紅酵母基因組和代謝工程改造研究進(jìn)展

李雨真 梅天秀 李治文 王淇 李俊 鄒岳 趙心清

（1.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國家重點實驗室 教育部代謝與發(fā)育國際科學(xué)國際合作聯(lián)合實驗室，上海 200240；2.伽藍(lán)（集團(tuán)）股份有限公司，上海 200233）

紅酵母是一類能產(chǎn)紅色素酵母的總稱［1-2］，不是分類學(xué)的定義。紅酵母包括鎖擲酵母屬（Sporidiobolus）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）和紅冬孢酵母屬（Rhodosporidiobolus）等不同屬的菌株，其中研究得較深入的是紅酵母屬，目前其分類還存在一定的爭議，有將其歸為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、銹菌綱（Urediniomycetes）、擔(dān)孢目（Sporidiales）、鎖擲酵母科（Sporidiobolaceae）［3］，也有歸為半知菌亞門（Deuteromycotina）、芽孢綱（Blastomycetes）、隱球酵母目（Cryptococcales）［4］。

特定環(huán)境有不同的紅酵母分布。根據(jù)目前的研究報道，我國淡水水域紅酵母主要有3個種，其中深紅酵母（R.rubra）是中國淡水紅酵母的優(yōu)勢種，黏紅酵母（R.glutinis）次之，小紅酵母（R.minuta）數(shù)量最少［5］。而在世界各大洋和我國黃、渤海沿岸中分離的紅酵母主要有4個種，即深紅酵母（R.rubra）、黏紅酵母（R.glutinis）、小紅酵母（R.minuta）和牧草紅酵母（R.graminis），還報道從渤海海水中分離到了橙黃紅酵母（R.aurantiaca），其中深紅酵母是優(yōu)勢菌，數(shù)量大大超過其他幾種紅酵母［6］。

紅酵母具有較強的環(huán)境適應(yīng)力，廣泛分布于陸地、海洋、江河、湖泊等各種生態(tài)環(huán)境，因具有生產(chǎn)多種營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)的能力而得到廣泛研究，是具有很大潛力的工業(yè)生產(chǎn)菌株。紅酵母在養(yǎng)殖、食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域也有非常多的應(yīng)用，是一類重要的酵母菌。近年來對紅酵母的研究逐漸深入，在基因組分析和關(guān)鍵酶研究、基因組編輯和遺傳工程改造等方面取得了良好進(jìn)展，對構(gòu)建高效紅酵母細(xì)胞工廠具有重要意義。本文對紅酵母的應(yīng)用和研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為未來更好利用紅酵母進(jìn)行活性物質(zhì)生產(chǎn)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 紅酵母的用途及其生產(chǎn)的活性物質(zhì)

1.1 紅酵母的用途

紅酵母廣泛分布于海洋和海產(chǎn)動物體表及腸道內(nèi)，因其易得、低成本的特點受到水產(chǎn)養(yǎng)殖者的青睞，被廣泛選用為魚、蝦、蟹、貝、海參等水產(chǎn)動物幼體浮游期的鮮活誘餌。例如，從不同海產(chǎn)動物腸道中分離得到的紅酵母RY4，經(jīng)分子鑒定與膠紅酵母（R.mucilaginous）同源性較高，與其模式菌株ITS和26S rRNA基因序列相似度均超99%，在對蝦育苗期間多次添加高劑量或在幼體早期如無節(jié)Ⅳ期單次添加高劑量，可有效促進(jìn)幼體變態(tài)與營養(yǎng)不足時的存活［7］。紅酵母（Sporidiobolus pararoseus）可作為一種抗生素生長促進(jìn)劑（AGPs）的替代品加入產(chǎn)蛋雞的飲食中，有效改善蛋形指數(shù)、哈夫單位值（Haugh unit）和蛋黃顏色，減少蛋黃膽固醇含量［8］。小鼠灌胃實驗證明，膠紅酵母ZTHY2對小鼠免疫功能有增強作用［3］。在羅非魚日糧中添加海洋源膠紅酵母CYJ03，能有效提高羅非魚的生長性能、提高血清和肝臟的總抗氧化能力（T-AOC）和抗氧化酶活性［9］。以上研究表明，紅酵母可作為養(yǎng)殖飼料的添加劑，促進(jìn)動物的生長發(fā)育，助力養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

