溫陽(yáng)化濁退黃方治療慢加急性肝衰竭的作用機(jī)制：基于UHPLC-QTOF-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法＊

王秀峰，張榮臻，陳月橋，王明剛，呂 超

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南寧 530023）

慢加急性肝衰竭（Acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指慢性肝病患者受到多種急性損傷因素的影響，導(dǎo)致慢性肝病迅速惡化而產(chǎn)生的肝衰竭綜合征[1-2]。ACLF 具有發(fā)病急和死亡率高等的特點(diǎn)，主要病因?yàn)橐倚透窝撞《靖腥荆R床表現(xiàn)為極度乏力、凝血功能障礙、消化道癥狀等[3-5]。目前，臨床治療ACLF的方法主要有內(nèi)科綜合治療、人工肝、肝移植、保肝和營(yíng)養(yǎng)支持等，其中肝移植是目前唯一有效的方法，但其價(jià)格昂貴、肝資源稀缺，所以發(fā)展受限[6-8]。

諸多研究表明中醫(yī)藥在治療ACLF 上具有顯著的療效[9-10]。溫陽(yáng)化濁退黃方是在解毒化瘀顆粒的基礎(chǔ)上變裁而來(lái)的有效復(fù)方，該方由白附片、干姜、白術(shù)、茵陳、生大黃、赤芍、虎杖、人參、甘草組成，長(zhǎng)期臨床實(shí)踐表明該方對(duì)促進(jìn)黃疸消退和降低肝衰竭病死率等方面具有良好的臨床療效。本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)溫陽(yáng)化濁退黃湯能夠改善患者的肝功能，對(duì)治療ACLF 具有較好的治療效果。此外在常規(guī)西醫(yī)治療基礎(chǔ)上使用溫陽(yáng)化濁退黃湯能夠改善ACLF 患者的炎癥反應(yīng)和凝血功能[11-12]，但關(guān)于溫陽(yáng)化濁退黃方治療ACLF 的作用機(jī)制還不明確。因此，本研究利用UHPLC-QTOF-MS 方法對(duì)溫陽(yáng)化濁退黃方的成分進(jìn)行分析，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證明確溫陽(yáng)化濁退黃方治療ACLF 的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探索ACLF的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的SPF 級(jí)Wistar 雄性大鼠90 只，體質(zhì)量250±30 g，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2018-0104，動(dòng)物合格證號(hào)：110324210100359872，倫理審批批準(zhǔn)號(hào)：HLK-20191106-001。

1.2 主要試劑與儀器

溫陽(yáng)化濁退黃[白附片（先煎）30 g、干姜15 g、茵陳30 g、生大黃6 g、赤芍30 g、虎杖15 g、人參15 g、白術(shù)15 g、甘草10 g，使用中藥飲片，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室中心煎制，含生藥量為4.34 g·mL-1]，甲醇（CNW Technologies，LC-MS 級(jí)，67-56-1），甲酸（CNW Technologies，LC-MS 級(jí)，64-18-6），乙腈（CNW Technologies，LC-MS 級(jí)，75-05-8），L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司，≥98%，103616-89-3），二甲苯、無(wú)水乙醇、30% H2O（2均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)分別為：10023418、10009218、10011218），DAB 濃縮型試劑盒、中性樹脂、封閉山羊血清、伊紅（均來(lái)自中國(guó)Solarbio 公司，貨號(hào)分別為DA1010-2*3 mL、G8590、SL038-10 mL、E8090），蘇木素、20×Tris-EDTA 修復(fù)液pH=9.0（均來(lái)自中國(guó)Servicebio公司，貨號(hào)分別為G1004、G1203）。

超高效液相（日本島津公司，型號(hào)：Nexera UHPLC LC-30A）；高分辨質(zhì)譜（美國(guó)AB Sciex 公司，型號(hào)：Triple TOF 5600）；色譜柱（美國(guó)Waters 公司，型號(hào)：ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 2.1×100 mm）；正置顯微鏡、石蠟切片機(jī)（均來(lái)自德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，型號(hào)分別為DM1000、RM2235）；生物組織包埋機(jī)、生物組織包埋機(jī)-冷凍機(jī)（均來(lái)自湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司，型號(hào)分別為TB-718D、TB-718L）。

