利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建MDH2敲除細(xì)胞株及抗嘔吐毒素效應(yīng)研究

施煒濤 姚春鵬 魏文康 王蕾 房元杰 仝鈺潔 馬曉姣 蔣文張曉愛 邵偉

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心 廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），屬于B型單端孢霉烯族毒素，作為一種廣泛存在于谷物和動(dòng)物飼料以及食品中的真菌毒素，可由禾谷鐮刀菌、亞洲鐮刀菌等多種鐮刀菌產(chǎn)生［1-2］。受到霉菌污染的玉米、小麥、大豆等飼料原料及青貯飼料中均存在不同濃度的DON［3-4］。在對(duì)陜西、新疆、甘肅和寧夏4省收獲的小麥進(jìn)行DON含量及流行率檢測(cè)，結(jié)果顯示82.9%的樣品受到DON污染，平均濃度達(dá)500 μg/kg，根據(jù)我國(guó)規(guī)定的DON標(biāo)準(zhǔn)（中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2761-2017），其中10%的陽(yáng)性樣品超過1 000 μg/kg的最大限值［1］。對(duì)多地的飼料及原料取樣監(jiān)測(cè)分析，其中玉米及其副產(chǎn)品均有不同程度的DON污染［5］。一份對(duì)豬飼料樣品的霉菌毒素含量檢測(cè)報(bào)告顯示，DON在不同品種豬飼料中含量普遍偏高，其中空懷母豬料和育肥料中DON含量高于國(guó)家規(guī)定［6］。

DON屬于劇毒或中等毒物的范疇，對(duì)人和動(dòng)物具有廣泛的毒性效應(yīng)，具體表現(xiàn)為嘔吐、炎癥、消化道出血，甚至死亡［7-8］。豬是對(duì)DON最敏感的動(dòng)物之一，其次為小鼠、大鼠、家禽和反芻動(dòng)物［9］。DON不僅對(duì)豬腸道具有局部毒性，而且會(huì)導(dǎo)致許多腸道功能失調(diào)并削弱免疫反應(yīng)，減少采食量和體重增加［10］。攝入含DON的飼料時(shí)，豬的腸道會(huì)出現(xiàn)絨毛頂端壞死、多灶性萎縮和絨毛融合、固有層水腫、腸細(xì)胞胞漿空泡化、十二指腸絨毛高度降低和腸道細(xì)胞溶解等情況［11］。而當(dāng)飼料中同時(shí)存在嘔吐毒素和其他霉菌毒素如鐮刀菌酸時(shí)，相互之間會(huì)產(chǎn)生協(xié)同和相加效應(yīng)，混合物整體的毒性增強(qiáng)，出現(xiàn)嘔吐、拒食、生長(zhǎng)緩慢等現(xiàn)象［12-16］。

近年來已報(bào)道多個(gè)與DON毒性有關(guān)的基因，王海飛等［16］利用CRISPR/Cas9敲除文庫(kù)篩選到THEM5等DON抗性重要候選基因。許寫等［17］通過構(gòu)建了穩(wěn)定干擾METTL3基因表達(dá)水平的IPEC-J2細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)降低該基因的表達(dá)水平可以抵抗由DON誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和炎癥。Xu等［18］研究報(bào)道SLC4A11和MFSD3基因的過表達(dá)能夠增強(qiáng)DON處理下IPEC-J2細(xì)胞的活力。

蘋果酸脫氫酶2（MDH2）是線粒體中三羧酸循環(huán)（TCA）的關(guān)鍵酶之一，利用催化H+從蘋果酸的羥基轉(zhuǎn)移至NAD+上，以實(shí)現(xiàn)蘋果酸和草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖的發(fā)生和氧化/還原平衡等代謝途徑也發(fā)揮重要作用。MDH2以二聚體形式存在，單體分子量35.6 kD左右，包含5個(gè)NAD+結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)質(zhì)子結(jié)合位點(diǎn)［19］。已有研究報(bào)道MDH2與癌癥有密切聯(lián)系，MDH2能夠通過抑制PTEN增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［20］。刺激MDH2能夠激活A(yù)KT通路，從而導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的轉(zhuǎn)移和侵襲［21］。在前列腺癌細(xì)胞中也檢測(cè)到MDH2的表達(dá)升高［22］。此外，MDH2被確定為是嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤的易感基因［23］。但目前尚未報(bào)道MDH2和毒素之間的存在聯(lián)系。

