酪蛋白膠束與多元活性分子的相互作用及其復(fù)合物特性

鄭 杰，楊 敏,2,*，甄晨波，秦娟娟

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，甘肅 蘭州 730070）

原花青素（proanthocyanidin，PC，圖1A）是自然界廣泛存在的一種類黃酮化合物，是構(gòu)成植物果實(shí)、花瓣等組織顏色的主要水溶性色素。PC由不同數(shù)量的兒茶素（catechin，Cat）或表兒茶素聚合而成。依據(jù)不同的聚合度，可將PC分為單體、低聚物和高聚物，其中二聚體分布最廣。研究表明，PC具有抗氧化、抗過(guò)敏、降血糖等多種生理活性[1]。此外，PC還被作為天然色素，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。Cat（圖1B）為PC結(jié)構(gòu)的組成單元，是從茶葉中提取的一種天然黃酮類化合物，不但具有較強(qiáng)的抗炎、抗菌、抗氧化作用，還具有預(yù)防心腦血管疾病、抑制癌細(xì)胞增殖等功效[2-3]。葉綠素銅鈉（chlorophyllin sodium copper salt，Chl，圖1C）為葉綠素的衍生化合物，是一種允許添加在食品中的水溶性天然色素，且具有抗炎、抗菌、清除自由基、促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝等生物活性[4]。

圖1 PC（A）、Cat（B）、Chl（C）的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of PC (A),Cat (B),and Chl (C)

上述分子是常見(jiàn)的食源活性分子，因具有優(yōu)異的生物活性、來(lái)源廣泛和食用安全等優(yōu)點(diǎn)，受到眾多研究者的青睞。然而，它們穩(wěn)定性差，在加工過(guò)程中易受光、熱、pH值、氧化劑、酶等因素的影響而發(fā)生降解或者結(jié)構(gòu)改變。此外，PC、Cat、Chl還表現(xiàn)出脂溶性差、親水性強(qiáng)的性質(zhì)，使其在親脂體系中的應(yīng)用較少[3,5-6]。以上諸多因素都限制了其在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的使用。

針對(duì)上述問(wèn)題，眾多研究者以大分子作為基質(zhì)，采用乳化、噴霧干燥、酸化等技術(shù)構(gòu)建出乳液、微膠囊、凝膠等不同類型的載體，通過(guò)物理作用對(duì)活性分子進(jìn)行保護(hù)，在既不影響活性分子天然結(jié)構(gòu)、又不會(huì)產(chǎn)生新的可能具有潛在危害物質(zhì)的同時(shí)提高其穩(wěn)定性及生理活性。研究表明，人工合成的兩性多肽負(fù)載PC后，顯著改善了PC對(duì)堿、金屬離子和高溫的敏感性[7]。黑豆分離蛋白的負(fù)載提高了PC的熱穩(wěn)定性[8]。玉米醇溶蛋白/殼聚糖納米顆粒負(fù)載顯著提高了Cat衍生物的抗氧化活性，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)其的控釋[9]。大豆分離蛋白負(fù)載后，Chl的穩(wěn)定性有效提升[10]。由此可見(jiàn)，大分子負(fù)載可有效改善活性分子的穩(wěn)定性及生物活性。然而，已有報(bào)道中的大分子載體及其對(duì)活性分子的負(fù)載均需要通過(guò)多個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)，致使負(fù)載工藝復(fù)雜、成本高。另外，現(xiàn)有研究主要集中于載體對(duì)一種活性分子的負(fù)載方面，其對(duì)多元分子的負(fù)載研究較少。因此，有必要尋求一種天然大分子基質(zhì)，無(wú)需復(fù)雜的構(gòu)建和負(fù)載工藝即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)活性分子的負(fù)載。

酪蛋白是動(dòng)物乳中特有的一種含磷、鈣的結(jié)合蛋白質(zhì)，由4 種不同類型單體組成（αs1∶αs2∶β∶κ＝4∶1∶4∶1）。4 種單體間通過(guò)非共價(jià)相互作用以及鈣橋形成直徑約為80～400 nm的超分子膠束粒子，稱為酪蛋白膠束（casein micelles，MC）；MC具有“內(nèi)部疏水、外部親水”的特殊空間結(jié)構(gòu)，是天然納米載體的首選基質(zhì)之一[11]。MC具有活性分子的多個(gè)作用位點(diǎn)，由于其為多孔型納米顆粒，活性分子不僅可以結(jié)合于MC表面的肽鏈上，還可以進(jìn)入結(jié)構(gòu)內(nèi)部，與多肽鏈結(jié)合，且形成交聯(lián)作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MC對(duì)大黃素[12]、咖啡酸及咖啡酸苯乙酯[13]均表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合作用；另外，也有研究指出，MC具有負(fù)載VD2、VD3的能力，可通過(guò)負(fù)載提升活性分子的溶解性、穩(wěn)定性以及生物活性[14-15]。