此外，紅酵母在食品、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理等方面也有廣泛應(yīng)用。野生膠紅酵母糖苷酶對制造媚麗葡萄酒具有良好的增香釀造應(yīng)用潛力［10］。將膠紅酵母和釀酒酵母依次接種，有助于降低發(fā)酵速率，增加膠紅酵母生長時間，提升糖苷酶的活性［11］。紅酵母紅素（torularhodin）和多糖對急性肝損傷存在干預(yù)作用，為開發(fā)功能保健品提供了科學(xué)依據(jù)和理論支持［12］。酵母產(chǎn)的紅色素還能抑制細(xì)胞中活性氧的積累，減少轉(zhuǎn)基因果蠅腦中淀粉樣乙型蛋白水平和神經(jīng)變性的面積，在治療神經(jīng)退行性疾病方面具有較大潛力［13］。海洋真菌小紅酵母（R.minuta）MNP100101A具有抗腫瘤活性，對腫瘤細(xì)胞HepG2（肝癌細(xì)胞）、PC-12（神經(jīng)癌細(xì)胞）均具有一定細(xì)胞毒性，為新藥篩選提供基礎(chǔ)［14］。

酵母發(fā)酵物因含有豐富的活性成分被廣泛應(yīng)用于化妝品中，主要功效有美白、保濕、抗衰老、調(diào)理皮膚酸堿度并修復(fù)受損皮膚等。近年來，許多化妝品都使用了微生物發(fā)酵技術(shù)，其添加成分大致分為酵母提取物、酵母溶胞產(chǎn)物提取物、酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物和酵母發(fā)酵產(chǎn)物溶胞濾液4類，如海洋紅酵母面膜以海洋紅酵母提取液為主要成分，具有良好的抗衰老、修護(hù)、美白保濕功效［15］；抗衰老眼霜中含有富番茄紅素酵母提取物，具有提升皮膚含水量和彈性、降低經(jīng)皮水分丟失、減少皺紋、改善皮膚暗黃的長效護(hù)膚作用［16］。

在環(huán)境治理方面，黏紅酵母ARTP-17菌株能利用工業(yè)廢水為底物進(jìn)行油脂的生產(chǎn)，在處理廢水的同時，還能降低微生物油脂生產(chǎn)的成本，因此在環(huán)境生物修復(fù)和生物煉制等領(lǐng)域具有重要意義［17］。

1.2 紅酵母的活性物質(zhì)

紅酵母富含蛋白質(zhì)、多糖等常規(guī)營養(yǎng)成分，可以生產(chǎn)類胡蘿卜素、番茄紅素、多不飽和脂肪酸、維生素E和核苷酸等生物活性物質(zhì)［18］，這些活性物質(zhì)在不同領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價值。

1.2.1 多肽和酶 酵母中含有豐富的多肽，其氨基酸組成合理，生產(chǎn)條件易于控制，且具有多種活性，如抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、抗氧化等，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。

從冰川中分離得到的紅酵母（Rhodotorula）菌株至少產(chǎn)兩種胞外酶，其中少部分產(chǎn)5種酶（纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、脲酶蛋白酶、脂肪酶），絕大部分產(chǎn)纖維素酶和果膠酶，產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的菌株相對較少［19］。從土壤、奶制品、水果中篩選獲得了3株高氨氮利用的酵母菌，分別是膠紅酵母（R.mucilaginosa）SXAU-002、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SXAU-001和戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）SXAU-003。比較3株酵母菌的谷氨酸脫氫酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶活性發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母的酶活性最高，其次是膠紅酵母。這兩種優(yōu)良菌株產(chǎn)生的酶應(yīng)用在飼料中，可滿足水產(chǎn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，是酵母類單細(xì)胞蛋白飼料發(fā)酵的優(yōu)良菌株［20］。從膠紅酵母中分離并純化的醛縮酶，也可作為降解次生有毒代謝物棒曲霉素（patulin）的材料，為工業(yè)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)［21］。在膠紅酵母BEI29的胞外酶液中檢測到了β-D-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-木糖苷酶和酯酶，這些酶的添加能顯著提升葡萄酒的香氣質(zhì)量，使所釀酒具有較好的果香和花香［22］。紅酵母這種產(chǎn)胞外酶的特性可被廣泛用于食品、化妝品、制藥等領(lǐng)域中，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.2.2 多糖 采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，膠紅酵母胞外多糖組分（R.mucilaginosaexo-polysaccharide 2-A, REPS2-A）能有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，使肝癌細(xì)胞HepG2阻滯發(fā)生在G1/S期［23］。對R.mucilaginosaCM-1進(jìn)行無機(jī)培養(yǎng)基分離，純化得到了均一、純度高的酵母胞外多糖組分 RmEPS-11［24］。進(jìn)一步評估RmEPS-11對小鼠異煙肼（INH）和利福平（RIF）引起的肝臟毒性的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，與異煙肼和利福平處理的小鼠相比，RmEPS-11給藥后各項指標(biāo)均有所好轉(zhuǎn)，證明多糖RmEPS-11對小鼠急性肝損傷有一定的保護(hù)作用［25］。這些結(jié)果表明，膠紅酵母胞外多糖具有成為治療肝癌或作為抗腫瘤藥物的潛力，但對其抑制癌癥的機(jī)制、毒性及產(chǎn)糖相關(guān)的基因方面仍不清楚，有待深入研究。