前期我們利用CRISPR文庫(kù)篩選了嘔吐毒素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，MDH2是候選基因之一。但目前對(duì)于MDH2基因?qū)τ贒ON的影響在國(guó)內(nèi)外期刊中并沒有相關(guān)報(bào)道，因此本研究采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建豬MDH2基因穩(wěn)定敲除的IPEC-J2細(xì)胞株，并檢測(cè)了MDH2基因抗DON毒性效應(yīng)的影響，為后續(xù)深入探究MDH2基因?qū)ON的毒性作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。MDH2基因后續(xù)可以作為抗DON的靶標(biāo)，基因敲除或針對(duì)該靶標(biāo)開發(fā)相關(guān)藥物，可降低DON對(duì)腸道細(xì)胞的損傷以及對(duì)人和動(dòng)物的毒性，在醫(yī)療和畜牧業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

IPEC-J2細(xì)胞系由本研究室保存；嘔吐毒素和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司；pSpCas9-2A-Puro（PX459）V2.0質(zhì)粒購(gòu)自淼靈生物科技有限公司；P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Lonza公司；T4連接酶、T4 PNK、10×T4連接緩沖液、限制性核酸內(nèi)切酶BbsI購(gòu)自New England Biolabs公司；大腸桿菌E.coliDH 5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京金沙生物科技有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生物公司；胎牛血清FBS、胰酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、嘌呤霉素購(gòu)自Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自Procell公司；通用型RNA提取試劑盒購(gòu)自艾科瑞生物技術(shù)有限公司；一抗Anti-MDH2購(gòu)自HUABIO公司；Anti-Tubulin購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；二抗Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP和Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP購(gòu)自Affinity 公司；動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；CCK8（cell counting kit-8）試劑盒購(gòu)自Apexbio公司；YO-PRO-1/PI細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) DMEM/F12完全培養(yǎng)基包含10%FBS和1%雙抗，IPEC-J2細(xì)胞接種于25 cm2底面積培養(yǎng)瓶中，放在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 DON的配制 用DMSO將DON粉末溶解，用0.22 μm濾膜過濾，配成5 mg/mL母液。再分別用DMEM/F12完全培養(yǎng)基配成濃度分別為4、2、1和0.5 μg/mL的DON溶液，整個(gè)過程在生物安全柜中完成。

1.2.3 豬MDH2基因sgRNA的設(shè)計(jì) 針對(duì)豬源MDH2基因（NCBI Gene ID: 397039）使用CRISPR DESIGN（http://crispr.mit.edu）網(wǎng)站進(jìn)行設(shè)計(jì)，根據(jù)評(píng)分選取位于外顯子9126-9203區(qū)域的sgRNA。并在sgRNA的5'端添加CACCG，形成正向Oligo DNA（sgRNA-MDH2-F），在反向Oligo DNA（sgRNAMDH2-R）的3'端添加C，在5'端添加AAAC（表1）。

表1 MDH2靶向位點(diǎn)及sgRNA寡核苷酸序列Table 1 MDH2 targeting sites and sgRNA oligonucleotide sequences

1.2.4 豬MDH2基因編輯載體的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選 首先將以上正鏈Oligo DNA（sgRNAMDH2-F）和負(fù)鏈Oligo DNA（sgRNA-MDH2-R）退火形成dsDNA，反應(yīng)體系：正負(fù)鏈Oligo DNA各1 μL，10×T4 連接緩沖液1 μL，T4 PNK 0.5 μL，補(bǔ)H2O至10 μL，離心后置于PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行反應(yīng)（37℃ 30 min；95℃ 5 min）。取退火后形成的dsDNA與PX459載體連接，酶切與連接反應(yīng)體系：PX459質(zhì)粒模板25 ng，dsDNA和10×T4連接緩沖液各1 μL，BbsI和T4連接酶各0.5 μL，加入ddH2O補(bǔ)至10 μL體系，各成分離心后置于PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行反應(yīng)（37℃ 5 min；23℃ 5 min，25循環(huán)）。