截至目前，MC與小分子的結(jié)合作用研究主要集中于單一分子，其對(duì)多種分子的結(jié)合作用及負(fù)載能力尚不清楚。而多種活性分子聯(lián)合使用可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，對(duì)人體健康產(chǎn)生多種益處[16]。例如，β-乳球蛋白與香草酸、阿魏酸、槲皮素形成的三配體復(fù)合物表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性與抗氧化活性，且三配體復(fù)合物的抗氧化性顯著強(qiáng)于單一配體[17]。β-乳球蛋白同時(shí)負(fù)載PC B2和二氫楊梅素，具有增強(qiáng)活性分子穩(wěn)定性和協(xié)同細(xì)胞毒性的作用[18]。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇了食源色素PC和Chl，以及PC的結(jié)構(gòu)單元Cat作為模型分子，采用熒光分析法系統(tǒng)分析熱處理和熱處理聯(lián)合超聲處理下MC與PC、Cat、Chl單一分子及其二元組合物的相互作用，對(duì)比3 種分子與MC的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合作用力，分析MC負(fù)載過(guò)程中分子間的相互影響，探討MC對(duì)多元分子的同時(shí)負(fù)載能力。同時(shí)，研究二元及三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、表面形貌、熱穩(wěn)定性以及抗氧化性能，并評(píng)價(jià)復(fù)合物的體外模擬消化情況。研究結(jié)果可為MC在負(fù)載多元活性分子中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MC參照?qǐng)F(tuán)隊(duì)前期研究方法[13]制備，將巴氏殺菌牛乳在4000×g離心30 min，所得脫脂乳進(jìn)行膜過(guò)濾，截留分子質(zhì)量為100 kDa，跨膜壓力為0.4 MPa，流速為 480 L/h。收集截留濃縮液后冷凍干燥至質(zhì)量恒定，即得MC，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（83.26±1.87）%。

PC、(＋)-Cat、Chl、胃蛋白酶（15000 U/mg）、胰蛋白酶（2500 U/mg）上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NAI-GZJ型實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī) 上海那艾精密儀器有限公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)、S-3400N掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本日立公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）美國(guó)賽默飛世爾科技公司；STA 449 F5熱重-差示掃描量熱分析儀（thermogravimetric-differential scanning calorimetry，TG-DSC）德國(guó)耐馳儀器制造有限公司；SFX550超聲處理儀 美國(guó)布蘭森超聲波公司；DYY-6D型電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 二元、三元復(fù)合物的制備

二元復(fù)合物的制備：將MC溶解于0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.86）中，制備質(zhì)量濃度為2 g/L的儲(chǔ)備液。將PC充分溶解于0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.86），制備濃度為0.004 mol/L PC溶液。取不同體積PC溶液與20 mL MC溶液混合，用空白緩沖溶液補(bǔ)充，使混合液體積相等，分別置于298、310、318 K水浴中恒溫處理20 min，即為熱處理組；混合液分別置于298、310、318 K水浴中恒溫處理2 min后，將12.7 mm超聲波探頭置于樣品中心超聲處理1 min，超聲振幅為30%、脈沖開(kāi)啟時(shí)間5 s、關(guān)閉時(shí)間1 s，即為熱處理聯(lián)合超聲處理組。處理后的溶液在避光條件下冷卻至室溫，貯存?zhèn)溆?；其中PC終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μmol/L，記作PC-MC復(fù)合物。

Cat-MC、Chl-MC復(fù)合物的制備過(guò)程同PC-MC復(fù)合物制備過(guò)程。其中，混合溶液中Cat終濃度分別為0、100、200、300、400、500 μmol/L；Chl終濃度分別為0、10、20、30、40、50 μmol/L。

三元復(fù)合物的制備：首先制備出PC-MC 或Cat-MC 的二元復(fù)合物，其中PC、Cat 的終濃度分別為60、300 μmol/L（約為PC和Cat對(duì)MC熒光猝滅50%時(shí)的濃度，下同；MC終質(zhì)量濃度為2 g/L）。將不同濃度Cat或PC分別加入PC-MC或Cat-MC二元復(fù)合物中，均勻混合后，分別進(jìn)行熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理，形成相應(yīng)的三元復(fù)合物記作PC-MC-Cat（Cat終濃度為0、100、200、300、400、500 μmol/L）或Cat-MC-PC（PC終濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L）。

PC-MC-Chl和Chl-MC-PC復(fù)合物的制備與上述方法相同，初始二元復(fù)合物中PC、Chl的終濃度分別為60、30 μmol/L（MC終質(zhì)量濃度為2 g/L；PC-MC-Chl中Chl終濃度為0、10、20、30、40、50 μmol/L；Chl-MC-PC中PC終濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L）。

