基于IL-6、IL-8、TNF-α和COX-2表達(dá)探討通脈化癥湯抑制AM模型小鼠炎性反應(yīng)的研究＊

張毅然，石雅馨，張科科，寧 婕，李雅琳，姚 巍，師 偉＊＊

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南 250014；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南 250014；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 濟(jì)南 250011）

子宮腺肌?。ˋdenomyosis，AM）是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在子宮肌層內(nèi)出現(xiàn)，引起子宮肌層增生或肥厚，從而形成以痛經(jīng)、月經(jīng)異常為主要癥狀，子宮體積增大，彌漫性或局限性病灶為主要體征的一類疾病[1]。AM 雖不屬于婦科惡性疾病，但其病灶具有增殖、遷移與侵襲等腫瘤細(xì)胞的特性。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制多與子宮內(nèi)膜基底部內(nèi)陷及組織損傷修復(fù)、苗勒管遺跡化生及成體干細(xì)胞分化、炎癥刺激和上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)，但尚無確切發(fā)病機(jī)制[2]。繼發(fā)性痛經(jīng)、月經(jīng)異常、不孕等癥狀嚴(yán)重危害女性的生活和工作[3]。當(dāng)針對AM 的常規(guī)治療手段分為介入治療、西藥治療及手術(shù)治療，但介入治療效果還存在諸多爭議，西藥治療常伴隨明顯副作用，而手術(shù)治療則不能滿足有生育計劃婦女的治療需求[4]。中醫(yī)藥以其治療方法多樣、綜合療效顯著、副作用少等特點，近年來被廣泛應(yīng)用于AM 的治療中，《子宮腺肌病診治中國專家共識》指出中醫(yī)中藥對于緩解AM 所致的痛經(jīng)療效確切[5]。

研究證實，AM 所致的痛經(jīng)、月經(jīng)異常和不孕與多種炎癥因子及炎癥刺激密切相關(guān)[2]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）、環(huán)氧合酶2（COX-2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）等作為主要炎癥因子參與其中[6]。為了探究通脈化癥湯對AM 炎癥刺激的抑制作用，通過建立AM 小鼠模型，采用HE 染色法、蛋白免疫印跡法（Western Blot）、免疫組化法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等方法評價小鼠模型構(gòu)建情況及通脈化癥湯對TNF-α、COX-2、IL-6、IL-8 等炎癥因子的調(diào)控作用，以探求AM 發(fā)病機(jī)制及治療靶點，為臨床針對性地指導(dǎo)AM用藥提供借鑒。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

隨機(jī)選取出生2 日的SPF 級雌性ICR 小鼠70 只，皆由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2016-0006。實驗動物飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院SPF 級動物實驗中心，室內(nèi)溫度控制在（22.6±0.4）℃，相對濕度60%-65%，2-21 天由母鼠喂養(yǎng)，22 日分籠，自由攝食攝水。本研究已獲山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（AWE-2021-83）。

1.2 實驗藥品

藥物組成如下：桂枝15 g、重樓12 g、赤芍15 g、牡丹皮15 g、炒桃仁15 g、天花粉15 g、血竭2 g、醋五靈脂9 g、茯苓15 g、土鱉蟲9 g、牡蠣30 g、醋鱉甲15 g、醋沒藥6 g、皂角刺15 g、黃芪18 g、蜜麻黃3 g、炙甘草6 g，均來自于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

孕三烯酮（每粒2.5 mg），華潤紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號53200201）；枸櫞酸他莫昔芬（每片10 mg），由山東健康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號H37022925）。

1.3 實驗試劑

Mouse Interleukin 6(IL-6) ELISA 試劑盒（基因美，貨號：JYM0012Mo）、Mouse Interleukin 8(IL-8) ELISA試劑盒（基因美，貨號：JYM0457Mo）、COX2 Monoclonal Antibody（Proteintech，貨號：66351-1-Ig）、Rabbit Anti-TNF alpha antibody（博奧森，貨號：bs-0078R）、Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP（思科捷，貨號：EF0002）和Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRP（思科捷，貨號：EF0001）。

1.4 實驗器械及儀器

1.4.1 實驗器械

止血鉗、組織剪、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、無菌棉球、無菌紗布等皆為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.4.2 實驗儀器

