• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    單核細胞增生李斯特菌LMXJ15全基因組測序及分析

    2023-08-15 08:30:08杜冬冬錢晶李思琪劉雯菲魏向利劉長勇羅瑞峰康立超
    生物技術通報 2023年7期
    關鍵詞:李斯特單核細胞血清型

    杜冬冬 錢晶 李思琪 劉雯菲 魏向利 劉長勇 羅瑞峰 康立超

    (新疆農墾科學院分析測試中心 新疆生產建設兵團食品檢驗所, 石河子 832000)

    單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種人獸共患食源性致病菌,在自然環(huán)境廣泛存在,對多種惡劣環(huán)境有較強的耐受力,并且能通過多種途徑抵御食品加工過程的極端環(huán)境,從而在食品中存活[1]。研究顯示食用被LM污染的食物可導致患李斯特菌病,其臨床癥狀包括發(fā)熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產和死胎等,孕婦、新生兒、老人和免疫功能低下的人為主要易感人群,病死率高達30%[2]。據研究統(tǒng)計,在發(fā)達國家有多次李斯特菌病暴發(fā)的報道。2011年,在美國28個州發(fā)生了由于食用被LM污染的香瓜而導致147人感染發(fā)生李斯特菌病暴發(fā)疫情,30人死亡[3]。在2018南非爆發(fā)了一次最嚴重李斯特菌病疫情,導致1 000多人患病,216人死亡[4]。我國LM感染引發(fā)的暴發(fā)事件和臨床病例報道較少,但LM在食品中的污染情況普遍存在,例如2010-2014年間遼寧省14個城市的食品中LM的檢出率為1.87%[5];2016-2019年重慶市39個區(qū)縣的即食食品中檢出率為1.77%[6]。同時隨著抗生素的濫用,使得LM對抗生素耐藥性水平逐漸提高,導致LM的預防治療愈加復雜困難,對人們的健康產生嚴重的威脅[7]。

    隨著測序技術迅速發(fā)展,大量的LM菌株完成基因組測序,為研究LM提供了參考信息。全基因組測序不僅有利于了解菌株遺傳背景和生理特性,以及基因組結構變化,進化關系和基因功能等[8],而且也能通過分析基因組中的毒力基因來預測菌株的潛在致病性。多位點序列分型(mutilocus sequence typing, MLST)是通過對細菌的多個管家基因(abcZ,bglA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA)測序后,分析不同等位基因間的差異從而確定菌株間的相關性和進化關系[9-10]。

    目前關于新疆地區(qū)食源性LM的基因組研究報道較少,本研究對一株新疆某地區(qū)分離的食源性LM進行了全基因組測序,分析了其攜帶的毒力基因,并與其它地區(qū)和國家來源菌株進行了親緣關系的比較,為研究本地區(qū)的LM分子特征提供了參考信息。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 單核細胞增生李斯特菌LMXJ15菌株由新疆農墾科學院分析測試中心微生物鑒定室從新疆某地的調理肉制品中分離鑒定并保存。

    1.1.2 主要試劑和儀器 腦心浸出液肉湯(brain heart infusion broth,BHI),北京路橋有限公司;單核細胞增生李斯特菌診斷血清,日本DENKS SEIKEN公司;細菌基因組DNA快速提取試劑盒,北京博邁德生物技術有限公司;臺式高速冷凍離心機,Sigma公司。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組測序和拼接 將LMXJ15菌株劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基,37℃過夜培養(yǎng)進行活化,挑取單菌落接種于10 mL BHI液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h。按照DNA提取試劑盒說明書提取LMXJ15菌株的基因組DNA,并通過瓊脂糖電泳和核酸蛋白測定儀(SMARTSPEC PIUS,美國BIO-RAD)檢測,確保提取基因組的質量和濃度。提取的LMXJ15菌株DNA由生工生物工程(上海)股份有限公司采用PacBio和Illumina HiSeq測序平臺進行全基因組測序和拼接組裝。