1.3 UHPLC-QTOF-MS檢測(cè)溫陽(yáng)化濁退黃方活性成分

1.3.1 代謝物提取

取300 μL 藥方樣本，加入甲醇和水的體積比為4∶1、IS=1000∶10 的提取液1000 μL，渦旋30 s，冰水浴超聲處理5 min；-20℃條件下靜置1 h；4℃，12000 rpm離心15 min；取出上清過(guò)0.22 μm 微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中。

1.3.2 UHPLC-QTOF-MS條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A），乙腈（B），梯度洗脫：0-3.5 min，95%-85% A；3.5-6 min，85%-70% A；6-6.5 min，70% A；6.5-12 min，70%-30% A；12-12.5 min，30% A；12.5-18 min，30%-0%A；18-25 min，0% A；25-26 min，0%-95% A；26-30 min，95% A；流速：400 μL·min-1；進(jìn)樣體積：5 μL。

AB 5600 Triple TOF 質(zhì)譜儀能夠在控制軟件（Analyst TF 1.7, AB Sciex）控制下進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。篩選出每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100 eV 的離子，并采集對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：40 eV，碰撞能差：20V，15 張二級(jí)譜圖每50 ms。ESI 離子源參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓（GS1）：55 psi，輔助氣壓：55 psi，氣簾氣壓：35 psi，溫度：550℃，噴霧電壓：5500 V（正離子模式）或-4000V（負(fù)離子模式）。

1.3.3 溫陽(yáng)化濁退黃方成分鑒定

將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI 軟件，進(jìn)行如下工作：保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等，創(chuàng)建復(fù)方中相應(yīng)中藥代謝庫(kù)，利用自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法對(duì)含有MS/MS 數(shù)據(jù)的峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.4.1 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選溫陽(yáng)化濁退黃方活性成分靶點(diǎn)

利用TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，將人體口服生物利用度（OB）≥30%且藥物相似性（DL）≥0.18設(shè)置為TCMSP中藥有效成分的篩選參數(shù)，篩選活性成分；在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org）將靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為基因簡(jiǎn)稱；PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索復(fù)方活性成分的分子化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，通過(guò)Swiss target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行化合物靶點(diǎn)篩選。取TCMSP 和Swiss target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選靶點(diǎn)交集，記為溫陽(yáng)化濁退黃方活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.4.2 溫陽(yáng)化濁退黃方靶蛋白PPI分析

使用STRING 網(wǎng)站（https://cn.string-db.org/）分析靶點(diǎn)之間蛋白互作關(guān)系，獲得溫陽(yáng)化濁退黃方的核心靶點(diǎn)。

1.4.3 慢加急性肝衰竭靶基因篩選

在OMIM（http://www.omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）和GeneCard（https://www.genecards.org/）3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“acute-on-chronic liver failure”選取相關(guān)性≥60%作為慢加急性肝衰竭相關(guān)靶點(diǎn)，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)靶點(diǎn)取并集作為ACLF預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.4.4 溫陽(yáng)化濁退黃方與慢加急性肝衰竭共有靶點(diǎn)分析

溫陽(yáng)化濁退黃方活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與慢加急性肝衰竭預(yù)測(cè)靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖。采用DAVID 分析工具對(duì)獲得的靶蛋白進(jìn)行基因本體（GO）分析，GO數(shù)據(jù)包括生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞定位（CC）和分子功能（BP）三大類；然后進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集通路分析，物種設(shè)置為人（Homo sapiens），以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)確定功能及重要通路，并對(duì)通路進(jìn)行注釋和分析。

1.4.5 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析

基于共有靶點(diǎn)-通路關(guān)系，將得到的前10 條KEGG 富集通路與相關(guān)靶點(diǎn)利用Cytoscape 構(gòu)建藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 建立大鼠慢加急性肝衰竭實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

大鼠尾靜脈注射20%的人血清白蛋白15 mg·kg-1，每周2次，6周后成模。在肝硬化基礎(chǔ)上采用腹腔注射脂多糖（100 μg·kg-1）和D-氨基半乳糖胺（400 mg·kg-1）構(gòu)建ACLF大鼠模型[13]。

1.5.2 模型鑒定

HE 染色鑒定ACLF 模型構(gòu)建是否成功。藥物干預(yù)完成后，處死大鼠，取肝組織用4%多聚甲醛固定24 h 以上，分別用70%、80%、90%、95%無(wú)水乙醇梯度洗脫30 min，無(wú)水乙醇脫水2 次，二甲苯透明，石蠟包埋，切成厚度為5 μm的組織切片。染色后觀察肝組織病理改變，特別是肝細(xì)胞損傷，并在光鏡下拍照，鑒定ACLF模型構(gòu)建是否成功。

