1 株伏馬毒素B1降解真菌的篩選及降解特性分析

白青云，高紅俠,，胡俊強，于陽光，邱 涵，張宇航，徐劍宏,

（1.淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標準重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（南京），江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇 南京 210014；3.南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點開放實驗室，江蘇 南京 210095）

伏馬毒素主要由串珠鐮刀菌（Fusariummoniliforme）、輪狀鐮刀菌（F.verticillioides）與層出鐮刀菌（F.proliferatum）等鐮刀菌產(chǎn)生[1-3]，是一種由不同多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯型水溶性次級代謝產(chǎn)物[4]（圖1）。Gelderblom等[5]于1988年首次從串珠鐮刀菌的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)并分離出伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）?，F(xiàn)有的伏馬毒素包括FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1，共11 種。其中FB1是含量最多（約70%）、毒性最強、危害最大、影響范圍最廣的伏馬毒素[6-7]。研究表明，伏馬毒素是多種人畜病害的主要誘因，對人畜具有神經(jīng)毒性[8-9]、免疫毒 性[10-12]、器官毒性[13-14]、生殖毒性[15-17]以及與其他毒素共同作用對人畜產(chǎn)生聯(lián)合毒性[18]。伏馬毒素具有易溶于水，熱穩(wěn)定性強，高溫蒸煮也難以破壞其結(jié)構(gòu)的特性[19]，使其在糧食及飼料中難以祛除，從而造成巨大的經(jīng)濟損失，并嚴重危害人畜健康。國際癌癥機構(gòu)將伏馬毒素列為2B類致癌物，表明該物質(zhì)可能使人類致癌[20]。

圖1 FB1化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of FB1

糧食及其制品中伏馬毒素的污染情況在世界范圍內(nèi)普遍存在，其中玉米及其制品受到的污染最為嚴重[21-22]。去除糧食作物中真菌代謝所產(chǎn)生的毒素是保障糧食與飼料安全的重要方法之一。實驗證明，使用高溫[23]、輻射[24]等物理方法處理被毒素污染的糧食或使用氨氣熏蒸[25]，可以一定程度上降低伏馬毒素含量[23-25]。但采用物理與化學方法處理糧食會造成糧食與飼料品質(zhì)的降低或藥劑的殘留[26]。生物法去除伏馬毒素具有高效無毒等優(yōu)點[27]，是非常有前景的方法。Heinl等[28]發(fā)現(xiàn)可以對FB1進行生物降解的鞘氨醇單胞菌MTA144，MTA144中存在編碼脫羧酶和氨基轉(zhuǎn)移酶的2 個基因，通過這兩種酶的連續(xù)作用可以將FB1降解為無毒產(chǎn)物。百奧明公司于2014年11月研發(fā)出了可以降解伏馬毒素的酶制劑FUMzyme，并成功獲得了歐盟認證[29]。為了能夠獲得高效降解伏馬毒素的降解菌，本研究采用富集培養(yǎng)法，以FB1作為唯一碳源，從發(fā)霉玉米樣品中分離到1 株可以完全降解FB1的菌株，旨在為糧食與飼料中的FB1的脫毒處理提供良好的菌種資源和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品采集于江蘇徐州、鹽城和淮安三地的發(fā)霉玉米，具體來源見表1。

表1 玉米樣品來源Table 1 Sources of corn samples collected in this study

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

FB1通過大孔吸附樹脂聯(lián)合高速逆流色譜制備[30]，制備母液質(zhì)量濃度為50 μg/mL的FB1，使用美國Sigma公司的FB1標準品進行外標法定量；胰蛋白胨、酵母提取物 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；無機鹽試劑、瓊脂 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）上海安譜實驗科技股份有限公司；鄰苯二甲醛 上海源葉生物科技有限公司。

無機鹽培養(yǎng)基（minimal salt medium，MSM）：NaNO30.5 g/L；KH2PO41 g/L；Na2HPO41.6 g/L；CaCl2·2H2O 0.025 g/L；MgSO4·7H2O 0.5 g/L；(NH4)2SO40.5 g/L，加去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 7.0；馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，切成小塊后加水煮沸20 min，紗布過濾，加入20 g葡萄糖，攪拌混勻后定容至1 L；馬鈴薯葡萄糖固體（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：在PDB基礎(chǔ)上添加1.5 g/100 mL瓊脂即為PDA培養(yǎng)基。分別使用50 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 4.0、5.0、6.0）、50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0、8.0）以及甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.0）配制不同初始pH值的PDB培養(yǎng)基；上述培養(yǎng)基均于115 ℃高溫滅菌30 min；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）衍生液：稱取2.0 g OPA，溶于20 mL甲醇中，用硼砂溶液（0.05 mol/L，pH 10.5）定容至500 mL，加入500 μLβ-巰基乙醇后混勻，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜儀、2475熒光檢測器 沃特世科技（上海）有限公司；SB-C18液相色譜柱 安捷倫科技（中國）有限公司；PowerPac凝膠電泳儀 伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；LabCycler系列聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國 SensoQuest GmbH公司；Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；HYL-C恒溫搖床 太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；5810R高速冷凍離心機 艾本德 中國有限公司；Christ ALPHA 2-4 LD冷凍干燥機 德國Martin Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 FB1降解菌的篩選與分離