BCS-6-SN 電子秤（China，佰倫斯）；ST8 型低速離心機(jī)（USA，Thermo Scientific）；5424R 高速低溫離心機(jī)（Germany，Eppendorf）；Multiskan Go1510 酶標(biāo)儀（USA，Thermo）；ZNCL-BS 磁力攪拌器（China，上海一科），Trans-Blot Turbo 轉(zhuǎn)膜儀（USA，Bio-Rad）；病理組織漂烘儀（常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（徠卡）；免疫組化筆（Vector）；Powerpac 通用電泳儀（USA,Bio-rad），Innotech Fluor Chem Q 成像分析系統(tǒng)（USA，Alpha）等。

2 實驗方法及分析

2.1 建立動物模型

使用枸櫞酸他莫昔芬誘導(dǎo)建立AM 小鼠模型[7]，按照2:1 的比例將雌鼠與雄鼠進(jìn)行原則隨機(jī)交配，在小鼠出生后第2-5天（出生日為第1日），滴喂5 μL·g-1的花生油、卵磷脂和煉乳的混合液（體積比2∶0.2∶3），并按小鼠體質(zhì)量加入2.7 μmol·kg-1的他莫西芬，1-21 日齡均由母鼠哺乳飼養(yǎng)，22日齡起與母鼠分籠。選擇雌性小鼠常規(guī)飼養(yǎng)75 天后，隨機(jī)選取10 只小鼠取子宮組織，見子宮組織明顯扭曲變形增粗，表面可見多個突出結(jié)節(jié)。即用4%甲醛固定，石蠟包埋后選5個以上橫斷面切片，采用HE 染色法染色后置于光鏡下觀察，子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，腺體及間質(zhì)細(xì)胞侵入子宮肌層，證明造模成功。

2.2 分組及給藥

將造模成功的50只小鼠隨機(jī)分為模型組、通脈化癥湯低劑量組（臨床1/2倍等效用量）、通脈化癥湯中劑量組（臨床等效用量）、通脈化癥湯高劑量組（臨床2倍等效用量）、孕三烯酮組；另設(shè)空白組，每組各10只。

按照人和動物間按體表面積折算的等效劑量公式，將通脈化癥湯臨床等效劑量換算成小鼠每日用藥量。將方中所有藥材加入1 L 蒸餾水浸泡0.5 h 后，煎煮1.5 h，過濾后得到濾液，煎煮兩次，合并濾液，濃縮至6.82 g·mL-（1生藥量）。

（1）空白組：10只，予蒸餾水灌胃，0.2 mL·20 g-1體重，每日1次，不予特殊處理。

（2）模型組：10只，予蒸餾水灌胃，0.2 mL·20 g-1體重，每日1次，不予特殊處理。

（3）通脈化癥湯低劑量組：10 只，將藥物濃度用蒸餾水稀釋為1.71 g·mL-1，小鼠給藥量為13.6 g·kg-1，每日予0.2 mL·20 g-1體重中藥灌胃。

（4）通脈化癥湯中劑量組：10 只，將藥物濃度用蒸餾水稀釋為3.41 g·mL-1，小鼠給藥量為27.2 g·kg-1，每日予0.2 mL·20 g-1體重中藥灌胃。

（5）通脈化癥湯高劑量組：10 只，藥物濃度為6.82 g·mL-1，小鼠給藥量為 54.4 g·kg-1，每日予0.2 mL·20 g-1體重中藥灌胃。

（6）孕三烯酮組：10 只，根據(jù)臨床等效劑量，將孕三烯酮膠囊用蒸餾水配置成0.026 mg·mL-1的水溶液，小鼠給藥濃度為0.32 mg·kg-1，每周兩次予0.2 mL·20 g-1體重的藥液灌胃。

2.3 動物組織取材過程

小鼠給藥干預(yù)2個月后，于末次灌胃12 h后禁食，取材前2 h 禁水。消毒麻醉后，逐層打開腹腔，行腹主靜脈穿刺取血后于促凝管中，室溫靜置20 min 后離心取血清，保存于-80℃用于后續(xù)ELISA 檢測；分離雙側(cè)子宮，部分置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，以備后續(xù)HE 染色及免疫組化實驗；另一部分置于-80℃冰箱用于后續(xù)的Western Blot實驗。

2.4 檢測方法

2.4.1 HE染色

4%甲醛固定標(biāo)本48 h→石蠟包埋切片（切片厚度為4 μm）→60℃加熱60 min→二甲苯透明→乙醇脫蠟水化（乙醇濃度逐級降低）→蘇木素染色后→光學(xué)顯微鏡下觀察→伊紅染色→乙醇脫水（乙醇濃度逐漸升高）→二甲苯透明→中性樹膠封片。