設(shè)計(jì)意圖：以問(wèn)題為載體，引導(dǎo)學(xué)生思考，幫助學(xué)生理清思路，學(xué)會(huì)科學(xué)探究。同時(shí)生活化的問(wèn)題可以使學(xué)生認(rèn)識(shí)到學(xué)習(xí)化學(xué)可以服務(wù)于生活，與生活的聯(lián)系之緊密，學(xué)以致用，提升學(xué)生學(xué)習(xí)化學(xué)的熱情，讓學(xué)生充分體驗(yàn)思考的快樂。

1.5.3 分組及處理

運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將90 只大鼠分為6 組，每組15 只，分別為空白組、模型對(duì)照組，胸腺五肽組（0.11 mg·kg-1）、溫陽(yáng)化濁退黃方低劑量組（0.23 g·kg-1）、溫陽(yáng)化濁退黃方中劑量組（0.46 g·kg-1）、溫陽(yáng)化濁退黃高劑量組（0.92 g·kg-1）。由于動(dòng)物模型存在時(shí)效性，中藥組及胸腺五肽組于造模前5天開始灌胃給藥，根據(jù)人用劑量換算大鼠灌胃液體量為每天2 mL·100 g-1體質(zhì)量，正常組與模型對(duì)照組給予等量蒸餾水，一直持續(xù)至成模后48 h，每天2次，間隔12 h。結(jié)束后戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉小鼠致死，取肝臟組織并用多聚甲醛進(jìn)行固定。

1.5.4 HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)損傷

按照1.5.2 中的方法觀察各組大鼠肝臟組織的損傷情況，并拍照。根據(jù)文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行病理評(píng)分：從胞體固縮、胞質(zhì)染色消失、空泡變性、胞核消失、紅細(xì)胞淤積、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)6個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，視野內(nèi)未見病變記0 分，病變占視野＜10%記1 分、10%-50%記2 分、50%-100%記3分，6個(gè)方面評(píng)分總和即為病理評(píng)分[14]。

1.5.5 免疫組織化學(xué)染色分析肝臟組織中AKT1、MTOR和RAF1的表達(dá)

每組選擇3個(gè)樣本檢測(cè)。將固定好的大鼠肝臟組織脫水浸蠟包埋，制作切片（厚度約為3 μm），烤片脫蠟水化，采用1 mmol·L-1Tris-EDTA 緩沖溶液中高壓（125℃·103 KPa）修復(fù)18 min，自然冷卻后，PBS 溶液洗3 min×3次，3% H2O2孵育10 min，PBS沖洗3次；10%山羊血清孵育30 min，PBS 沖洗3 次。加入一抗稀釋液（AKT1 為1∶100，MTOR 為1∶150，RAF1 為1∶100），4°C 孵育過(guò)夜，PBS 沖洗3次；加入二抗稀釋液，室溫孵育30 min，PBS 沖洗3 次；DAB 染色，有顏色變化時(shí)洗去染色液。蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗后乙醇脫水，二甲苯透明2 次，中性樹脂封片，顯微鏡下選取5 個(gè)視野，拍照。利用Image Pro Plus 軟件進(jìn)行半定量分析，測(cè)量面積（Area）和累計(jì)光密度（IOD），計(jì)算平均光密度（MOD）MOD=IOD/Area。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Priam 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作統(tǒng)計(jì)圖，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溫陽(yáng)化濁退黃方活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

表2 根據(jù)ADME篩選的活性成分

2.2 溫陽(yáng)化濁退黃方靶蛋白PPI分析

圖1為溫陽(yáng)化濁退黃方活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，包含181 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1618 條邊，節(jié)點(diǎn)大小表示Degree 值的大小。其中綜合數(shù)值評(píng)分為0.999的相互蛋白為AKT1-NOS3、AKT1-GSK3B、AKT1-MTOR、AR-NCOA2、AURKA-CDK1、CCNA2-CDK2、CCNA2-CDK1、FLT1-VEGFA、FNTA-FNTB、IGF1RPTPN1，這些蛋白間的相互作用具有重要地位。Degree 值排名前5 的分別為AKT1、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR，Degree值分別為85、75、74、70、67。