將采集的玉米樣品編號并磨碎，取5.0 g于50 mL錐形瓶中，加入20 mL無菌水，180 r/min振蕩1 h，靜置15 min，取1 mL上清液置于含有1 mg/mL FB1的20 mL MSM中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，相同的方法連續(xù)傳代培養(yǎng)3 次后，取100 μL富集培養(yǎng)液，加入900 μL 50%乙腈溶液，振蕩混勻，過0.22 μm濾膜，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測培養(yǎng)液中FB1含量。

將具有FB1降解能力的富集液進行梯度稀釋，分別涂布在FB1質(zhì)量濃度1 mg/mL的固體MSM平板上，于30 ℃倒置培養(yǎng)7 d。挑選表型不同的單菌落，在LB（Luria-Bertani）與PDA平板上劃線分離，于30 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取單菌落于FB1質(zhì)量濃度50 μg/mL的MSM中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，通過HPLC檢測FB1含量，驗證挑選的菌株是否具有FB1降解能力。

1.3.2 FB1的HPLC檢測

參照GB 5009.240—2016《食品中伏馬毒素的測定》[31]，其中檢測器的激發(fā)波長為335 nm，發(fā)射波長為440 nm；柱溫和衍生池工作溫度為40 ℃。

1.3.3 FDS-2的鑒定

形態(tài)鑒定：將菌株FDS-2在PDA平板上劃線，25 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落的顏色、大小、形狀，通過光學顯微鏡觀察菌株的微觀形態(tài)。

分子生物學鑒定：使用十六烷基三甲基溴化銨法法抽提FDS-2的基因組DNA，使用真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）與ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增FDS-2的18S rDNA部分序列。PCR體系：Master Mix 12.5 μL，ITS11 μL，ITS41 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，56.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸50 s，31 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。利用DiaSpin柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）純化PCR產(chǎn)物，并對產(chǎn)物進行TA克隆，連接體系如下：pMD18T-vector 1 μL，目的片段 2 μL，Solution I 5 μL，ddH2O 2 μL，16 ℃連接4 h。隨后將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中[32]，涂布在含Amp抗生素的LB平板上，于37 ℃倒置培養(yǎng)14 h，通過藍白斑篩選陽性克隆，驗證后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對，選取同源序列，使用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 FDS-2生長特性的測定

生長曲線的繪制：將1 mL孢子濃度為106CFU/mL的種子液接種至100 mL PDB培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天取100 mL培養(yǎng)液，8000×g離心5 min收集菌絲并使用無菌水洗滌3 次，菌絲冷凍干燥后稱質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)。

溫度對FDS-2生長的影響：在100 mL pH 7.0的PDB培養(yǎng)基中接種1 mL種子液，分別于25、28、30、35 ℃條件下180 r/min培養(yǎng)8 d，按上述條件收集菌絲并冷凍干燥，稱質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)。

培養(yǎng)基初始pH值對FDS-2生長的影響：在100 mL不同初始pH值的PDB培養(yǎng)基中接種1 mL種子液，于30 ℃、180 r/min培養(yǎng)8 d，按上述條件收集菌絲并冷凍干燥，稱質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)。

不同質(zhì)量濃度FB1對FDS-2生長的影響：在含不同初始質(zhì)量濃度FB1（10、50、100 μg/mL）的MSM中按照1%接種種子液，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔8 h取樣，測定其在OD600nm。

1.3.5 FDS-2降解特性的測定

降解曲線的繪制：吸取100 μL種子液于20 mL含50 μg/mL FB1的MSM中（pH 7.0），30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔8 h取樣，8000×g離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，HPLC檢測上清液中FB1質(zhì)量濃度。

溫度對菌株降解FB1的影響：吸取50 μL種子液于5 mL含50 μg/mL FB1的MSM（pH 7.0）中，分別置于25、28、30 ℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取樣，利用HPLC檢測FB1質(zhì)量濃度。

pH值對菌株降解FB1的影響：吸取50 μL種子液于5 mL含50 μg/mL FB1的MSM中，使用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取樣，HPLC檢測FB1質(zhì)量濃度。