1.2.3 類胡蘿卜素 類胡蘿卜素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，其中最有價值的是蝦青素，是一類酮式類胡蘿卜素，具有極強的抗氧化能力，可由多種紅酵母來生產(chǎn)。多篇文獻(xiàn)都報道了紅酵母能合成蝦青素，如擔(dān)子菌酵母（basidiomycete yeast）中的紅發(fā)夫酵母（Phaffia rhodozyma）［26］及其遠(yuǎn)緣菌種Xanthophyllomyces dendrorhous［27-28］。Dioszegiasp［29］還有紅酵母屬（Rhodotorula），擲孢酵母屬（Sporobolomyces）和鎖擲酵母屬（Sporidiobolus）的少數(shù)物種也是類胡蘿卜素的生產(chǎn)者［28］。

類胡蘿卜素可通過非特異性反應(yīng)或類胡蘿卜素裂解加氧酶作用裂解產(chǎn)生去甲腎上腺素，從而產(chǎn)生花香、果香和甜香，改變食品風(fēng)味［30］，在食品、藥品、化妝品方面有多種應(yīng)用。

此外，類胡蘿卜素作為天然食品著色劑，因其易獲得性、非季節(jié)性、可擴(kuò)展性和產(chǎn)量高而成為合成化合物的有效替代品［31］。1997年起，浙江工業(yè)大學(xué)、華南理工大學(xué)以及農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（原農(nóng)業(yè)部）飼料中心等科研單位對紅發(fā)夫酵母高產(chǎn)蝦青素突變株篩選和發(fā)酵代謝調(diào)控、蝦青素的提取方法等方面進(jìn)行了深入研究［18］。近幾年，許多研究試圖通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來提高幾種膠紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量。通過優(yōu)化膠紅酵母 ZTHY2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件明顯提升了類胡蘿卜素產(chǎn)量［3］，對航天誘變膠紅酵母突變株JH-R23膠紅酵母突變株合成蝦青素的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并對其生長特性進(jìn)行探究［32］,將膠紅酵母AJB01置于各種壓力條件下，包括不同鹽的滲透壓力、紫外線的物理壓力和使用不同光周期的光照壓力，最終探究出產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳條件［33］。

以上研究工作為類胡蘿卜素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件和基礎(chǔ)，未來有望實現(xiàn)更低成本的大規(guī)模生產(chǎn)。值得注意的是，天然色素也存在一定的問題，如對紅酵母發(fā)酵時氣味的去除、無毒和無致病性菌株的使用、環(huán)境中的穩(wěn)定性和保質(zhì)期問題，隨著對紅酵母的認(rèn)識和代謝工程改造的發(fā)展，以上問題也將得到更好解決。

紅酵母還能產(chǎn)生其他副產(chǎn)品，如油性酵母R.pacificaINDKK可通過利用未解毒的制糖工業(yè)廢料生產(chǎn)生物柴油及其他具有商業(yè)價值的副產(chǎn)品（脂質(zhì)、β-胡蘿卜素和動物飼料），從甘蔗渣廢棄的半纖維素部分生產(chǎn)木寡糖（XOS）可以進(jìn)一步減少生物柴油的生產(chǎn)成本［34］。表1列出了紅酵母的主要活性成分和用途。

表1 紅酵母的活性成分及用途Table 1 Active ingredients and uses of red yeast

1.3 紅酵母的基因組研究

隨著研究手段不斷進(jìn)步，對紅酵母基因組的研究變得更加深入和完善，目前，已完成了多種紅酵母的基因組測序，主要包括膠紅酵母（R.mucilaginosa）、圓紅酵母（R.toruloides）和克氏紅酵母（R.kratochvilovae）等種，其基因組大小及注釋相關(guān)信息如表2所示。