    1.2.2 基因預測與注釋 采用Glimmer 3.02軟件進行開放閱讀框(open reading frame,ORF)預測,Prokka對組裝結果進行基因元件預測,CRISPR預測采用CRT,將所有預測蛋白序列與Gene Ontology(GO)數(shù)據庫比對,完成蛋白序列的功能注釋。

    1.2.3 血清型鑒定 利用單核細胞增生李斯特菌血清型鑒定試劑盒的方法測定分離株LM的O和H抗原,并結合參照Doumith等[11]的多重PCR方法中的引物序列與基因組序列匹配方法確定LM血清型。

    1.2.4 毒力基因預測及分析 通過VirulenceFinder-2.0 Server(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)分析LMXJ15菌株的毒力基因攜帶情況。

    1.2.5 MLST分析 對LMXJ15菌株的基因組序列與其它從 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)網站下載的72株LM全基因組序列通過https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/進行分析,確定單核細胞增生李斯特菌的7個管家基因(abcZ,bglA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA)的等位基因號和ST型別及CC復合克隆系。

    2 結果

    2.1 LMXJ15菌株的基因組特征

    采用PacBio和Illumina HiSeq測序平臺獲得LMXJ15菌株的完成圖?;蚪M序列總長度(genome size)為3 017 732 bp,平均GC含量為37.81%?;蝾A測分析,獲得編碼基因(CDS No)3 154個,編碼57個tRNA、6個rRNA,編碼基因總長度為2 734 315 bp,平均長度為866.94 bp。

    2.2 CRISPR預測結果

    CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences)是一類獨特的DNA正向重復序列家族,通常由長度為25-48的重復序列以及單一序列間隔組成[12-13]。CRISPR的作用機制類似于真核生物的RNAi,即利用間隔區(qū)識別并沉默外源的遺傳物質。CRISPR/Cas系統(tǒng)為細菌抵抗外來基因片段的自身免疫系統(tǒng),對LM的致病性、耐藥性及新陳代謝具有重要作用[14]。LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列,位于染色體上的270 451-270 928 bp位置,長度為478 bp(表1),提示LMXJ15菌株可能通過CRISPR途徑提供相應的獲得性免疫,來對抗侵略細菌的外源DNA、質粒和噬菌體,提高在自然環(huán)境中的適應性。

    表1 LMXJ15菌株的CRISPR序列Table 1 CRISPR sequences of strain LMXJ15

    2.3 GO注釋結果

    GO注釋結果(圖1)顯示,LMXJ15基因組中有2 241個基因得到了功能注釋,占所有編碼基因的75.03%,包括細胞組成(cellular component,CC)、生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)三大類(圖2)。在BP這一層面得到22種功能注釋,其中和代謝有關基因數(shù)量、與細胞過程相關基因最多。在CC層面得到17種功能注釋,其中細胞膜和細胞膜組分功能相關的基因最多。在MF層面得到12 種功能注釋,其中與催化活性和細胞附著有關的基因最多。

    圖1 CRISPR重復片段的SeqLogo圖Fig.1 SeqLogo plot of CRISPR repeats

    圖2 LMXJ15菌株基因的GO功能分類Fig.2 GO functional classification of genes of strain LMXJ15

    2.4 血清鑒定結果

    血清型是細菌分型中非常重要的意義,往往和細菌的毒力、宿主特異性疫苗是否有保護性相關[15]。本研究利用鑒定LM的O和H抗原、對已獲得的基因組序列和血清分型相關基因及特異性引物進行匹配,鑒定LMXJ15菌株為1/2a血清型。

    2.5 毒力基因預測

    通過VirulenceFinder-2.0 Server的毒力基因預測顯示,LMXJ15菌株攜帶88個毒力相關基因,其中與表達調控相關的基因10個,與耐受環(huán)境壓力相關的基因21個,與逃避宿主免疫系統(tǒng)作用相關的毒力基因18個,與侵襲和黏附相關的毒力基因26個,與生存和增殖相關的毒力基因12個,其他相關毒力相關基因2個(表2)。