2.4.2 免疫組織化學(xué)分析

4%甲醛固定標(biāo)本48 h→石蠟包埋切片（切片厚度為4 μm）→60℃加熱60 min→二甲苯透明→乙醇脫蠟水化（乙醇濃度逐級降低）→檸檬酸鈉抗原修復(fù)（高壓鍋內(nèi)修復(fù)液提前15 min 左右煮沸備用，注意防止組織干片）→內(nèi)源性過氧化物酶去除（覆蓋組織后室溫孵育20 min）→封閉（約45 min）→孵育一抗（4℃過夜）→孵育二抗30 min（孵育二抗前可滴加反應(yīng)增強(qiáng)液）→DAB 顯色液顯色（現(xiàn)用現(xiàn)配，沖洗切片終止顯色）→蘇木素復(fù)染→乙醇脫水（乙醇濃度逐級升高）→二甲苯透明→晾干后中性樹膠封片→用CellSensStandard 進(jìn)行圖像采集。

2.4.3 Western Blot檢測

按比例混合膠水灌膠→預(yù)電泳→上樣→一階電泳→二階電泳→制造低溫環(huán)境→切膠→裁膜→轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗孵育過夜→二抗孵育→顯影。

2.4.4 ELISA檢測

腹主靜脈穿刺取血后置于促凝管內(nèi)室溫靜置20 min后離心取血清，按照ELISA說明書檢測指標(biāo)：包被→加入樣品→加入酶標(biāo)抗體→使用底物液顯色→終止反應(yīng)→結(jié)果判定，于酶標(biāo)儀上在450 nm 條件下檢測OD值。

2.5 評價標(biāo)準(zhǔn)

2.5.1 HE染色

該方法主要檢驗AM 成模與否，若HE染色顯示子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，腺體及間質(zhì)細(xì)胞侵入子宮肌層，則證實造模成功。隨機(jī)選取造模后兩只小鼠的子宮，立即用4%甲醛固定，石蠟包埋后選5 個以上橫斷面切片，采用HE 染色法染色后置于光鏡下觀察。按子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)侵人子宮肌層的程度進(jìn)行分級，即在100 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)細(xì)胞計數(shù)同時測量浸潤深度，并按5 級標(biāo)準(zhǔn)分級量化評分以評估AM 的嚴(yán)重程度，具體分級方法：①正常子宮為0 級，評0 分；②子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞侵入肌肉內(nèi)層為1 級，評1 分；③子宮內(nèi)膜問質(zhì)與腺體侵入肌肉內(nèi)層為2 級，評2 分；④子宮內(nèi)膜間質(zhì)與腺體侵人內(nèi)外肌層結(jié)合帶為3 級，評3 分；⑤子宮內(nèi)膜腺體囊性增生且漿膜層下出現(xiàn)結(jié)節(jié)為4級，評4分（Morit分級法），以此作為AM動物模型成功建立與否的標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.2 免疫組織化學(xué)分析

采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對各組3 個不同區(qū)域的圖片進(jìn)行分析，通過測量被覆上皮面積（Aera）與該面積中陽性表達(dá)的積分光密度（IOD），得到平均積分光密度（平均積分光密度=IOD/Area），平均積分光密度越大，表示陽性表達(dá)程度越高。

2.5.3 ELISA檢測

以酶標(biāo)儀檢測所得OD值為最終記錄標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.4 Western blot檢測

采用Image J 圖像分析軟件對Western blot 的3 次不同結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，以所對應(yīng)的內(nèi)參GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)校準(zhǔn)。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析及作圖，計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）形式表示，符合正態(tài)分布的多組之間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVO），不符合正態(tài)分布的多組之間比較采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

本研究灌胃干預(yù)過程中，因操作不當(dāng)共死亡小鼠11 只，存活49 只，為減少組間樣本數(shù)差異引起的實驗誤差，各組選取5只小鼠進(jìn)行實驗。

3.1 造模情況

實驗開始前隨機(jī)選取空白模型組各1只小鼠檢驗造模結(jié)果，由圖1可見，造模后的小鼠子宮組織明顯扭曲變形，表面可見多個突出結(jié)節(jié)。而造模前的小鼠子宮組織光滑平整流暢，未見變形，表面未見突出結(jié)節(jié)（見圖1）。

圖1 小鼠子宮造模情況

3.2 HE染色結(jié)果

小鼠分組情況對評分醫(yī)師置盲后由2名病理科醫(yī)師獨立對HE 染色切片進(jìn)行評分（見圖2 和圖3），正態(tài)性檢驗后結(jié)果提示HE 染色評分服從非正態(tài)分布（shapiro-wilk test=0.81,P＜0.001），各組評分以中位數(shù)（百分位數(shù)P25-百分位數(shù)P75）展示。結(jié)果如下（見表1）：藥物治療組HE評分相較于模型組HE評分顯著下降（Wilcoxon test: W=148.00,P=0.005）。