圖1 溫陽(yáng)化濁退黃方活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)PPI蛋白互作圖

2.3 溫陽(yáng)化濁退黃方與慢加急性肝衰竭共有靶點(diǎn)篩選

在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找疾病相關(guān)靶點(diǎn)，取并集，得到慢加急性肝衰竭靶點(diǎn)2019個(gè)（圖2A）。將2019個(gè)慢加急性肝衰預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與181個(gè)溫陽(yáng)化濁退黃方活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得到慢加急性肝衰和溫陽(yáng)化濁退黃方共有靶點(diǎn)99個(gè)（圖2B）。

圖2 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)維恩圖

2.4 溫陽(yáng)化濁退黃方與慢加急性肝衰竭共有靶點(diǎn)的GO和KEGG通路富集分析

在BP 中靶點(diǎn)共涉及1722 個(gè)生物過(guò)程，主要為細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)，外部凋亡信號(hào)通路等（圖3A）；在CC中靶點(diǎn)共涉及61 個(gè)細(xì)胞定位，主要為膜筏、膜微域、囊腔、胞質(zhì)囊腔和細(xì)胞的頂端部分等（圖3B）；在MF中靶點(diǎn)共涉及139 個(gè)分子功能，主要為蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合和四吡咯綁定等（圖3C）。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，共富集到147條信號(hào)通路，溫陽(yáng)化濁退黃方治療慢加急性肝衰竭主要涉及PI3K/Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、乙型肝炎、凋亡通路、MAPK 信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等（圖3D）。

2.5 活性成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)分析

構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。Degree排名前4 的靶點(diǎn)AKT1、PI3KR1、RAF1、TNF 作為溫陽(yáng)化濁退黃方治療ACLF 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)圖直觀的體現(xiàn)溫陽(yáng)化濁退黃方通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)和多通路治療慢加急性肝衰竭的作用機(jī)制。

圖4 溫陽(yáng)化濁退黃方與慢加急性肝衰竭活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 模型鑒定

與空白組比較，模型組肝細(xì)胞膨大，出現(xiàn)空泡化，肝竇擴(kuò)張，小面積充血，血管、膽管外有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明ACLF模型構(gòu)建成功（圖5）。

2.7 各組大鼠肝組織病理變化結(jié)果

與空白組相比，模型對(duì)照組肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，肝竇擴(kuò)張充血，血管和膽管外有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；胸腺五肽和不同劑量的溫陽(yáng)化濁退黃方干預(yù)后充血程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較模型對(duì)照組均明顯降低。病理評(píng)分結(jié)果顯示，與空白組相比，模型對(duì)照組病理評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，胸腺五肽組和溫陽(yáng)化濁退黃方中、高劑量組病理評(píng)分顯著降低（P＜0.01）（圖6）。

圖6 各組大鼠肝組織病理形態(tài)改變（HE, ×200）

2.8 各組大鼠肝臟組織AKT1、MTOR 和RAF1 蛋白的表達(dá)

與空白組相比，模型對(duì)照組大鼠肝臟組織中AKT1、MTOR 和RAF1 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)顯著增多（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，胸腺五肽組和溫陽(yáng)化濁退黃方低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中AKT1、MTOR和RAF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)顯著減少（P＜0.01）（圖7）。

圖7 各組大鼠肝臟組織中AKT1、MTOR和RAF1表達(dá)情況（n=3）

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，通過(guò)闡述“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進(jìn)行藥物作用研究，闡明藥物與機(jī)體的功能關(guān)系。這與中醫(yī)整體觀、辨證論治等的原則和中藥及其方劑多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理相一致。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié)，具有可靠性和真實(shí)性等優(yōu)點(diǎn)，在中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究中得到廣泛應(yīng)用[15-17]。中醫(yī)認(rèn)為“正虛邪實(shí)”是ACLF 發(fā)生和發(fā)展的主要病機(jī)，ACLF 患者多表現(xiàn)為黃疸、惡心、嘔吐、高熱和神昏嗜睡等。溫陽(yáng)化濁退黃方具有溫陽(yáng)化瘀、解毒退黃的功效，在臨床治療ACLF 中取得了較好的療效，但其機(jī)制仍不明確。