    表2 LMXJ15菌株基因組上的致病相關基因Table 2 Pathogenicity-related genes on the genome of strain LMXJ15

    2.6 MLST分析結果與基因組共線性分析

    對72株單核細胞增生李斯特菌分型結果顯示如表3,通過7個保守基因序列進行分子進化樹構建(圖3),結果顯示72株菌分成3個不同的分支,并呈現(xiàn)譜系聚類,譜系I和譜系II分別含有25和28個進化分支,譜系III含有4個進化分支,顯示菌株進化關系與血清型有較為直接的關系。譜系I中主要以4b血清型菌株最多,譜系II中主要為1/2a血清型菌株。LMXJ15序列型為ST8屬于CC8復合克隆系,與意大利分離株IZSAM_Lm_15_17439_A144、瑞士分離株LmN1546和一株從熏鮭魚分離菌株R479a在同一個進化分支上,親緣關系較近,具有相同的ST型和血清型(1/2a)。采用Mauve 軟件對4株菌株進行共線性分析,結果如圖4所示,菌株間基因組的相似度較高,含有9個較大的本地共線性模塊(locally colinear blocks, LCB),但是它們所在的區(qū)域以及排列順序有一定的差異。

    圖3 72株單核細胞增生李斯特菌基于MLST管家基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of 72 Listeria monocytogenes strains based on the housekeeping gene sequences of MLST

    圖4 全基因組共線性分析Fig.4 Whole genome alignment analysis

    表3 72株單核細胞增生李斯特菌MLST分型結果Table 3 MSLT typing results of 72 strains of Listeria monocytogenes

    3 討論

    LM是一種人畜共患病病原菌,具有分布廣、耐受力強和致病力高等特征,通過污染食品來傳播疾病,孕婦、新生兒及免疫力低下的成人為主要易感人群,感染后將引起敗血癥、腦膜炎、孕婦流產及新生兒死亡,病死率高達30%,因此被WHO列為四大食源性致病菌之一[16-17]。近幾年,全國各地大量食品污染監(jiān)測數(shù)據表明,LM在各類食品中存在不同程度的污染,其風險不容忽視[18-20]。但由于中國居民飲食習慣的差異以及對食源性致病菌監(jiān)控體系建立起步較晚,目前對該致病菌的監(jiān)測數(shù)據少,分離株數(shù)量少,大量的研究工作仍然停留在污染監(jiān)測上,同樣在新疆地區(qū)也是如此,對于LM分子遺傳特征闡述與分析的數(shù)據量低,數(shù)據的缺失,使得防控出現(xiàn)空白。因此闡明LM的血清型、分子分型、基因組功能特性和毒力基因攜帶情況,對LM的預防與控制具有重要的意義。

    本研究通過PacBio和Illumina HiSeq測序平臺完成了1株分離自調理肉制品的單核細胞增生李斯特菌LMXJ15的全基因組測序,基因總長度為3 017 732 bp,GC含量為37.81%,預測到3 154個編碼基因,其中編碼基因總長度為2 734 315 bp,平均長度為866.94 bp,基因中包含6 個rRNA操縱子和57個tRNA。通過CRISPR預測,LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列,位于染色體上的270 451-270 928 bp位置,長度為478 bp,說明菌株LMXJ15可能通過CRISPR途徑提供相應的獲得性免疫,提高在環(huán)境中適應能力。

    通過血清型分析LMXJ15為1/2b型,對LMXJ15與臨床、食品、動物、環(huán)境相關的LM(NCBI上公布)進行MLST比較分析并構建進化樹,發(fā)現(xiàn)72株菌株主要屬于CC6、CC7、CC8、CC9復合克隆系,同時呈現(xiàn)譜系聚類。LMXJ15序列型為ST8屬于CC8復合克隆系,屬于譜系II,與意大利IZSAM_Lm_15_17439_A144臨床分離株[21]、瑞士LmN1546臨床分離株[22]和一株從熏鮭魚中分離的R479a菌株[23]具有相同ST型血清型(1/2a),并在同一個進化分支上,對這4株LM的基因組共線分析結果顯示高度相似,其毒力因子的數(shù)目也相同,這與梁慧賢等[24]的研究結果相類似,毒力基因的分布與遺傳進化表現(xiàn)出一定的相關性。