表2 紅酵母屬部分種基因組裝和注釋數(shù)據(jù)Table 2 Gene assembly and annotation data for selected species of the genus Rhodotorula

由表2可得，膠紅酵母（R.mucilaginosa）是研究最多的種，其次是圓紅酵母（R.toruloides）和克氏紅酵母（R.kratochvilovae），其他菌種也有少部分有測序，但大部分測序水平都集中在contig和scaffold水平，未完成scaffold在染色體上的定位，因此沒有完整全基因組序列。

對具有基因組信息的膠紅酵母的101個菌株來源進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。絕大部分（91%）都來自于國際空間站（ISS），包括環(huán)境表面、餐桌、永久多用途艙、乘員補給車、廢物和衛(wèi)生隔間及零重力儲存架等，還有少部分是從土壤（3%）、濕地（1%）、海洋（1%）、種子（1%）、Kefir（開菲爾）（1%）、血液（1%）和農(nóng)貿(mào)市場（1%）中分離得到的。國際空間站來源的膠紅酵母測序占主導(dǎo)，其原因是個別膠紅酵母菌株被歸為病原菌株，可在中心靜脈血管上聚居，形成生物膜而引起真菌血癥［51］。國際空間站微重力和輻射等極端條件能增強抗菌性和生物膜形成，對膠紅酵母進(jìn)行基因組測序為進(jìn)一步研究消除這種威脅提供了基礎(chǔ)。因此，基因組研究提示在紅酵母應(yīng)用中需要注意可能的病原菌的風(fēng)險，進(jìn)行合理的安全評價。

圖1 有基因組序列的膠紅酵母來源分析Fig.1 Analysis of the origin of R.mucilaginosa strains with sequenced genome information

通過對紅酵母的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了多個生物合成基因簇。例如，對膠紅酵母CYJ03的基因組進(jìn)行掃描時，發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)類胡蘿卜素的生物合成基因簇［45］，RIT389種中發(fā)現(xiàn)了生產(chǎn)類胡蘿卜素關(guān)鍵基因的基因組區(qū)域［52］，50-3-19/20B中發(fā)現(xiàn)了合成萜類化合物、非核糖體多肽合酶（NRPS）和脂肪酸的基因簇并鑒定了一種外源性胰島素酶的基因位點（g1629.t1）［53］。對JGTA-S1進(jìn)行測序、組裝和注釋發(fā)現(xiàn)，其擁有幾個有利于內(nèi)生生存的基因，如溶解磷酸鹽和生產(chǎn)植物激素的基因。此外，還具有功能性抗凍基因g5846.t1和g5876.t1，在氮代謝方面十分獨特，其硝酸鹽同化途徑被截斷，可能導(dǎo)致與重氮內(nèi)生菌的聯(lián)系和維持，使得對其與植物的有益互作有了更深入了解［54］。這些基因組的研究為紅酵母代謝和生物合成研究提供了基因組學(xué)見解。

新一代DNA測序技術(shù)的發(fā)展推動了高通量轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）及基因表達(dá)譜分析的成熟，動態(tài)的轉(zhuǎn)錄組比靜態(tài)的基因組更加復(fù)雜，因而能對紅酵母的遺傳信息有更深入了解。對R.toruloidesNP 11進(jìn)行基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明，在氮限制條件下脂質(zhì)積累與脂肪生成、含氮化合物回收、大分子代謝和自噬的誘導(dǎo)有關(guān)，這為設(shè)計脂質(zhì)生產(chǎn)途徑提供了寶貴資源［55］。此外，通過對NP11線粒體基因組進(jìn)行重組和注釋，并與其他菌種進(jìn)行比較，表明交配類型互補品系的線粒體基因組之間存在明顯的遺傳差異，也補充了對圓紅酵母遺傳背景的理解，未來有望開啟編輯線粒體基因組的大門，進(jìn)行更合理的代謝工程和表型設(shè)計［56］。

利用YEASTRACT+門戶網(wǎng)站及其數(shù)據(jù)設(shè)計了分析酵母基因組的序列工具，在預(yù)測圓紅酵母轉(zhuǎn)錄因子RtHaa1對乙酸脅迫反應(yīng)方面有應(yīng)用，為在基因組尺度上預(yù)測發(fā)生在圓紅酵母中的調(diào)節(jié)相互作用鋪平了道路，有助于選擇和設(shè)計出用于木質(zhì)纖維素生物煉制的更強大菌株［57］。