使用噴霧干燥機(jī)對(duì)復(fù)合物進(jìn)行噴干處理，設(shè)定出口溫度130 ℃，物料流量300 mL/h，撞針間隔時(shí)間1 s。收集噴干后的粉末樣品冷藏備用。

1.3.2 熒光光譜分析

復(fù)合物內(nèi)源熒光光譜由熒光分光光度計(jì)測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，記錄樣品在300～500 nm區(qū)間的內(nèi)源熒光光譜。通過(guò)Stern-Volmer方程（式（1））確定PC、Cat、Chl或其二元組合對(duì)MC內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)理[19]。

式中：F0、F分別為加入小分子前后的熒光強(qiáng)度；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；Kq為散射碰撞猝滅常 數(shù)/（L/（mol·s））；τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命為10-8s；Q為小分子濃 度/（mol/L）。

PC、Cat、Chl與MC結(jié)合的結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）通過(guò)雙對(duì)數(shù)方程（式（2））計(jì)算：

通過(guò)Van’t Hoff方程（式（3）、（4））計(jì)算MC與小分子結(jié)合反應(yīng)的吉布斯自由能變（ΔG）、熵變（ΔS）和焓變（ΔH）：

式中：Ka為對(duì)應(yīng)溫度下M C 與小分子的結(jié)合常 數(shù)/（L/mol）；R為理想氣體常數(shù)/（J/（K·mol））；T為處理溫度/K；ΔG為吉布斯自由能變/（J/mol）；ΔH為焓變/（J/mol）；ΔS為熵變/（J/（mol·K））。

1.3.3 FTIR測(cè)定

將復(fù)合物粉末置于衰減全反射（attenuated total reflection，ATR）元件，選擇分辨率為4 cm-1，在透射模式下采用FTIR儀掃描500～4000 cm-1之間的紅外光譜。

1.3.4 SEM測(cè)定

取適量復(fù)合物粉末置于銅臺(tái)上的導(dǎo)電膠條表面，小心涂抹使其分散為薄層，噴金后采用SEM觀察，電壓12.0 kV。

1.3.5 TG-DSC分析

參照Qin Juanjuan等[13]的方法。準(zhǔn)確稱取4～6 mg樣品，以同規(guī)格空坩堝作為參比，測(cè)定復(fù)合物在25～500 ℃區(qū)間內(nèi)熱穩(wěn)定性，升溫速率5 ℃/min。

1.3.6 抗氧化性分析

制備濃度為0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）儲(chǔ)備液。將3 mL DPPH自由基儲(chǔ)備液與0.4 mL復(fù)合物溶液均勻混合，室溫避光靜置20 min，測(cè)定混合液在517 nm波長(zhǎng)處吸光度，記為A1；將3 mL無(wú)水乙醇與0.4 mL復(fù)合物溶液均勻混合，吸光度記為A2；將3 mL DPPH自由基儲(chǔ)備液與0.4 mL磷酸鹽緩沖液均勻混合，吸光度記為A0。按式（5）計(jì)算DPPH自由基清除能力[20]：

制備7.4 mmol/L 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）原液和2.6 mmol/L過(guò)硫酸鉀原液，將二者混合均勻并避光保存12 h；用pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至734 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.70±0.02，獲得ABTS陽(yáng)離子自由基儲(chǔ)備液。將3 mL ABTS陽(yáng)離子自由基儲(chǔ)備液與50 μL復(fù)合物溶液均勻混合后，室溫靜置6 min，測(cè)定混合液在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按式（6）計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力：

式中：A0為ABTS陽(yáng)離子自由基儲(chǔ)備液與磷酸鹽緩沖液混合后的吸光度；As為ABTS陽(yáng)離子自由基儲(chǔ)備液與復(fù)合物溶液混合后的吸光度。

1.3.7 體外模擬胃腸消化性分析

樣品的體外模擬消化性采用課題組已有方法測(cè)定，稍作修改[12]。將2 g氯化鈉和0.032 g胃蛋白酶溶解在1 L去離子水中，并用濃鹽酸將pH值調(diào)至1.2，得到模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）。在1 L去離子水中加入6.8 g磷酸二氫鉀和0.1 g胰蛋白酶，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值至7.5，充分溶解后得到模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）。

將0.1 g復(fù)合物粉末置于10 mL試管中，加入2 mL SGF，37 ℃、130 r/min水浴振蕩120 min，每60 min取樣10 μL。模擬腸消化在相同條件下進(jìn)行4 h，以20、40、60、120 min和240 min為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，每次取樣10 μL[12]。將取出后的消化液與聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液1∶1混合均勻，水浴煮沸4 min，4000 r/min離心4 min，隨后將6 μL混合液注入凝膠軌道并在150 V恒壓下進(jìn)行電泳，觀察MC的胃腸模擬消化情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)間差異顯著分析采用Duncan法，P＜0.05，差異顯著；數(shù)據(jù)以表示，所有數(shù)據(jù)至少為3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC與PC、Cat、Chl的相互作用分析