    LM成功入侵宿主細胞中存活、增殖需要多種毒力因子在不同感染階段發(fā)揮作用[25],對LMXJ15毒力分析顯示,不僅具有hpt、pycA、fri、relA、oppA、lplA1、prsA2、chiA、dal、fur、pgl、stp等毒力因子來提高在各種環(huán)境中的生存能力,還有促進LM入侵宿主上皮細胞且在感染動物的毒性表型中具有重要作用的inlA、inlB、inlF、inlH、inlJ、lap等毒力因子,以及在自噬識別逃逸中發(fā)揮重要作用的hly、plcA、plcB、mpl等毒力因子,這些表明LMXJ15菌株具有較強的毒力,有感染人患病的風險。

    4 結論

    LMXJ15基因組大小為3 017 732 bp,包含3 154個基因,其中GO中注釋有2 241個基因;通過CRISPR預測LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列;MLST比較分析LMXJ15屬于CC8復合克隆系ST8型,與人源臨床分離株親緣關系較近、基因組高度相似性,并且攜帶有多種毒力因子。本研究豐富了單核細胞增生李斯特菌的基因組數(shù)據庫,為新疆地區(qū)單核細胞增生李斯特菌的研究提供了參考數(shù)據。

    猜你喜歡
    李斯特單核細胞血清型
    我請鴿子來吃飯
    幼兒園(2019年7期)2019-09-05 17:49:18
    通遼地區(qū)牛肉與牛肉制品沙門氏菌血清型調查
    食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:44
    廣東地區(qū)水禽大腸桿菌血清型鑒定
    單核細胞18F-FDG標記與蛛網膜下腔示蹤研究
    肺炎鏈球菌血清型鑒定的分子生物學檢測方法
    類風濕性關節(jié)炎患者外周血單核細胞TLR2的表達及意義
    保持肅靜
    小小說月刊(2013年6期)2013-05-14 14:55:19
    單核細胞增生李斯特氏菌拮抗菌的分離鑒定及其抑菌活性
    食品科學(2013年15期)2013-03-11 18:25:40
    多重PCR檢測肺炎鏈球菌血清型方法及臨床應用*
    單核細胞的成熟/分化有利于跨越血腦屏障和被艾滋病毒感染
    日韩一本色道免费dvd| 久久久久精品性色| 国产成人福利小说| 亚洲精品乱久久久久久| 国产一区二区三区av在线| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲av二区三区四区| 国产亚洲精品av在线| 特级一级黄色大片| 丝袜喷水一区| 久久久久久久国产电影| 国产黄色视频一区二区在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 舔av片在线| 国产精品三级大全| 国产精品一及| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品国产三级专区第一集| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 免费观看无遮挡的男女| 深爱激情五月婷婷| 激情五月婷婷亚洲| 免费av毛片视频| 欧美bdsm另类| 精品人妻视频免费看| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品不卡国产一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产探花极品一区二区| 国产在线男女| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产淫语在线视频| 免费黄网站久久成人精品| 久久精品久久久久久久性| 午夜老司机福利剧场| 搡老妇女老女人老熟妇| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲av.av天堂| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品人妻视频免费看| 国产极品天堂在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 在线天堂最新版资源| av.在线天堂| 国产免费福利视频在线观看| 国产av码专区亚洲av| 欧美区成人在线视频| 亚洲成人av在线免费| 成人亚洲精品一区在线观看 | av国产免费在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧美精品专区久久| 男女边摸边吃奶| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲av中文av极速乱| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品av视频在线免费观看| 婷婷色综合大香蕉| 日本午夜av视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品人妻视频免费看| 日本与韩国留学比较| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲精品自拍成人| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| h日本视频在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 免费看光身美女| 岛国毛片在线播放| 色综合色国产| 亚洲欧美日韩东京热| 白带黄色成豆腐渣| 欧美日韩综合久久久久久| 插逼视频在线观看| 欧美日韩综合久久久久久| 色网站视频免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品一区二区三区人妻视频| 欧美日韩综合久久久久久| av天堂中文字幕网| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产一级毛片七仙女欲春2| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲av免费高清在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲国产色片| 精品一区二区三区视频在线| 国产乱来视频区| 亚洲人成网站在线播| 丝袜喷水一区| 亚洲无线观看免费| 亚洲av二区三区四区| 久久久久久久久久人人人人人人| 九九在线视频观看精品| 成年女人看的毛片在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲三级黄色毛片| 免费看不卡的av| 久久久久国产网址| 