本研究采用UHPLC-QTOF-MS 技術(shù)從溫陽(yáng)化濁退黃方中鑒定了123 個(gè)化學(xué)成分，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出12 個(gè)活性成分，包括黃酮類、異黃酮類、單萜類、醌類和咖啡?？鼘幩犷惖?，其中黃酮類成分居多。研究表明，黃酮類化合物在治療ACLF 中具有顯著作用。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選化合物靶點(diǎn)，得到181個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，其中關(guān)鍵核心靶點(diǎn)為AKT1、CASP3 和EGFR 等。AKT1參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括生長(zhǎng)、增殖、存活和凋亡等，AKT 的激活依賴PI3K 途徑，Jin 等[18]對(duì)ACLF 進(jìn)行功能分析，結(jié)果同樣顯示AKT1 為有差異的修飾基因。CASP3 在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用，能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡，毛德文等[19]發(fā)現(xiàn)CASP3參與急性肝衰竭疾病的發(fā)展進(jìn)程，CASP3 表達(dá)下調(diào)能夠抑制肝細(xì)胞凋亡。EGFR 是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員EGFR 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等過(guò)程具有重要的作用，孫鳳丹等[20]發(fā)現(xiàn)EGFR 蛋白的高表達(dá)與乙型肝炎病毒感染有關(guān)，證明EGFR與ACLF密切相關(guān)。綜上，這些靶點(diǎn)是溫陽(yáng)化濁退黃方的核心靶點(diǎn)，均與肝衰竭有著密切的聯(lián)系，表明溫陽(yáng)化濁退黃方是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)來(lái)治療ACLF的。

本研究KEGG 通路分析結(jié)果顯示，溫陽(yáng)化濁退黃方通過(guò)多條信號(hào)通路治療慢加急性肝衰竭，包括PI3K/Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、乙型肝炎、凋亡通路、MAPK 信號(hào)通路等。PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥的過(guò)程中有著關(guān)鍵的作用，該通路中涉及到20 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（JAK2、VEGFA、NOS3、AKT1、FASLG、EGFR、IL2、RAF1、MTOR、IGF1R、BCL2、FLT1、FGF2、PIK3R1、PRKCA、GSK3B、FLT3、PIK3CG、BCL2L1、MCL1），這些靶蛋白主要參與炎癥、凋亡和代謝等。研究顯示PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活可有效減輕肝功能損傷，減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制肝細(xì)胞的凋亡，最終達(dá)到保護(hù)肝臟的目的[21-22]。研究表明多種中藥活性成分能夠通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路緩解ACLF 小鼠的肝功能損傷[23-24]，證實(shí)PI3K/Akt 信號(hào)通路在緩解肝損傷中的重要作用。王圣鑫等[25]發(fā)現(xiàn)本研究篩選出的白附片中的活性成分能夠通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路保護(hù)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，證實(shí)了白附片在復(fù)方中的君藥地位。此外，VEGF 水平被認(rèn)為能夠反映肝功能損傷的程度，而MAPK參與肝臟損傷、應(yīng)激和凋亡的調(diào)節(jié)。綜上，表明溫陽(yáng)化濁退黃方可通過(guò)這些通路靶向調(diào)控ACLF，對(duì)研究其深層機(jī)制具有重要意義。

活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示活性成分與各關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、RAF1、TNF 等均具有關(guān)聯(lián)，而這些關(guān)鍵靶點(diǎn)參與多條溫陽(yáng)化濁退黃方治療ACLF 的信號(hào)通路，表明溫陽(yáng)化濁退黃方是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)治療ACLF 的。最后本研究利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示溫陽(yáng)化濁退黃方能夠有效減輕ACLF 大鼠模型的肝損傷，且本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)溫陽(yáng)化濁退黃方能夠顯著降低ACLF 模型大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和膽堿酯酶的水平[26]，證明了溫陽(yáng)化濁退黃方在治療ACLF 中的作用。最后，本研究選擇了AKT1、MTOR 和RAF1 進(jìn)行驗(yàn)證，這3 個(gè)靶蛋白均參與細(xì)胞凋亡、增殖和炎癥等的調(diào)控，且均參與PI3K/Akt 信號(hào)通路，結(jié)果顯示溫陽(yáng)化濁退黃方能夠顯著降低這些關(guān)鍵蛋白在ACLF 模型大鼠肝組織中的表達(dá)，與預(yù)期結(jié)果相符合，證實(shí)了溫陽(yáng)化濁退黃方是通過(guò)作用于關(guān)鍵通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療ACLF的作用。

綜上所述，本研究采用UHPLC-QTOF-MS 聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法對(duì)溫陽(yáng)化濁退黃方治療ACLF 的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，證實(shí)了溫陽(yáng)化濁退黃方通過(guò)多成分調(diào)控重要靶點(diǎn)和通路發(fā)揮治療慢加急性肝衰竭的作用。