在蛋白質(zhì)組學(xué)方面，通過將不同蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程應(yīng)用于膠紅酵母以評估產(chǎn)蛋白質(zhì)和功能信息方面的潛力，產(chǎn)生了大量關(guān)于膠紅酵母代謝的信息［58］。根據(jù)生物化學(xué)分析和RNA測序，研究了糖酵解、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化3種關(guān)鍵途徑，發(fā)現(xiàn)在Pb脅迫下R.mucilaginosa顯示出對廣泛的Pb2+濃度的耐受性，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析確定了參與碳水化合物和生物能量代謝的幾個關(guān)鍵基因，這些基因?qū)b2+壓力有反應(yīng)，揭示了紅酵母關(guān)鍵代謝途徑和重金屬脅迫在RNA水平上的相關(guān)性［59］。

2 紅酵母的遺傳改造研究進(jìn)展

為了更好利用紅酵母生產(chǎn)所感興趣的活性代謝物，需結(jié)合菌株的遺傳改造和培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化。研究者對紅酵母的代謝工程改造進(jìn)行深入研究，確定了影響目標(biāo)代謝的關(guān)鍵基因位點，再對菌株進(jìn)行遺傳改造，構(gòu)建出更具有生產(chǎn)優(yōu)勢的紅酵母菌種。紅酵母代謝工程改造的技術(shù)路線，以及對關(guān)鍵的遺傳改造方法見圖2。

圖2 紅酵母的研究改造Fig.2 Research and modification of red yeast

2.1 紅酵母的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

酵母菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT）、電轉(zhuǎn)化和化學(xué)轉(zhuǎn)化等。ATMT是目前在圓紅冬孢酵母遺傳改造比較常用的轉(zhuǎn)化方法，對該方法進(jìn)行優(yōu)化，研究者發(fā)現(xiàn)了和圓紅冬孢酵母色素合成相關(guān)的關(guān)鍵基因［60］。在另一項研究中，研究者利用序列條形碼農(nóng)桿菌T-DNA插入圓紅冬孢酵母基因組獲得突變體文庫，發(fā)現(xiàn)了1 337個低T-DNA插入率的可能的必須基因。進(jìn)一步分析研究突變體的遺傳組成，利用基因敲除證明35個基因和脂肪酸分解和油脂積累有關(guān)，鑒定了高可信度的數(shù)據(jù)集，包含150個影響油脂積累的基因，包括和信號途徑、蛋白修飾和自噬等相關(guān)的基因，以及未知功能的基因，證明了條形碼突變（barcoded mutagenesis）對真菌功能基因組的影響［61］。紅酵母的電轉(zhuǎn)化和化學(xué)轉(zhuǎn)化方法也獲得了成功，例如我國學(xué)者建立了簡單高效的R.toruloides電轉(zhuǎn)化方法［62］，利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化也實現(xiàn)了R.glutinis的菌株改造［63］。值得注意的是，不同菌株其合適的遺傳轉(zhuǎn)化方法也可能不同，因此需要針對特定菌株進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 紅酵母基因編輯工具開發(fā)

基于CRISPR/Cas9的基因組編輯系統(tǒng)目前已經(jīng)廣泛用于多種酵母的菌株改造，有助于加速高效酵母細(xì)胞工廠的開發(fā)［64］?；贑RISPR-Cas9基因編輯主要針對圓紅冬孢酵母R.toruloides展開，膠紅酵母和黏紅酵母等其他紅酵母的相關(guān)研究較少，未來有待開發(fā)多種紅酵母的高效基因組編輯工具。

啟動子優(yōu)化對基因編輯系統(tǒng)效率較為重要。研究證明，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)用融合5S rRNA-tRNA的啟動子表達(dá)引導(dǎo)RNA（gRNA）能夠?qū).toruloides基因進(jìn)行高效敲除，利用這種方法還進(jìn)行了雙基因的高效敲除［65］。通過整合在GAP啟動子下表達(dá)Cas9和在S.cerevisiaeSNR52啟動子下表達(dá)gRNA的盒，使用基于CRISPR-Cas9的基因阻斷成功對R.toruloides內(nèi)源URA3基因進(jìn)行了定向破壞，并應(yīng)用優(yōu)化的設(shè)計條件破壞了另一個參與類胡蘿卜素生物合成的內(nèi)源基因CAR2，最后在一次轉(zhuǎn)化中實現(xiàn)同時破壞CAR2和URA3基因［66］。