表1 HE染色評分結(jié)果

圖3 小鼠子宮橫切面HE染色圖（400×）

3.3 COX-2、TNF-α免疫組化結(jié)果

圖4 可見，模型組COX-2 的表達(dá)顯著高于空白組（P＜0.05）。與模型組比較，低、中、高劑量組和孕三烯酮組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與低、中劑量組比較，高劑量組與孕三烯酮組有顯著性差異（P＜0.05）。此外，高劑量組與孕三烯酮組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 COX-2免疫組化結(jié)果比較

圖5 可見，模型組TNF-α 表達(dá)顯著高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量組及孕三烯酮組表達(dá)程度顯著降低（P＜0.05），高劑量組及孕三烯酮組較低中劑量組下調(diào)作用明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組與孕三烯酮組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 TNF-α免疫組化結(jié)果比較

3.4 COX-2和TNF-α的Western Blot結(jié)果

圖6 可見，模型組COX-2、TNF-α 表達(dá)較空白組明顯升高（P＜0.05），低、中、高劑量組和孕三烯酮組較模型組明顯降低（P＜0.05）；高劑量組和孕三烯酮組較低、中劑量組存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），高劑量組和孕三烯酮組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖6 各組小鼠COX-2、TNF-α Western Blot結(jié)果

3.5 IL-6、IL-8的血清ELISA結(jié)果

由圖7 可見，與空白組對比，模型組血清IL-6、IL-8 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組對比，低、中、高劑量組及孕三烯酮組均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但各治療組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖7 各組小鼠血清IL-6、IL-8血清ELISA結(jié)果

4 討論

AM 屬中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“痛經(jīng)”“月經(jīng)量多”“經(jīng)期延長”范疇，臨床常表現(xiàn)為漸進(jìn)性加重的痛經(jīng)、月經(jīng)異常和不孕等癥狀，伴隨子宮體積增大、壓痛等體征。中醫(yī)病因病機(jī)主要認(rèn)為其與“瘀血內(nèi)停”有關(guān)，因氣機(jī)阻滯、脈絡(luò)不通而致。2020 年《子宮腺肌病中國專家診療共識》推薦使用中藥治療AM 所致的痛經(jīng)[5]。針對“瘀血內(nèi)?！边@一病機(jī)，以桂枝茯苓丸、宮血寧膠囊（重樓）為主方，融入土瓜根散、奪命丹等方義合而成方，形成以桂枝、重樓為核心的具有通脈活血、化瘀消癥功效的通脈化癥湯，且臨床研究已證實以該方為核心的AM中醫(yī)綜合診療方案療效確切[8]。

