新生兒膽汁淤積癥膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究進(jìn)展

賓淑銘 楊秀芳.2

1 廣東醫(yī)科大學(xué) （湛江 524023）

2 廣東省中山市人民醫(yī)院新生兒科（中山 528403）

新生兒肝內(nèi)膽汁淤積是指各種原因?qū)е履懼纬?、分泌和排泄功能障礙，膽汁流不能正常流入十二指腸，從而導(dǎo)致膽紅素、脂肪酸和其他物質(zhì)在血液、肝臟中儲(chǔ)積以及腸道中膽汁酸的不足的病理狀態(tài)［1］。新生兒血清總膽紅素（total bilirubin，TBil）≤5 mg/dL（85.5 μmol/L），并且血清直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）≥1.0 mg/dL（17.1 μmol/L），或TBil＞5 mg/dL（85.5 μmol/L），并且DBil占TBil的比例≥20%，臨床表現(xiàn)為大便顏色變淺；肝臟增大?？稍\斷新生兒膽汁淤積癥［2］。膽汁淤積癥病因譜復(fù)雜，包括感染、肝內(nèi)疾病、肝外膽道發(fā)育異常、酶缺乏引起的代謝異常、中毒等內(nèi)外科疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及膽汁酸形成、轉(zhuǎn)運(yùn)體及其轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，不同的病因引起的膽汁淤積的預(yù)后均不相同，早期及時(shí)診治，病情是可逆的，部分患兒可伴有皮膚瘙癢、體質(zhì)量下降及營(yíng)養(yǎng)不良，嚴(yán)重者可出現(xiàn)精神煩躁不安、肝纖維化、肝功能衰竭，部分患兒還需要手術(shù)治療，甚至肝移植，危及生命［3］，故早期診斷和治療對(duì)新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥極為重要。本文通過總結(jié)近年來國(guó)內(nèi)外關(guān)于新生兒膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及其轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控了解、分析新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)病機(jī)制，從而為此疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 膽汁酸的形成

人體膽固醇的去路主要是膽固醇通過多種步驟和酶作用生成膽汁酸，其中生成最多的是鵝脫氧膽酸和膽酸。膽汁酸的生成途徑包括經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，經(jīng)典途徑在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生成疏水性初級(jí)膽汁酸：膽酸（cholic acid，CA）和鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA），其主要限速酶為膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7-hydroxylase，CYP7A1）。而當(dāng)肝臟CYP7A1活性下降時(shí)，可以通過由位于線粒體的甾醇 27A 羥化酶（sterol 27A-hydroxylase，CYP27A1）和位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧甾醇和類固醇 7 -羥化酶（oxysterol and steroid 7 -hydroxylase，CYP7B1）啟動(dòng)和介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡，非經(jīng)典途徑在多種組織及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CDCA［4］。

2 肝臟膽汁酸分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)體

肝臟生成膽汁酸后由膽管輸送至膽囊儲(chǔ)存，在進(jìn)食時(shí)分泌到腸道，小部分通過糞便排出體外，在回腸中大部分的膽汁酸可以通過小腸刷狀緣細(xì)胞表面的頂膜鈉離子依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT）的主動(dòng)重吸收進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，隨后從腸上皮細(xì)胞極性膜一側(cè)被轉(zhuǎn)運(yùn)至基底膜，再由有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 α /β（ organic solute transporter，OSTα /β）將其排出細(xì)胞外，進(jìn)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到門靜脈隨血流運(yùn)回肝臟。而被轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟的膽汁酸被肝細(xì)胞的鈉-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)肽（Na+-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP，SLC10A1）主動(dòng)吸收進(jìn)入肝細(xì)胞，最終由肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜的膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）分泌進(jìn)入膽道系統(tǒng)。這是維持人體膽汁酸平衡的腸肝循環(huán)，而這一過程非常復(fù)雜，需要參加膽汁分泌的肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)體［5］。

2.1 肝細(xì)胞水平的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體

肝細(xì)胞膜分為竇膜、側(cè)膜、毛細(xì)膽管膜，兩個(gè)相鄰的肝細(xì)胞的膽管組成毛細(xì)膽管，毛細(xì)膽管再集合成膽管。在肝細(xì)胞中主要通過Na+依賴性膽鹽攝取系統(tǒng)和非Na+依賴性膽鹽攝取系統(tǒng)把肝門靜脈內(nèi)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)。