另一個較成功的例子將含有密碼子優(yōu)化的Cas9基因的表達(dá)盒整合到R.toruloides基因組中，產(chǎn)生了具有足夠產(chǎn)量的金黃色葡萄球菌來源的Cas9蛋白的菌株。同時，確定了兩個U6基因，預(yù)測了兩個U6啟動子，并確認(rèn)用U6b啟動子更好地轉(zhuǎn)錄單向?qū)颮NA（sgRNA）。接著設(shè)計了針對CRT1、CAR2和CLYBL基因的sgRNA盒，轉(zhuǎn)化到Cas9表達(dá)的菌株中，發(fā)現(xiàn)超過60%的轉(zhuǎn)化子成功發(fā)生了插入和刪除突變［67］。

和模式酵母釀酒酵母相比，紅酵母和其他非常規(guī)酵母的遺傳轉(zhuǎn)化效率還有待進(jìn)一步提高，未來隨著高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，紅酵母菌株的代謝工程改造效率也將大幅度提高。

3 紅酵母的代謝工程研究

紅酵母在最近的綜述中都作為一種比較有價值的非常規(guī)酵母被討論，具有許多工業(yè)生產(chǎn)相關(guān)的生理代謝優(yōu)勢和特性，吸引研究人員通過各種代謝工程策略從底物利用、前體供應(yīng)、合成途徑等多方面來提高其代謝性能［68-69］，將其改造成為高效生產(chǎn)各種化學(xué)產(chǎn)品的細(xì)胞工廠。下面對近5年關(guān)鍵的紅酵母代謝工程進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。

3.1 利用紅酵母的代謝工程改造生產(chǎn)天然產(chǎn)物和中間體

近年來利用多種非常規(guī)酵母生產(chǎn)植物來源天然產(chǎn)物及其他異源產(chǎn)物引起了國內(nèi)外研究者的關(guān)注，以下為代表性的案例。

三乙酸內(nèi)酯（triacetic acid lactone, TAL）可用于生產(chǎn)多種具有商業(yè)價值的化學(xué)中間體，如間苯三酚、乙酰丙酮和山梨酸。研究者將密碼子優(yōu)化過的來自非洲菊的2-吡喃酮合酶基因引入圓紅冬孢酵母中，并過表達(dá)可能的限制性前體物質(zhì)乙酰輔酶A相關(guān)的酶ACL1和ACC1，所獲得的重組菌株通過補充醋酸鹽的葡萄糖或甘蔗汁為底物進(jìn)行發(fā)酵，TAL產(chǎn)量達(dá)到28 g/L和23 g/L，體積生產(chǎn)強度顯著高于前期報道的利用解脂耶氏酵母的水平，這項研究也為利用圓紅冬孢酵母生產(chǎn)聚酮或其他乙酰輔酶A的衍生物提供了參考［70］。

白藜蘆醇（resveratrol）是來源于植物的具有多種生物活性的天然多酚類物質(zhì)，廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。研究者利用來自于擬南芥和美洲葡萄等植物的外源基因整合、外源和內(nèi)源P450酶融合，以及改善輔酶供應(yīng)等不同手段，首次實現(xiàn)了利用圓紅冬孢酵母生產(chǎn)白藜蘆醇［71］。

檸檬烯（limonene）為廣泛應(yīng)用于食品、藥物以及先進(jìn)生物燃料的單萜類化合物，由于紅酵母可以利用木糖等多種碳源，且可天然產(chǎn)生多萜類物質(zhì)類胡蘿卜素，提示該酵母具有比較強的天然甲羥戊酸（mevalonate, MVA）途徑碳流，因此推測紅酵母具有比較好的潛力生產(chǎn)萜類化合物。通過對外源基因和內(nèi)源基因的改造，研究者成功構(gòu)建出類胡蘿卜素生成缺陷的R.toruloides生產(chǎn)檸檬烯［72］，后續(xù)可通過進(jìn)一步強化前體供應(yīng)提高產(chǎn)量。

由于類胡蘿卜素和油脂等產(chǎn)物共用乙酰輔酶A和MVA途徑，因此推測破壞類胡蘿卜素合成有利于生產(chǎn)其他相關(guān)產(chǎn)物。篩選T-DNA隨機(jī)插入失活的R.mucilaginosaC2.5t1突變體發(fā)現(xiàn)，突變體W4在八氫番茄紅素去飽和酶基因CAR1內(nèi)部存在插入失活，該突變體輔酶Q10和 甾醇等產(chǎn)量明顯提高［73］，提示可通過降低競爭途徑的基因表達(dá)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

以上研究不僅為利用紅酵母生產(chǎn)多種異源天然活性產(chǎn)物提供了成功的范例，也為進(jìn)一步開發(fā)利用紅酵母細(xì)胞工廠進(jìn)行動植物來源活性物質(zhì)的可持續(xù)生產(chǎn)提供借鑒。