放置連接產(chǎn)物和感受態(tài)細(xì)胞混合物于冰上30 min后42℃水浴熱擊90 s，經(jīng)過冰浴冷卻5 min后，加入普通的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃振蕩培養(yǎng)1 h，使細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒編碼的Amp抗性基因并恢復(fù)到正常生長(zhǎng)狀態(tài)；將菌液均勻涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)平板上，將培養(yǎng)皿倒置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。用含Amp的LB液體培養(yǎng)基對(duì)挑取的若干單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒送至生工使用U6啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 基因編輯載體的轉(zhuǎn)染及嘌呤霉素的篩選 用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)IPEC-J2細(xì)胞，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，用胰酶將細(xì)胞消化下來，使用Lonza電轉(zhuǎn)儀將上述構(gòu)建的基因編輯載體導(dǎo)入細(xì)胞核中。用濃度為4 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基連續(xù)篩選7 d，每2 d更換新鮮的含嘌呤霉素完全培養(yǎng)基，同時(shí)以IPEC-J2細(xì)胞作為對(duì)照組進(jìn)行觀察。待對(duì)照組完全死亡后用胰酶將存活的混合克隆細(xì)胞群消化下來，使用有限稀釋法稀釋成單克隆細(xì)胞于96孔板中。

1.2.6 單克隆細(xì)胞的篩選 待96孔板中的單克隆細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)至一定數(shù)量，轉(zhuǎn)移至24孔板中進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，再進(jìn)一步擴(kuò)大至6孔板中，提取細(xì)胞的基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行高保真PCR，將PCR產(chǎn)物送至生工進(jìn)行測(cè)序。引物序列請(qǐng)見表2。

表2 MDH2基因PCR測(cè)序引物Table 2 Primers for PCR sequencing of MDH2 gene

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中MDH2基因的表達(dá)水平 提取野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入到熒光定量PCR 96孔板之中，使用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s、57℃退火15 s、72℃延伸10 s并收集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)計(jì)5復(fù)孔，并以β-actin作為參照基因，用相對(duì)定量法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。引物序列請(qǐng)見表3。

表3 MDH2基因RT-qPCR引物Table 3 RT-qPCR primers for MDH2 gene

1.2.8 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中MDH2蛋白的表達(dá)水平 將野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞分別培養(yǎng)于六孔板中，等待長(zhǎng)滿全孔后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍后使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，冰上孵育10 min后離心取上清，加入上樣buffer，100℃煮樣10 min獲得蛋白樣品。對(duì)照組和試驗(yàn)組分別各取15 μg蛋白樣品通過10%的電泳膠進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉后，TBST洗去剩余奶粉，一抗Anti-MDH2（1∶1 000稀釋）于4℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次20 min。用1∶6 000稀釋的二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP與膜在室溫下孵育1 h，TBST洗膜4次，每次20 min。顯影液漂洗后用化學(xué)發(fā)光儀顯色拍照，以Tubulin為內(nèi)參蛋白。

1.2.9 MDH2-KO在DON處理后的細(xì)胞活力測(cè)定 將野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞以每孔2×104的密度接種96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)到合適密度，每孔加入不同DON濃度的完全培養(yǎng)基。每組加入等量100 μL含4、2、1、0.5和0 μg/mL DON濃度的完全培養(yǎng)基，每組濃度復(fù)5孔，充分混勻板中各孔的液體。第3天更換一次含不同濃度DON的完全培養(yǎng)基，并每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，在37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

用CCK8試劑測(cè)定細(xì)胞活力，在96孔板中選取5個(gè)無細(xì)胞孔，每孔加入100 μL DMEM/F12完全培養(yǎng)基，以獲得背景發(fā)光值。向96孔板中有液體的每個(gè)孔中加入10 μL CCK8試劑溶液，將96孔板置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm處的OD值。

細(xì)胞活力計(jì)算公式:

細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD-背景值OD）/（對(duì)照組OD-背景值OD）×100%

1.2.10 MDH2-KO在DON處理后細(xì)胞死亡率檢測(cè) 野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞接種于六孔板培養(yǎng)板中，置于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到合適密度，每孔更換為等量2 mL含4、2、1、0.5和0 μg/mL DON的完全培養(yǎng)基，第3天更換一次含不同DON濃度的完全培養(yǎng)基，共處理5 d。