目前西醫(yī)關(guān)于AM 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，前期對AM異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜病灶進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，AM 異位內(nèi)膜存在炎癥刺激、細(xì)胞運動、細(xì)胞增殖等通路和模塊的富集[9]。研究證實，AM 所致的痛經(jīng)、月經(jīng)異常和不孕與多種炎癥因子及炎癥刺激密切相關(guān)[2]。IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、COX-2 作為主要炎癥因子參與其中[7]。TNF-α 是由巨噬細(xì)胞分泌的介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子，可作為NF-κB 的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)NF-κB 通路的激活，從而促進(jìn)AM 基質(zhì)細(xì)胞中COX-2、VEGF、轉(zhuǎn)錄因子（TF）等表達(dá)的增加，介導(dǎo)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)、血管生成等活動。COX-2 作為編碼催化前列腺素E2（PGE2）的限速酶的因子，催化花生四烯酸生成前列腺素（PGs）和PGE2，PEG2 誘導(dǎo)P450 的合成，進(jìn)而促使局部雌二醇（E2）的合成與活化，其反過來又誘導(dǎo)COX-2 的進(jìn)一步生成，循環(huán)形成惡性循環(huán)，加重子宮腺肌癥炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞增殖、侵襲活動，是子宮腺肌癥患者痛經(jīng)、月經(jīng)異常的主要原因之一[10]。IL-6 和IL-8 作為主要細(xì)胞炎癥因子，參與AM 的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，IL-6可調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的活性，促進(jìn)機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)，又通過正反饋于AM 異位病灶，加劇其生長[11]。研究表明，AM 異位病灶中IL-6 水平明顯高于對照組，且與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，IL-6 mRNA 水平增加[12]。Luo等[13]發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體通過激活p38/ERK 信號通路，使IL-8 等表達(dá)增加，促進(jìn)AM 病灶的炎癥反應(yīng)、血管生成及增殖等異?；顒印Ｔ贏M患者中亦發(fā)現(xiàn)IL-8表達(dá)高于對照組及周期變化消失的現(xiàn)象，可能與AM 內(nèi)膜異常損傷修復(fù)密切相關(guān)[7,14]。由此可見，AM 的慢性炎癥反應(yīng)及痛經(jīng)、月經(jīng)異常等癥狀與TNF-α、COX-2、IL-6、IL-8 的異常有關(guān)。AM 可以通過實驗手段在實驗動物中產(chǎn)生，因為不同的激素失衡形式已被證明可以促進(jìn)該物種AM發(fā)展，所以小鼠模型被認(rèn)為是AM最常用的研究模型之一[15]。盡管該模型中AM 所需的確切激素變化不明確，但經(jīng)過病理和分子改變的研究表明，相較于其他造模方法，如垂體移植術(shù)，枸櫞酸他莫昔芬所誘導(dǎo)的子宮間質(zhì)、血管和子宮肌層的紊亂是AM 發(fā)展的關(guān)鍵[16]，故本研究使用枸櫞酸他莫昔芬誘導(dǎo)建立小鼠模型來觀察通脈化癥湯對AM 發(fā)展的進(jìn)程，從而探討對子宮腺肌病形成后所導(dǎo)致的炎性反應(yīng)的影響。通脈化癥湯中桂枝、重樓，牡丹皮等多種藥物現(xiàn)代藥理學(xué)研究已證實可通過NF-κB等多條通路下調(diào)TNF-α、COX-2、IL-6 等多種炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用[17-19]，且全方具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛效果，對于緩解AM 疼痛、月經(jīng)異常等癥狀療效確切。

實驗結(jié)果顯示HE 染色觀察模型組子宮內(nèi)膜與肌層邊界紊亂，內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及腺體侵入肌層，證明造模成功。在免疫組化及Western blot實驗中，通脈化癥湯各劑量組及孕三烯酮可顯著降低TNF-α 和COX-2的表達(dá)水平，其中以高劑量組和孕三烯酮組療效最佳，說明孕三烯酮與通脈化癥湯各劑量組尤其是高劑量組可抑制AM 小鼠病灶的炎癥因子等表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫水平，抑制AM 的發(fā)展進(jìn)程，值得進(jìn)一步深入研究。在ELISA 血清檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，模型組IL-6、IL-8 水平升高，說明AM 能引起機(jī)體炎癥因子表達(dá)升高，介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)；各治療組IL-6、IL-8 水平不同程度地降低，說明通脈化癥湯低、中、高劑量及孕三烯酮組均能減少炎癥因子的表達(dá)，延緩AM 發(fā)展的進(jìn)程，但各治療組間無顯著差異，可能是由于試劑盒、檢測儀器存在誤差、動物自身差異等問題，仍需進(jìn)一步重復(fù)實驗以驗證結(jié)果。進(jìn)一步關(guān)于AM 發(fā)病機(jī)制研究表明，發(fā)現(xiàn)AM 誘導(dǎo)的炎癥因子在病灶局部呈高表達(dá)，結(jié)合痛經(jīng)、不孕等表現(xiàn)，AM 被認(rèn)為屬于慢性炎癥性疾病，多種炎癥因子參與其中。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)通脈化癥湯對于患者AM 多種癥狀療效顯著，現(xiàn)代藥理學(xué)已證實所含桂枝、重樓等多種中藥及有效成分可發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能等作用[17-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)通脈化癥湯各劑量組均可下調(diào)AM 小鼠TNF-α、COX-2、IL-6、IL-8 的表達(dá)，其中高劑量組在下調(diào)TNF-α、COX-2 方面與孕三烯酮組療效相近，均優(yōu)于低、中劑量組，各治療組在下調(diào)模型小鼠血清IL-6、IL-8 的表達(dá)方面療效相當(dāng)。證實了通脈化癥湯可通過下調(diào)炎癥因子TNF-α、COX-2、IL-6、IL-8 的表達(dá)，進(jìn)而抑制AM 模型小鼠的炎性反應(yīng)，在研究AM 發(fā)病機(jī)制及治療靶點方面提供了方向，為指導(dǎo)臨床治療AM針對性用藥提供了借鑒。