3.2 改造紅酵母促進(jìn)油脂及脂肪酸衍生物生產(chǎn)

多種紅酵母是較好的微生物油脂生產(chǎn)菌，但是天然菌株油脂生產(chǎn)的效率還有待提高，因此有必要通過代謝工程改造，進(jìn)一步提高油脂及脂肪酸衍生物的產(chǎn)量。

在圓紅冬孢酵母IFO0880菌株中，通過基因缺失和過表達(dá)使脂酰-CoA還原酶的脂肪醇濃度明顯提高，其中酰基轉(zhuǎn)移酶LRO1的刪除增加了脂質(zhì)和脂肪醇的生產(chǎn)，為研究脂質(zhì)代謝創(chuàng)造了可能的途徑［74］。在NaOH催化下，R.toruloides細(xì)胞中的脂質(zhì)可直接轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯（FAMEs），這種方法簡單便捷，且具有更高的生物柴油轉(zhuǎn)化率［75］。通過引入不同來源的蠟酯合酶基因，構(gòu)建了R.toruloides的脂肪酸乙酯（FAEE）生物合成途徑，并表達(dá)了來自不動桿菌（Acinetobacter baylyi）的雙功能蠟酯合酶/?；?CoA-二酰甘油轉(zhuǎn)移酶（WS/DGAT）基因，培養(yǎng)生產(chǎn)了826 mg/L的FAEE，進(jìn)一步對雙功能酶進(jìn)行突變，消除DGAT活性，將濃度提高到了1.02 g/L［76］。最終通過將菌株Δku70-AbWS*在反應(yīng)器進(jìn)行批式和補料培養(yǎng)，最高達(dá)到9.97 g/L FAEEs產(chǎn)量，而且絕大部分產(chǎn)物分泌到胞外，可顯著降低下游處理破碎細(xì)胞的成本。在R.toruloides菌株中操縱4個與三酰甘油（DAG）和二酰甘油（TAG）間相互轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因，以促進(jìn)DAG和游離脂肪酸（FFA）的產(chǎn)生。其中，3個與TAG合成相關(guān)的基因DGA1、LRO1和AREA1通過RNA干擾技術(shù)被連續(xù)下調(diào)，一個由TGL5編碼的內(nèi)源性TAG脂肪酶與LDP1融合并過度表達(dá)，將TAG轉(zhuǎn)化為DAG和FFA。當(dāng)在氮限制的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，DAG和FFA的含量分別提高了2倍和3倍［77］。另外，還有研究采用過表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶（ACC1羧化酶）基因和抑制3-羥基3-甲基戊二酰還原酶（HMG-CoA還原酶）的雙重策略來提高R.mucilaginosa的脂質(zhì)生產(chǎn)［78］。

3.3 利用紅酵母代謝工程改造促進(jìn)類胡蘿卜素生產(chǎn)

利用紅酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素長久以來一直受到研究者的關(guān)注。隨著紅酵母的遺傳改造系統(tǒng)不斷成熟，利用重組菌株高效生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究也不斷被報道。

改善類胡蘿卜素合成的代謝工程，可通過過量表達(dá)內(nèi)源生物合成途徑中的基因、刪除競爭途徑中的基因，及異源表達(dá)外來基因超量生產(chǎn)目標(biāo)化合物來實現(xiàn)。例如，通過使用強啟動子和終止子過量表達(dá)來自X.dendrorhous的CRTE、CRTYB和CRTII，將代謝流更多導(dǎo)向β-胡蘿卜素，結(jié)合培養(yǎng)基優(yōu)化，工程菌株R.glutinisP4-10-9-63Y-14B產(chǎn)生27.13 mg/g細(xì)胞干重的β-胡蘿卜素，比野生型菌株提高了129倍［63］。此外，研究通過篩選、組合不同來源的催化元件，調(diào)節(jié)模塊表達(dá)水平等手段，提高了類胡蘿卜素合成通量、降低了代謝中間體積累，達(dá)到構(gòu)建類胡蘿卜素合成細(xì)胞工廠的目的［79］。代謝工程改造策略也可以與隨機(jī)誘變結(jié)合，得到高產(chǎn)類胡蘿卜素的紅酵母菌株［65］。

由于不同種酵母存在差異，在進(jìn)行改造時也需要將一些環(huán)境適應(yīng)性問題考慮在內(nèi)，如逆境壓力適應(yīng)機(jī)制、潛在的代謝能力和靈活性等［80］，得到更好的效果。