2.1.1 Na+依賴性膽鹽攝取系統(tǒng)：NTCP是肝臟最重要的膽鹽和膽汁酸（total bile acid，TBA）的轉(zhuǎn)運(yùn)體，屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族，將超過80%的結(jié)合?；悄懰猁}和不到50%的非結(jié)合膽酸從血液攝取到肝細(xì)胞，是調(diào)節(jié)膽汁酸動(dòng)態(tài)平衡的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［6］。NTCP缺乏癥是由SLC10A1基因雙等位基因突變引起，多表現(xiàn)出高膽紅素血癥，在嬰兒早期出現(xiàn)一過性淤膽性黃疸、肝酶升高和25-羥基維生素D缺乏，經(jīng)過對(duì)癥和支持性治療后均表現(xiàn)出良好的臨床結(jié)果［7］。

2.1.2 非Na+依賴性膽鹽攝取系統(tǒng)：主要包括有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic anion transporting protein，OATP）：OATP屬于溶質(zhì)載體類超家族。主要在肝臟表達(dá)的分別有OATP1B1、OATP1B3，他們可以轉(zhuǎn)運(yùn)非結(jié)合型膽汁酸如膽酸、鵝去氧膽酸和脫氧膽酸，但熊去氧膽汁酸和石膽酸不能通過它們轉(zhuǎn)運(yùn)，而OATP1B1、OATP1B3能轉(zhuǎn)運(yùn)所有結(jié)合型膽酸，且其優(yōu)于非結(jié)合型都能通過［8-9］，有研究表明OATP1B蛋白的下調(diào)可能參與了黃疸伴晚期膽汁淤積性肝病的發(fā)病機(jī)制［10］。

2.2 毛細(xì)膽管膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體

參與毛細(xì)膽管膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白體包括ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和非ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

2.2.1 ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：又稱ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP-binding-cassette-transport proteins）。轉(zhuǎn)運(yùn)底物包括膽固醇、膽鹽及代謝產(chǎn)物。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體包括：①膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）：由ABCB11基因編碼的BSEP主要表達(dá)在毛細(xì)膽管面的肝細(xì)胞膜上，與單價(jià)膽汁酸鹽結(jié)合后通過水解 ATP 將膽鹽逆濃度梯度泵入毛細(xì)膽管內(nèi)［11］。BSEP在細(xì)胞表面的表達(dá)可以通過動(dòng)員肝細(xì)胞中含有BSEP的小泡或通過小管膜上受控的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白內(nèi)化來快速調(diào)節(jié)［6］。ABCB11的基因突變多達(dá)200種，它的突變可以使 BSEP在HEK293 細(xì)胞膜上表達(dá)降低，在MDCK 細(xì)胞膜上分布減少，導(dǎo)致肝細(xì)胞產(chǎn)生和分泌膽汁減少［12］。②多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance associated protein 2，MRP2）：MRP2由 ABCC2基因編碼，可介導(dǎo)多種有機(jī)陰離子從毛細(xì)膽管排出，如膽紅素、谷光甘肽等。Dubin-Johnson綜合征是由ABCC2基因突變導(dǎo)致肝細(xì)胞小管膜上功能性MRP2蛋白缺失引起的，表現(xiàn)為孤立性結(jié)合性高膽紅素血，通常被認(rèn)為是不需要治療的良性疾病，但也有研究者提出MRP2功能喪失也會(huì)影響多種藥物、毒物和內(nèi)生生物的藥代動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致其吸收、器官分布和清除發(fā)生變化，增加藥物毒性和相互作用的可能性［13］。③多藥耐藥磷脂糖蛋白（multidrug resistance P-glycoprotein 3，MDR3，ABCB4）：是一種特殊的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂通過小管膜，新生小鼠的Mdr2（人MDR3）雜合缺失容易在出生后感染時(shí)導(dǎo)致肝臟的促炎反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的肝外膽道閉鎖阻塞性表型。而人肝臟MDR3的改變可能調(diào)節(jié)肝臟的免疫功能，并使新生兒對(duì)炎癥性肝膽損傷具有易感性［14］。

2.2.2 腸上皮細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體 結(jié)合的膽鹽經(jīng)過腸道排入后，通過腸細(xì)胞頂端膜的ASBT和在酸性條件下OATP2B1介導(dǎo)牛磺膽酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取作用，在腸道末端的結(jié)腸被大量的重吸收。膽鹽在腸細(xì)胞內(nèi)被攝入后經(jīng)過結(jié)腸膽汁酸結(jié)合蛋白被運(yùn)輸至結(jié)腸細(xì)胞的基側(cè)膜，然后通過結(jié)腸細(xì)胞基側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)體有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體α-β分泌至門靜脈循環(huán)中。