將對(duì)照組和試驗(yàn)組貼壁細(xì)胞用15%胰酶消化后用完全培養(yǎng)液重懸，并用PBS洗滌一次。對(duì)于上一步驟的每個(gè)沉淀加入500 μL YP1/PI檢測(cè)工作液，并重懸為單細(xì)胞懸液。放入37℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。準(zhǔn)備僅含緩沖液的細(xì)胞樣品用作流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)的陰性對(duì)照，該緩沖液與配制YP1/PI檢測(cè)工作液的緩沖液宜保持一致。同時(shí)準(zhǔn)備YP1和PI的單染樣品用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。孵育完成后，可以直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)（YP1染色陽(yáng)性細(xì)胞為綠色熒光，Ex/Em=491/509 nm；PI染色陽(yáng)性細(xì)胞為紅色熒光，Ex/Em=535/617 nm），整個(gè)過程均需避光操作。將染色后的樣品置于冰上，并在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析。

2 結(jié)果

2.1 MDH2基因編輯載體的構(gòu)建

合成的sgRNA單鏈經(jīng)退火形成雙鏈，將其與PX459空載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶BsbI酶切后的線性載體片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。從載體U6啟動(dòng)子后開始測(cè)序，結(jié)果顯示插入PX459載體的堿基序列與設(shè)計(jì)的sgRNA序列完全一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，測(cè)序結(jié)果如圖1所示，命名為PX459-sgRNA-MDH2。

圖1 重組質(zhì)粒PX459-sgRNA-MDH2測(cè)序峰圖Fig.1 Sequencing peak of recombinant plasmid PX459-sgRNA-MDH2

2.2 MDH2-KO細(xì)胞株的構(gòu)建與驗(yàn)證

通過單克隆稀釋和擴(kuò)大培養(yǎng)，并挑選10株單克隆細(xì)胞提取基因組DNA，將通過高保真PCR所得產(chǎn)物送至公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示其中一株為單峰（圖2），且與野生型MDH2基因（圖3）相比缺失5 bp堿基（圖4），這種缺失突變可導(dǎo)致基因開放閱讀框改變、翻譯提前終止。與IPEC-J2野生型細(xì)胞株相比，該細(xì)胞株的mRNA表達(dá)水平顯著降低，且組內(nèi)mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。單克隆細(xì)胞蛋白樣品的Western blot鑒定結(jié)果見圖5-B，與野生型IPEC-J2細(xì)胞相比，篩選得到的細(xì)胞株中MDH2蛋白表達(dá)水平幾乎完全喪失。結(jié)合基因組PCR產(chǎn)物測(cè)序及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為該單克隆細(xì)胞系中目的基因被完全敲除且為單克隆，命名MDH2-KO。

圖2 MDH2-KO細(xì)胞系CRISPR靶位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.2 Sequencing peaks of CRISPR target sites in MDH2-KO cell line

圖3 MDH2野生型IPEC-J2細(xì)胞系CRISPR靶位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.3 Sequencing peaks of CRISPR target sites in MDH2 wild-type IPEC-J2 cell line

圖4 野生型IPEC-J2細(xì)胞與MDH2-KO序列比對(duì)圖Fig.4 Sequence comparison of wild-type IPEC-J2 cells with MDH2-KO

2.3 MDH2基因的敲除對(duì)IPEC-J2抗嘔吐毒素毒性效應(yīng)的影響

2.3.1 CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MDH2基因的敲除提高DON處理后的細(xì)胞活力 將野生型IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞系分別以每孔2×104的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，用嘔吐毒素（4、2、1和0.5 μg/mL）處理5 d后，用CCK8試劑測(cè)定細(xì)胞活力。發(fā)現(xiàn)MDH2-KO細(xì)胞系與野生型IPEC-J2細(xì)胞相比，在DON濃度為4、2、1和0.5 μg/mL的條件下細(xì)胞活力分別極顯著提高18.67%（***P＜ 0.001）、19.59%（***P＜ 0.001）、26.36%（***P＜ 0.001）和27.01%（***P＜ 0.001）（圖6）。表明敲除MDH2基因后可增強(qiáng)IPEC-J2細(xì)胞對(duì)嘔吐毒素的耐受性。