總之，通過對紅酵母進(jìn)行代謝工程改造能得到高產(chǎn)的菌株，其產(chǎn)生的代謝物不僅綠色環(huán)保，還具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值，是生物燃料和其他高值商品的替代來源，在未來具有廣闊的應(yīng)用前景。表3為紅酵母代謝工程改造的成功案例。

表3 對紅酵母代謝工程改造總結(jié)Table 3 Summary of metabolic engineering modification of red yeast

4 存在的問題及未來發(fā)展趨勢

紅酵母的研究已引起了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的興趣，生理學(xué)研究揭示了其具有優(yōu)良特性，如高細(xì)胞密度和代謝不同碳源、氮源的能力，可利用這些特性轉(zhuǎn)化低成本的原料生產(chǎn)高價值的代謝產(chǎn)物，如油脂、類胡蘿卜素、酶等［82］。目前紅酵母相關(guān)研究存在的問題如下。

首先，紅酵母最大的問題在于精準(zhǔn)編輯（包括精準(zhǔn)基因整合和無痕敲除）的效率比較低。最新的報道中研究人員開發(fā)了新的基于CRISPR的基因編輯平臺，命名為Lowered Indel Nuclease system Enabling Accurate Repair（LINEAR），實現(xiàn)了畢赤酵母、解脂耶氏酵母、馬克斯克魯維酵母和多型漢遜酵母等不同非常規(guī)酵母的高效改造。與傳統(tǒng)的方法相比，該系統(tǒng)可以實現(xiàn)高達(dá)67%-100%的同源重組效率［83］。我國學(xué)者在畢赤酵母中強化了同源重組效率發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)同源重組相關(guān)的關(guān)鍵基因RAD52和敲除MPH1可有效提升同源重組效率［84］。另一工作構(gòu)建和優(yōu)化了基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)，通過優(yōu)化Cas9蛋白和sgRNA，動態(tài)調(diào)控非同源末端連接關(guān)鍵基因KU80和增強表達(dá)同源重組修復(fù)蛋白等手段，有效提高同源重組效率，依托該系統(tǒng)成功在多形漢遜酵母（O.polymorpha）中實現(xiàn)基因無痕敲除、大片段整合以及多片段重組［85］。以上技術(shù)未來也有望在紅酵母中得到應(yīng)用，提高紅酵母精準(zhǔn)基因編輯的效率。

其次，與其他非常規(guī)酵母相比，紅酵母的基因組水平的研究還相對較少，很多基因的功能未知，缺乏關(guān)于代謝網(wǎng)絡(luò)相互作用和代謝平衡調(diào)控與應(yīng)答等基礎(chǔ)信息。此外，基于關(guān)鍵酶進(jìn)行定向進(jìn)化及理性設(shè)計以提高關(guān)鍵酶催化活性的策略應(yīng)用也較少，這阻礙了紅酵母關(guān)鍵途徑催化效率的最大化提升。未來在建立高效紅酵母基因組編輯技術(shù)的基礎(chǔ)上，相關(guān)的代謝途徑和分子調(diào)控機(jī)制也將快速深入，有希望能進(jìn)一步提高利用紅酵母生產(chǎn)多種活性物質(zhì)的效率。

最后，在紅酵母的工業(yè)應(yīng)用方面還受到成本問題的限制，要實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)需考慮工藝優(yōu)化和放大策略，整合和加強上、下游工藝，構(gòu)建多功能的微生物細(xì)胞工廠，提高產(chǎn)量和效率。此外，利用廉價的來源豐富的可再生生物質(zhì)資源，包括木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)和廚余廢棄物等，可實現(xiàn)變廢為寶和可持續(xù)生產(chǎn)。但是，這些天然底物可能存在毒性的抑制物，比如酚類抑制物等，可通過研究紅酵母對這些抑制物的耐受性和生物轉(zhuǎn)化，提高其實際應(yīng)用的效率［86］。

隨著下一代測序技術(shù)的發(fā)展、基因組編輯工具的完善和全系統(tǒng)組學(xué)研究的發(fā)展，國內(nèi)外研究者對非常規(guī)酵母獨特代謝和生理特征的理解逐步加深［87］，紅酵母的相關(guān)研究也在不斷完善。未來預(yù)計相關(guān)研究的不斷深入，將更有助于在生理學(xué)和生物學(xué)方面對紅酵母的理解，從而更好地利用紅酵母資源，提高生物煉制效率。