1.3.6 降解FB1活性物質(zhì)的定位

在100 mL PDB培養(yǎng)基中接種 1 mL FDS-2種子液，于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，取培養(yǎng)的菌液，8000×g離心10 min。上清液過0.22 μm水性濾膜，在500 μL上清液中加入5 μg FB1反應(yīng)1 d，以沸水浴滅活的上清液作為對照。菌體沉淀用10 mL磷酸鹽緩沖液清洗3 次，用濾紙吸去菌體表面液體，加入液氮后研磨破碎菌體。將研磨后的菌粉加入預冷的 20 mL磷酸鹽緩沖液中（pH 7.0），4 ℃、12000×g離心10 min，破碎上清液過0.22 μm濾膜，在500 μL破碎上清液中加入5 μg FB1反應(yīng)1 d，同時以沸水浴滅活的破碎上清液作為對照組。分別取500 μL菌液上清和菌體破碎上清液，加入20 μL蛋白酶K后于30 ℃反應(yīng)2 h，隨后加入5 μg FB1反應(yīng)1 d，通過HPLC檢測FB1質(zhì)量濃度。

1.3.7 FDS-2對FB1降解產(chǎn)物的初步分析

將100 μL種子液接種于10 mL含10 μg/mL FB1的MSM（pH 7.0）中，置于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔12 h取樣200 μL，取樣后立刻置于超低溫冰箱凍存，共取樣6 次，于冷凍干燥儀中干燥。加入200 μL乙腈超聲復溶，12000×g離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜待測。使用配備ACE UltraCore Super C18色譜柱（3.0 mm×150 mm，2.5 μm）的AB SCIEX Triple-TOFTM 5600進行質(zhì)譜檢測，流動相分別為0.1%甲酸溶液和乙腈，梯度洗脫條件如下：初始流動相為5%乙腈溶液，9 min內(nèi)乙腈比例線性升至95%，并以0.4 mL/min流速保持2 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

HPLC圖：從Waters e2695高效液相色譜儀中導出數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 8繪制折線圖。生長特性與降解特性圖：實驗均重復3 次，記錄實驗結(jié)果后，使用GraphPad Prism 8軟件處理實驗數(shù)據(jù)，得到實驗結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FB1降解菌株的篩選與分離

用無菌水浸提18 個玉米樣品中的微生物，以FB1為碳源進行富集培養(yǎng)，從3號樣品中分離到1 株FB1降解菌，命名為FDS-2。在5 mL含50 μg/mL FB1的MSM中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d，F(xiàn)DS-2可將250 μg FB1完全降解。如圖2所示，F(xiàn)B1的保留時間為9.48 min，對照組樣品在此時有吸收峰，而實驗組樣品無吸收峰，表明FDS-2將培養(yǎng)液中的FB1全部降解。

圖2 FDS-2降解FB1的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram showing FB1 degradation by FDS-2

2.2 FDS-2的鑒定

FDS-2在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上生長快，橄欖褐色至黑色，初期黏、酵母狀，后期變絨毛狀；背面黑褐色，色素不溶于培養(yǎng)基中。氣生菌絲茂盛，淺到深褐色，可形成菌絲束；齒狀、燒瓶狀產(chǎn)孢細胞直接生于菌絲上或形成具1～3隔膜的分生孢子梗；特化的分生孢子梗褐色，頂端色淺、變尖，與菌絲夾角大或近于垂直，寬2.0～3.0 μm，長25～85 μm；分生孢子淺色，長橢圓形或近柱狀，單細胞，2.2～5.3 μm×1.0～2.0 μm，在產(chǎn)孢細胞頂端聚集成團（圖3）。

圖3 FDS-2的菌落形態(tài)與顯微特征圖Fig.3 Colony morphology and microscopic characteristics of FDS-2

使用通用引物ITS1和ITS4擴增菌株FDS-2的核糖體rDNA，PCR產(chǎn)物長度為705 bp。BLAST結(jié)果顯示，F(xiàn)DS-2與棘狀外瓶霉（Exophiala spinifera）CBS同源性高達100%。根據(jù)菌種的培養(yǎng)特征、顯微特征以及rRNA-ITS序列特征（圖4），鑒定FDS-2為棘狀外瓶霉。

圖4 FDS-2的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of FDS-2

2.3 FDS-2的生長特性

如圖5A所示，在PDB培養(yǎng)基中，菌株于第2天后進入對數(shù)生長期，8 d后進行穩(wěn)定期。由圖5B、C可知，F(xiàn)DS-2的最適生長溫度為30 ℃，菌株在酸性條件下（pH 5.0）生長最快，在堿性條件下生長較為緩慢。在以FB1為唯一碳源的MSM中，F(xiàn)DS-2累積生物量與初始FB1質(zhì)量濃度呈正比（圖5D），說明菌株FDS-2能以FB1為唯一 碳源生長。

圖5 生長時間（A）、溫度（B）、pH值（C）和初始FB1 質(zhì)量濃度（D）對FDS-2生長的影響Fig.5 Effect of growth time (A),temperature (B),pH (C) and initial FB1 concentration (D) on the growth of FDS-2