頂膜鈉離子依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 ASBT是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC10家族的第二個(gè)成員，由位于人類染色體13q33上SLC10A2的基因編碼。95%的膽酸被回腸末端的ASBT重吸收，是膽汁酸-膽固醇平衡和膽汁酸EHC的關(guān)鍵成分。ASBT表達(dá)的降低增加了糞便中BAs的排泄，降低了肝臟中BAs的總濃度和磷脂酰膽堿PC/BA的比值，從而進(jìn)一步改善膽汁淤積［15-17］。在病理及生理刺激下，可以通過N-糖基化、酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)ASBT的表面表達(dá)、功能和穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)維持BA的穩(wěn)態(tài)。例如，腸致病性大腸桿菌對(duì)磷酸化狀態(tài)的有負(fù)面作用，導(dǎo)致ASBT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的抑制［18-20］。

有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體α-β（Organic Solute Transporter alfa-beta，OSTα-OSTβ）是位于腸細(xì)胞的基底外側(cè)的異構(gòu)體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由第3號(hào)染色體和第15號(hào)染色體上的SLC51A和SLC51B基因分別編碼OSTα和OSTβ。通過對(duì)多種膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)的研究發(fā)現(xiàn)，OSTα/β具有較低的親和力，但具有較高的轉(zhuǎn)運(yùn)甘氨酸和牛磺酸結(jié)合膽汁酸和非結(jié)合膽汁酸的能力。在對(duì)OSTα或OSTβ缺乏癥患者的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)患者均表現(xiàn)出轉(zhuǎn)氨酶（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶＞天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶）和谷草轉(zhuǎn)氨酶）均升高，但膽汁酸循環(huán)均正常。OSTα缺乏的肝病更嚴(yán)重，表現(xiàn)出肝硬化伴門靜脈和門靜脈周圍小葉纖維化［21-22］。

3 膽汁淤積時(shí)肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控的異常導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在胞膜上表達(dá)異常是膽汁淤積發(fā)生的主要機(jī)制。肝細(xì)胞的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的調(diào)控是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)決定性的機(jī)制，其中包括有許多肝臟細(xì)胞的細(xì)胞核的激素受體（nuclear hormone receptor，NHR）的超家族，例如：FXR，PXR和CAR以及其他配體激活的轉(zhuǎn)錄因子的作用。

3.1 NHR 超家族

3.1.1 法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）：是核受體超家族的成員，在肝臟和腸道高度表達(dá)，是一種內(nèi)源性膽汁酸傳感器，F(xiàn) X R 被內(nèi)源性配體膽汁酸激活，在膽汁酸的合成、肝臟排泄、腸道和肝臟攝取有重要的作用。對(duì)FXR最有效的配體是CDCA，其次是脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）和CA，而熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）抑制FXR的激活。在小腸中，F(xiàn)XR可以通過激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19（fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19）下調(diào)CYP7A1的表達(dá)，但通過對(duì)新生兒FGF19濃度與CYP7A1活性相關(guān)性的研究中，發(fā)現(xiàn)新生兒的FXRFGF19-CYP7A1功能不全［24］，而部分早產(chǎn)兒需要腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)期間腸道FX激活不足使FXRFGF19信號(hào)軸受損導(dǎo)致膽汁淤積，增加了膽汁淤積的風(fēng)險(xiǎn)［25］。在肝臟中，CYP7A1的表達(dá)受FXR與其他基因相互作用調(diào)控。核孤兒受體肝臟相關(guān)同系物 1（liver related homologue-1，LRH-1）可以與 CYP7A1的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合來上調(diào) CYP7A1的轉(zhuǎn)錄，而FXR與視黃酸 X受體 （retinoid X receptor，RXR ）結(jié)合形成的異源二聚體與小異二聚體伴侶（small heterodimer partner-1，SHP-1）結(jié)合并上調(diào)SHP-1的表達(dá)，而SHP-1抑制LRH-1的活性［4］。在膽汁淤積時(shí)，F(xiàn)XR下調(diào)肝臟攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NTCP、OATP1B1，上調(diào)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OSTα-OSTβ、BSEP、MRP2、ASBT、和MDR3的表達(dá)。除此之外FXR可能有助于膽汁淤積性肝損傷中肝細(xì)胞的再生和修復(fù)，F(xiàn)XR缺陷小鼠的肝損傷比野生型小鼠更嚴(yán)重，再生DNA合成峰值降低，參與肝再生的基因誘導(dǎo)減少［26］。腸道微生物在BA的生物轉(zhuǎn)化中起重要作用，而在對(duì)小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)抗生素的使用如慶大霉素和萬古霉素菌使小鼠菌群豐度顯著下降，從而使小鼠FXR的拮抗劑-?；撬峤Y(jié)合β-鼠膽酸水平增加，下調(diào)FXR反饋機(jī)制，增加了BA的合成，最終加重膽汁淤積的形成［27］。