全区人妻精品视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久精品国产自在天天线| 亚洲18禁久久av| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲最大成人手机在线| 久久精品久久久久久久性| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日本色播在线视频| 国产 亚洲一区二区三区 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久久国产一区二区| av在线播放精品| 毛片女人毛片| 免费看av在线观看网站| 国产色爽女视频免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 大陆偷拍与自拍| 免费看a级黄色片| 七月丁香在线播放| 一级毛片电影观看| 男女视频在线观看网站免费| av女优亚洲男人天堂| 亚洲av不卡在线观看| 午夜免费观看性视频| 特级一级黄色大片| 国产有黄有色有爽视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | av福利片在线观看| 午夜日本视频在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 麻豆国产97在线/欧美| 天天躁日日操中文字幕| 国产中年淑女户外野战色| 如何舔出高潮| 日韩电影二区| 少妇高潮的动态图| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品一及| 91久久精品国产一区二区成人| 国产麻豆成人av免费视频| 免费黄网站久久成人精品| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲色图av天堂| 久久精品人妻少妇| 久久久成人免费电影| 欧美性感艳星| 久久久久精品性色| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品一区二区三卡| 网址你懂的国产日韩在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲av免费在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| a级毛色黄片| 真实男女啪啪啪动态图| 女人久久www免费人成看片| 午夜日本视频在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国精品久久久久久国模美| 精品一区二区三区视频在线| 成人亚洲精品av一区二区| 看黄色毛片网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 黄片无遮挡物在线观看| 欧美精品国产亚洲| 视频中文字幕在线观看| 国产美女午夜福利| 男女那种视频在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日韩一本色道免费dvd| av免费在线看不卡| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩亚洲欧美综合| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美人与善性xxx| 亚洲真实伦在线观看| 男女国产视频网站| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 大香蕉久久网| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品嫩草影院av在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲色图av天堂| 免费观看无遮挡的男女| 97热精品久久久久久| 国产精品蜜桃在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩欧美 国产精品| 国产精品久久久久久精品电影| 精品一区在线观看国产| 大香蕉97超碰在线| 精品久久久久久久久久久久久| 国产毛片a区久久久久| av在线观看视频网站免费| 男女国产视频网站| av女优亚洲男人天堂| 亚洲天堂国产精品一区在线| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产高清国产精品国产三级 | 国产淫语在线视频| 三级国产精品片| 日本三级黄在线观看| 日韩国内少妇激情av| 男女边摸边吃奶| 国产成人精品婷婷| 在线 av 中文字幕| 国产成人a区在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 最新中文字幕久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 三级国产精品欧美在线观看| 七月丁香在线播放| 六月丁香七月| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久久国产网址| 亚洲精品日韩av片在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲精品第二区| 成人欧美大片| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩欧美三级三区| videossex国产| 九九爱精品视频在线观看| 黄色日韩在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 最近中文字幕高清免费大全6| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲在线自拍视频| 精品熟女少妇av免费看| 亚州av有码| 国产精品熟女久久久久浪| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日本免费在线观看一区| 最近最新中文字幕免费大全7| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 高清毛片免费看| 成年版毛片免费区| 最新中文字幕久久久久| 欧美激情在线99| 亚洲av在线观看美女高潮| 大陆偷拍与自拍| av免费在线看不卡| 婷婷色综合www| 丝袜喷水一区| 欧美区成人在线视频| 高清日韩中文字幕在线| 国模一区二区三区四区视频| 久久久久久久久久久丰满| 久久久久国产网址| 少妇丰满av| 在线观看免费高清a一片| 婷婷色av中文字幕| 欧美人与善性xxx| 