋白質(zhì)水平檢測(cè)顯示（圖4B），LPS 處理24 h 后，模型組小鼠肝臟自噬水平增加，表現(xiàn)為Beclin1和LC3蛋白水平顯著增高，而p62蛋白表達(dá)則明顯降低。這表明葛根素可有效地抑制LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞自噬。

圖4 葛根素抑制LPS誘導(dǎo)的肝臟組織中自噬蛋白過(guò)度激活

2.5 葛根素可能通過(guò)下調(diào)TLR4抑制肝臟過(guò)度自噬

最后，利用體外培養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞系LO2 細(xì)胞驗(yàn)證體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本課題組發(fā)現(xiàn)，體外LPS（100 ng·mL-14 h 后，肝細(xì)胞中TLR4 的表達(dá)水平顯著增加，提示炎癥激活，同時(shí)觀察到自噬降解相關(guān)p62的蛋白表達(dá)水平急劇下降，LC3B 的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，提示LPS 刺激24 h 后自噬水平顯著增加。葛根素（20 μmol·L-1）處理后，自噬相關(guān)蛋白LC3B 的表達(dá)顯著降低，而自噬降解蛋白p62的水平顯著增加，這與已知TLR4 抑制劑TAK-242 處理后的效果一致，提示葛根素的作用效果和TLR4抑制劑類(lèi)似，可以抑制LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞自噬（圖5）。

圖5 葛根素抑制LPS刺激后自噬可能通過(guò)下調(diào)TLR4

3 討論與結(jié)論

3.1 早期使用葛根素可治療LPS誘導(dǎo)的肝臟損傷

自噬在肝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬在LPS 誘導(dǎo)的肝損傷中被過(guò)度激活[13]。最近的報(bào)道表明，自噬可以在肝臟損傷中充當(dāng)保護(hù)者或殺手，這取決于疾病所處的階段。在起始階段，自噬可能對(duì)肝損傷有益，有研究已經(jīng)確定了這種觀點(diǎn)[14]，即細(xì)胞自噬在膿毒癥肝損傷過(guò)程中起著重要的保護(hù)作用，可通過(guò)改善微循環(huán)障礙、清除受損線粒體以及炎癥因子來(lái)降低肝損程度。然而，隨著疾病進(jìn)展，當(dāng)肝臟損傷惡化時(shí)，自噬過(guò)多可能反而加重肝壞死[15]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，LPS（20 mg·kg-1）刺激24 h 后，小鼠肝臟表現(xiàn)出嚴(yán)重的組織受損，肝組織細(xì)胞凋亡增加，伴隨自噬相關(guān)蛋白被激活，在LPS 處理30 min 后，進(jìn)行葛根素干預(yù)，可通過(guò)抑制肝細(xì)胞的過(guò)度自噬，從而有效抑制細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療的效果。本課題組發(fā)現(xiàn)，體外LPS 刺激后肝細(xì)胞中TLR4 的表達(dá)水平顯著增加，提示炎癥激活，同時(shí)觀察到自噬相關(guān)LC3B 的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。葛根素處理后有效逆轉(zhuǎn)，這與已知TLR4抑制劑TAK-242處理后的效果一致，提示葛根素的作用效果和TLR4 抑制劑類(lèi)似，可能是通過(guò)抑制TLR4，從而抑制下游炎癥通路和LPS 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞過(guò)度自噬。

3.2 葛根素的給藥劑量及藥代動(dòng)力學(xué)研究

葛根素的使用劑量和給藥方式也在本團(tuán)隊(duì)的前期研究中證實(shí)[5,16]。葛根素劑量是根據(jù)藥物說(shuō)明，按照動(dòng)物體重計(jì)算得出。在之前發(fā)表的研究中[5,7,16]，葛根素100-160 mg·kg-1的劑量可以有效改善2型糖尿病和急性炎癥模型膿毒癥，均在造模期間或者模型后給藥一次，提示葛根素有效的治療效果。因此，本實(shí)驗(yàn)采取了100 mg·kg-1的給藥劑量。在藥代動(dòng)力學(xué)方面，在我們發(fā)表的研究中，LPS 誘導(dǎo)動(dòng)物急性炎癥模型膿毒癥的血清細(xì)胞因子顯示，葛根素用后炎癥因子水平變化隨時(shí)間波動(dòng)，且變化并非一致[16]。

3.3 葛根素作用機(jī)制的多樣性

盡管已知葛根素對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用，但大多數(shù)研究歸因于其強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激能力[17]，如急性酒精性肝損傷Wistar 大鼠模型的血漿和肝臟中，存在高水平的丙二醛（Malondialdehyde，MDA），用葛根素治療5 天，可以降低相應(yīng)MDA 水平[18]。利用乙醇和氯仿誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠，用葛根素治療4周，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，活化的肝星狀細(xì)胞凋亡和Bcl-2 mRNA 的表達(dá)降低[19-20]。上述結(jié)果均提示葛根素具有顯著的抗氧化應(yīng)激能力，在使用一定周期后，具有明顯治療作用。

除了氧化應(yīng)激，炎癥也是肝臟損傷過(guò)程中的重要因素[21]。葛根素也被證實(shí)具有抗炎作用。據(jù)報(bào)道，葛根素可以減弱LPS 刺激的心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡[22]。LPS 刺激下的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，p65 磷酸化增加，NF-κB核轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)，葛根素可通過(guò)抑制p65磷酸化，減少NF-κB 核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制iNOS，COX-2 和C反應(yīng)蛋白的表達(dá)[4,23]。在本研究中，葛根素可通過(guò)調(diào)控自噬過(guò)程，顯著減少肝臟損傷模型小鼠中的促炎細(xì)胞因子表達(dá)，并增加抗炎細(xì)胞因子的水平。

3.4 局限性

本研究明確了中藥葛根中單體提取物葛根素對(duì)LPS 導(dǎo)致肝損傷中的治療作用。但在中醫(yī)醫(yī)療活動(dòng)中，遵循君臣佐使的組方原則，更多采用復(fù)方藥物治療疾病。葛根多作為其中的一種中藥與其他中藥共同發(fā)揮治療作用；這種作用是多種中藥在制劑過(guò)程中的綜合化學(xué)反應(yīng)，而并非某一單體提取物的作用。因此在含有葛根的復(fù)方藥物中，葛根素發(fā)揮的治療作用是怎樣的，以及葛根素與其他組分之間的作用是怎樣的，仍需我們?nèi)ミM(jìn)一步探索。

綜上，本研究表明葛根素可以改善LPS 刺激后造成的肝損傷，可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，調(diào)控炎癥相關(guān)因子表達(dá)，從而減少肝臟組織的細(xì)胞凋亡。除此之外，還需要研究葛根素與復(fù)方藥物中其他組分之間的關(guān)系，以及如何共同發(fā)揮治療作用。