2.3.2 流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MDH2基因的敲除降低DON處理后的細(xì)胞死亡率 不同濃度DON對(duì)IPEC-J2細(xì)胞和MDH2-KO細(xì)胞的死亡率影響結(jié)果如圖7所示，經(jīng)過YP1/PI染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，正常活細(xì)胞為Q4區(qū)域（YP1-/PI-），凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染為綠色位于Q3區(qū)域（YP1+/PI-），壞死細(xì)胞的細(xì)胞核被染為紅色位于Q1和Q2區(qū)域（YP1-/PI+和YP1+/PI+）。與野生型細(xì)胞相比，敲除MDH2使不同濃度DON（4、2、1和0.5 μg/mL）作用5 d條件下細(xì)胞死亡率分別極顯著降低30.33%（***P＜ 0.001）、15.81%（***P＜ 0.001）、16.00%（***P＜ 0.001）和14.7%（***P＜ 0.001）。表明敲除MDH2基因后可增強(qiáng)IPEC-J2細(xì)胞對(duì)嘔吐毒素的抗性。

圖7 流式檢測(cè)DON處理后IPEC-J2和MDH2-KO的細(xì)胞死亡率Fig.7 Flow assay of cell mortality of IPEC-J2 and MDH2-KO after DON treatment

3 討論

本研究表明MDH2在DON誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡毒性中發(fā)揮重要作用。DON毒性機(jī)制包括：誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧（ROS）和活性氮（RNS）積累引起氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化，破壞DNA結(jié)構(gòu)［24］；促進(jìn)凋亡蛋白Caspase家族表達(dá)引起細(xì)胞凋亡［25］；與rRNA結(jié)合后激活p38、JNK、ERK1/2、MAPKS等信號(hào)通路抑制蛋白質(zhì)合成影響細(xì)胞功能［26］。許多研究發(fā)現(xiàn)DON處理后細(xì)胞的ROS水平提高，與細(xì)胞凋亡和炎癥相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)增加［27-28］。而由DON處理提高的ROS會(huì)破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致通透性增加，凋亡因子Cyt-c釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并激活下游Caspase凋亡蛋白家族，引發(fā)細(xì)胞凋亡［29］。此外，DON對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用與NF-κB/HIF-1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，并以劑量依賴的方式顯著增加HIF-1α的表達(dá)［30］。

MDH2既在能量代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也與細(xì)胞死亡調(diào)控有密切聯(lián)系。MDH2作為TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶利用NAD-NADH輔酶系統(tǒng)催化蘋果酸可逆地氧化為草酰乙酸，產(chǎn)生的NADH作為氧化磷酸化的還原當(dāng)量，是細(xì)胞ATP生物合成、耗氧的基本過程，但同時(shí)也能為mETC提供電子誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生并啟動(dòng)細(xì)胞死亡過程［31-35］。Zhao等［36］發(fā)現(xiàn)敲除MDH2基因能夠顯著降低蘋果酸處理后HeLa細(xì)胞中的ROS水平和細(xì)胞凋亡，表明MDH2在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用。Wang等［37］報(bào)道了MDH2基因的突變會(huì)阻止Caspase-3活化和果蠅幼蟲唾液腺細(xì)胞死亡，并導(dǎo)致細(xì)胞的ATP水平降低。抑制MDH2可降低腎小管上皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧狀態(tài)下HIF-1α水平和氧化應(yīng)激，并減少細(xì)胞凋亡和鐵性細(xì)胞死亡，表明MDH2也可以通過調(diào)控HIF-1α相關(guān)的信號(hào)途徑來調(diào)控細(xì)胞死亡［38］。

綜上可見，DON與MDH2在調(diào)控細(xì)胞死亡方面存在共同的信號(hào)途徑，本研究揭示了MDH2基因的敲除賦予IPEC-J2細(xì)胞抗嘔吐毒素的能力，能減少嘔吐毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。我們推測(cè)MDH2基因的敲除可能通過降低ROS的水平、抑制Caspase凋亡蛋白和下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，從而減少細(xì)胞死亡降低嘔吐毒素對(duì)細(xì)胞的毒性。而MDH2基因在這些途徑中具體發(fā)揮哪些功能還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)成功制備出豬MDH2基因敲除的IPEC-J2單克隆細(xì)胞系，并通過細(xì)胞活力和細(xì)胞死亡檢測(cè)，證明敲除MDH2基因能使細(xì)胞具有抗嘔吐毒素毒性效應(yīng)的能力。