3.1.2 孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）：此受體蛋白是有機(jī)陰、陽離子和膽鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)體，具有對(duì)膽鹽羥基化、解毒作用。PXR可結(jié)合大量的外源性化學(xué)物質(zhì)，使MRP3和多種細(xì)胞色素酶上調(diào)，尤其是對(duì)細(xì)胞色素P450 3A酶（cytochrome P450 3A，CYP3A），起到解毒和增加了排泌的作用。膽汁酸通過PXR在調(diào)節(jié)腸道炎癥中發(fā)揮作用，但對(duì)體內(nèi)肝臟炎癥的作用尚未明確［28］。

3.1.3 組成型雄烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）：CAR可以通過多種途徑調(diào)節(jié)膽汁酸平衡，包括上調(diào)用于膽汁酸羥基化的CYP3A和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2，誘導(dǎo)可以抵抗膽汁酸肝毒性的硫轉(zhuǎn)移酶（sulfotransferase，SULT）的表達(dá)［29］。但在不同的膽汁淤積病因中，CAR有不同的調(diào)節(jié)，如在原發(fā)性膽管炎中，它們的表達(dá)中度減少，而在膽管結(jié)扎所致膽汁淤積的大鼠模型下，CAR表達(dá)在早期升高，而后期逐漸下降至消失［30］。

3.1.4 維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）：VDR在膽管細(xì)胞中高度表達(dá)，可以通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)維生素D的生物學(xué)效應(yīng)，如抗炎和抗纖維化作用。在膽道結(jié)扎小鼠模型VDR的缺失會(huì)改變膽管上皮細(xì)胞的屏障功能，加重其急性淤膽性肝損傷的表現(xiàn)，而在慢性膽管疾病小鼠模型中VDR的丟失加重了膽汁淤積、肝臟炎癥和纖維化［31］。除此之外，VDR的激活抑制肝SHP，從而增加小鼠和人CYP7A1的水平并降低膽固醇［32］。

3.2 其他轉(zhuǎn)錄因子

肝細(xì)胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）分布在多種組織器官，其中肝細(xì)胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor1α，HNF1α）和肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）在調(diào)節(jié)膽汁酸平衡發(fā)揮重要作用。肝細(xì)胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor-1α，HNF-1α）是由Tcf1基因所編碼的Tcf1蛋白或轉(zhuǎn)錄因子。Shih等［33］發(fā)現(xiàn)，小鼠肝組織 HNF-1 α基因被敲除，F(xiàn)xr的表達(dá)受損并使Shp水平下降，導(dǎo)致Cyp7a1活性增加，最終增加膽汁酸合成，除此之外HNF-1 α受損使OATP1、OATP2 和NTCP的表達(dá)明顯下降。HNF4α在大鼠Cyp7a1和 人CYP27A1基因啟動(dòng)子上有其結(jié)合位點(diǎn)，HNF4α可以通過與PXR相互作用抑制CYP7A1，是CYP7A1基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［34］。

4 肝內(nèi)膽汁淤積的主要原因

毛細(xì)膽管膽汁生成衰竭是肝內(nèi)膽汁淤積的主要原因。引起膽汁生成衰竭的機(jī)制：（1）因某些因素致肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、功能和酶活性發(fā)生了變化，從而引起肝細(xì)胞對(duì)膽汁的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)功能發(fā)生異常，從而導(dǎo)致膽汁淤積。（2）完整的細(xì)胞骨架功能對(duì)膽汁的排泄作用十分重要。當(dāng)圍繞毛細(xì)膽管周圍的微絲收縮所依賴的肌動(dòng)蛋白功能喪失，將使微絲不能收縮，從而引起毛細(xì)膽管內(nèi)膽汁淤積。（3）毛細(xì)膽管的通滲性發(fā)生改變，使溶質(zhì)彌散，膽汁內(nèi)的水流減少，從而滲透梯度喪失，膽汁淤積發(fā)生。（4）膽管阻塞，在膽管任何途徑上發(fā)生梗阻，均可造成膽汁淤積。

綜上所述，新生兒肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病的機(jī)制涉及參與肝臟膽汁酸分泌的各種轉(zhuǎn)運(yùn)體、肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控等。本文歸納總結(jié)近年來國(guó)內(nèi)外關(guān)于肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病機(jī)制的研究成果，從而為此疾病的防治提供理論依據(jù)，為將來降低其發(fā)生率和改善預(yù)后。