日韩欧美精品v在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费看av在线观看网站| 欧美高清成人免费视频www| freevideosex欧美| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品第二区| kizo精华| 午夜日本视频在线| or卡值多少钱| 成年人午夜在线观看视频 | 欧美三级亚洲精品| 日韩三级伦理在线观看| 99久国产av精品国产电影| 可以在线观看毛片的网站| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 一本一本综合久久| 成人欧美大片| 亚洲精品视频女| 综合色av麻豆| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲性久久影院| 美女大奶头视频| 免费大片18禁| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 十八禁网站网址无遮挡 | 嫩草影院精品99| 秋霞在线观看毛片| 欧美日本视频| 精华霜和精华液先用哪个| 好男人视频免费观看在线| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲经典国产精华液单| 免费av毛片视频| 简卡轻食公司| 久久久欧美国产精品| 国产精品无大码| 毛片一级片免费看久久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲国产欧美在线一区| 久久精品夜色国产| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 好男人视频免费观看在线| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品自拍成人| 亚洲国产欧美在线一区| 日本欧美国产在线视频| 成人欧美大片| 亚洲真实伦在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲色图av天堂| 国产成人91sexporn| 春色校园在线视频观看| 国产 一区 欧美 日韩| 边亲边吃奶的免费视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 人妻系列 视频| 97在线视频观看| 成人av在线播放网站| 精品一区二区三卡| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 观看美女的网站| 高清在线视频一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 日韩av免费高清视频| 五月天丁香电影| 秋霞伦理黄片| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲综合精品二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品人妻视频免费看| 国产av国产精品国产| 高清在线视频一区二区三区| 精品熟女少妇av免费看| 欧美另类一区| 超碰97精品在线观看| 波野结衣二区三区在线| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品第二区| 三级经典国产精品| 精品午夜福利在线看| 99热6这里只有精品| 看免费成人av毛片| 亚洲国产精品专区欧美| 久久久色成人| 久久久欧美国产精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 春色校园在线视频观看| 人人妻人人看人人澡| 男女下面进入的视频免费午夜| 日本一二三区视频观看| 日韩成人伦理影院| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费少妇av软件| 婷婷色麻豆天堂久久| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲人成网站高清观看| 午夜日本视频在线| 亚洲国产精品成人综合色| 日本一本二区三区精品| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 丝袜美腿在线中文| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产三级在线视频| 久久久久九九精品影院| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲国产精品专区欧美| 水蜜桃什么品种好| av福利片在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 久久草成人影院| 亚洲av日韩在线播放| 两个人视频免费观看高清| 国产色婷婷99| 精华霜和精华液先用哪个| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久精品夜色国产| 国产成人精品福利久久| 97超视频在线观看视频| 麻豆乱淫一区二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久久久国产a免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产综合精华液| av在线老鸭窝| 五月伊人婷婷丁香| 在线 av 中文字幕| 免费大片黄手机在线观看| 国产男人的电影天堂91| 国产一级毛片在线| 边亲边吃奶的免费视频| 六月丁香七月| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品1区2区在线观看.| 嫩草影院精品99| 天堂网av新在线| 在线观看一区二区三区| 能在线免费观看的黄片| 久久久久久久久久久免费av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| av播播在线观看一区| 成人性生交大片免费视频hd| h日本视频在线播放| 天堂√8在线中文| 国产91av在线免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲国产精品成人综合色| 波多野结衣巨乳人妻| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美 日韩 精品 国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 人妻一区二区av| 一级片'在线观看视频| 亚洲人成网站在线播| 午夜福利在线在线| 亚洲精品日本国产第一区| 天天一区二区日本电影三级| 国产成人福利小说| 