2.4 FDS-2對FB1的降解特性

FDS-2降解曲線如圖6A所示，在MSM中，F(xiàn)DS-2對FB1的最適降解溫度為30 ℃（圖6B），最適降解pH 5.0（圖6C），這與FDS-2的最適生長條件一致。在最適降解溫度和pH值條件下，F(xiàn)DS-2可在48 h內(nèi)把250 μg FB1降解完全。

圖6 生長時間（A）、溫度（B）和pH值（C）對FDS-2降解FB1的影響Fig.6 Effect of growth time (A),temperature (B) and pH (C) on FB1 degradation by FDS-2

2.5 FDS-2降解活性物質(zhì)的初步分析

如圖7所示，菌株FDS-2菌液上清和菌體破碎液上清對FB1的降解率分別為7.4%和92.3%，沸水浴處理后菌體破碎液上清的降解率顯著降低。這表明降解FB1的活性物質(zhì)位于FDS-2胞內(nèi)。進一步對上清液進行蛋白酶K處理，破碎液上清中的活性物質(zhì)失去降解能力，推測該活性物質(zhì)是菌株FDS-2的胞內(nèi)酶。

圖7 不同處理方法對FDS-2上清降解FB1的影響Fig.7 Effect of different treatment methods on FB1 degradation by FDS-2 culture supernatant

2.6 FDS-2降解產(chǎn)物的初步分析

分析6 個樣本的總離子流圖（圖8A），與FB1標準品的總離子流圖相比，F(xiàn)DS-2降解FB148 h的樣本出現(xiàn)了一個新的色譜峰（保留時間5.27 min）（圖8B）。提取該色譜峰的m/z信息，確定影響離子豐度的物質(zhì)的m/z406.3506。提取二級質(zhì)譜信息，發(fā)現(xiàn)碎裂離子間的m/z差值為18（圖8C），首先推測該物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)上有5 個羥基，進而推測該物質(zhì)是FB1脫去2 分子丙三羧酸后的產(chǎn)物，為水解FB1，這與Sphingopyxissp.MTA144降解FB1的初步產(chǎn)物一致。但6 個樣本中均未檢測到2-酮基-水解FB1的分子離子，因此，F(xiàn)DS-2降解FB1的終產(chǎn)物有待進一步研究分析。

圖8 菌株FDS-2降解FB1的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectra of degradation products of FB1 by strain FDS-2

3 結(jié)論

本實驗通過富集培養(yǎng)，從江蘇徐州、鹽城和淮安三地的發(fā)霉玉米樣品中篩選到1 株FB1高效降解菌FDS-2。經(jīng)菌落形態(tài)觀察結(jié)合分子生物學分析，將FDS-2鑒定為棘狀外瓶霉。FDS-2的最適生長和降解條件均為30 ℃、pH 5.0，在該降解條件下，F(xiàn)DS-2能以FB1為唯一碳源生長并于48 h內(nèi)將250 FB1降解完全。定域?qū)嶒灡砻?，菌株FDS-2的降解活性物質(zhì)是一種胞內(nèi)酶。

現(xiàn)有的報道中，降解FB1的菌株有叢毛單胞菌[33]、鞘氨醇盒菌[29]、鞘氨醇單胞菌[34]等細菌以及棘狀外瓶霉和R.atrovirens兩株真菌[35]。Duvick[35]發(fā)現(xiàn)棘狀外瓶霉降解FB1的過程中，第1步反應(yīng)是水解FB1側(cè)鏈的酯鍵；Heinl等[28]闡明了菌株MTA144的降解途徑，第一步反應(yīng)是也是水解FB1側(cè)鏈的酯鍵，第2步則是在轉(zhuǎn)氨酶的作用下進行轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。本研究降解菌FDS-2在降解FB1過程中也發(fā)現(xiàn)了降解產(chǎn)物水解FB1，推測FDS-2中存在一種降解FB1的羧酸酯酶。進一步以FDS-2的基因組測序草圖為基因文庫進行本地BLAST，并未發(fā)現(xiàn)與已報到菌株棘狀外瓶霉的水解酶（XP_016238460）高度同源的水解酶基因序列。因此推測菌株FDS-2中存在新型的FB1水解酶。

飼料經(jīng)動物胃液消化，強酸性會顯著降低脫毒效果，故菌株或酶的最適反應(yīng)pH值在脫毒過程中顯得尤為重要。與研究較為深入的鞘氨醇盒菌MTA144相比較，細菌的最適pH值為7.0，而FDS-2的最適生長pH值和降解pH值均為5.0，故推測FDS-2中水解酶的最適反應(yīng)pH值可能為5.0。菌株FDS-2中高效FB1降解酶有待進一步研究。