久久久久久久久久久丰满| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久色成人| 少妇高潮的动态图| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 18+在线观看网站| 国产精品一及| 婷婷色av中文字幕| 91久久精品电影网| 亚洲欧美清纯卡通| 黄色一级大片看看| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久精品免费免费高清| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 特大巨黑吊av在线直播| 婷婷色麻豆天堂久久| 大香蕉97超碰在线| 成年版毛片免费区| 国精品久久久久久国模美| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲欧美清纯卡通| 尾随美女入室| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品久久视频播放| 日韩在线高清观看一区二区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线免费观看的www视频| 大片免费播放器 马上看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久久久久久久久黄片| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 日日摸夜夜添夜夜爱| 人妻一区二区av| 少妇丰满av| 国产视频内射| 日韩精品青青久久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品1区2区在线观看.| 两个人视频免费观看高清| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 天堂√8在线中文| 高清在线视频一区二区三区| 国产一区二区在线观看日韩| 免费黄色在线免费观看| 国产永久视频网站| 日本欧美国产在线视频| 人体艺术视频欧美日本| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲性久久影院| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩电影二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产综合懂色| 国产成人免费观看mmmm| 免费黄网站久久成人精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜激情福利司机影院| 欧美三级亚洲精品| 一本久久精品| 欧美日韩综合久久久久久| 美女内射精品一级片tv| 大香蕉久久网| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 搞女人的毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美高清成人免费视频www| 精品一区在线观看国产| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 一级片'在线观看视频| 男女那种视频在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 99久久人妻综合| 国产精品久久久久久精品电影| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲伊人久久精品综合| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 草草在线视频免费看| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲欧洲国产日韩| 中文字幕亚洲精品专区| 少妇被粗大猛烈的视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩中字成人| 成人亚洲精品av一区二区| 精品久久久久久久久亚洲| 特大巨黑吊av在线直播| 在线观看一区二区三区| 午夜福利成人在线免费观看| 免费观看a级毛片全部| 91精品国产九色| 日本午夜av视频| 久久久久久久国产电影| 亚洲av成人精品一二三区| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| av黄色大香蕉| 美女黄网站色视频| 亚洲在线观看片| 亚洲精品色激情综合| 午夜精品一区二区三区免费看| 天堂√8在线中文| 99久久精品一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 97超碰精品成人国产| 我要看日韩黄色一级片| 特级一级黄色大片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产黄片美女视频| 一区二区三区免费毛片| 国产熟女欧美一区二区| 在现免费观看毛片| 一区二区三区高清视频在线| 免费黄色在线免费观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩中字成人| 国产在线一区二区三区精| 日韩大片免费观看网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 欧美zozozo另类| av天堂中文字幕网| 亚洲四区av| 久久精品人妻少妇| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品第二区| 国产一区二区三区av在线| 成年av动漫网址| 亚洲av男天堂| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国产精品女同一区二区软件| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产高清不卡午夜福利| 一区二区三区乱码不卡18| 三级国产精品欧美在线观看| 三级毛片av免费| 国产三级在线视频| 晚上一个人看的免费电影| 婷婷六月久久综合丁香| 老女人水多毛片| 麻豆国产97在线/欧美| kizo精华| 国产高清有码在线观看视频| 免费av不卡在线播放| 午夜福利视频1000在线观看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产一区二区在线观看日韩| 国产在线一区二区三区精| 五月玫瑰六月丁香| 赤兔流量卡办理| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av二区三区四区| 99久久精品国产国产毛片| 国产永久视频网站|