2.1.1 熒光光譜分析

由圖2A1～A3、B1～B3可知，各條件處理組中，MC在336 nm（最大發(fā)射波長(zhǎng)）處的熒光強(qiáng)度隨著分子濃度的增加而降低，表明活性分子與MC形成了復(fù)合物。此外，隨著Cat、Chl濃度的增加，MC的最大發(fā)射波長(zhǎng)呈現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象；而PC的加入則導(dǎo)致其紅移，說(shuō)明PC的結(jié)合使MC上色氨酸殘基微環(huán)境親水性增強(qiáng)。相同條件處理下，Chl對(duì)MC的內(nèi)源熒光猝滅效果最強(qiáng)，Cat最弱，表明MC與Chl之間的相互作用最強(qiáng)。盡管Cat是PC的結(jié)構(gòu)單元，但它與MC的相互作用比PC弱，可能是由于PC結(jié)構(gòu)中存在更多的黃酮單元，可與MC上不同肽鏈的氨基酸殘基間形成非共價(jià)作用。

圖2 熱處理（A）或熱處理聯(lián)合超聲（B）處理下 二、三元復(fù)合物熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of binary or ternary complexes with heat treatment (A) or combined heat and ultrasonic treatment (B)

三元復(fù)合物中，Cat和Chl的加入導(dǎo)致PC-MC復(fù)合物的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移；但PC的加入導(dǎo)致Cat-MC和Chl-MC最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移，與它們對(duì)游離MC的影響相似（圖2A4～A7、B4～B7）。與游離MC相比，二元復(fù)合物最大發(fā)射波長(zhǎng)的移動(dòng)程度更大，表明二元分子的組合對(duì)MC的色氨酸微環(huán)境有更大的影響。

為了探究PC、Cat、Chl對(duì)MC內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)理，利用Stern-Volmer方程計(jì)算了Ksv和Kq[19]。由表1可知，各處理組中二元、三元復(fù)合物的Kq值遠(yuǎn)大于最大Kq值（2.0×1010L/（mol·s）），表明3 種小分子及其二元組合物對(duì)MC內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)理均為靜態(tài)猝滅，形成了穩(wěn)定性較高的靜態(tài)復(fù)合物[21]。二元復(fù)合物Chl-MC的Ksv和Kq值均高于PC-MC和Cat-MC，這與熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)一致。此外，三元復(fù)合物的Ksv和Kq值與二元復(fù)合物接近，表明MC具有同時(shí)結(jié)合兩個(gè)分子的能力。

表1 熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理下PC、Cat和Chl對(duì)MC的結(jié)合參數(shù)Table 1 Binding parameters of MC to PC,Cat or Chl with heat treatment or combined heat and ultrasonic treatment

2.1.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分析

對(duì)于靜態(tài)猝滅機(jī)制，Ka與n可通過(guò)雙對(duì)數(shù)方程計(jì)算，結(jié)果如表1所示。相同條件處理下，二元復(fù)合物的Ka值均隨溫度的升高而升高，表明結(jié)合過(guò)程為吸熱過(guò)程。此外，兩種處理?xiàng)l件下，PC-MC、Cat-MC、Chl-MC在各溫度下的Ka值均高于103，且遵循Chl＞PC＞Cat，表明MC對(duì)Chl具有更強(qiáng)的親和力。PC與MC的Ka值高于其與β-酪蛋白的Ka（103），與β-乳球蛋白的Ka[22-23]相似。Cat和MC的Ka值高于其與大豆分離蛋白（102）和β-乳球蛋白的Ka值[24-25]。Chl和MC的Ka值高于其與大豆蛋白的Ka值（104）[10]。此外，MC對(duì)大黃素、咖啡酸、咖啡酸苯乙酯也表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合作用[12-13]。可見(jiàn)，MC是一種生物活性分子的天然納米載體。

Chl-MC復(fù)合物在熱處理?xiàng)l件下的Ka值高于熱處理聯(lián)合超聲處理，而Cat-MC復(fù)合物的Ka則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)镸C和Chl之間的強(qiáng)相互作用導(dǎo)致Chl很容易與MC結(jié)合，而超聲波產(chǎn)生的空化作用削弱了二者間的結(jié)合作用。對(duì)于Ka值較低的Cat而言，超聲產(chǎn)生的空化作用通過(guò)增加它們的碰撞加速Cat與MC結(jié)合。此外，由于其分子體積小，空化作用可以使Cat輕松進(jìn)入膠束內(nèi)部區(qū)域并與MC牢固結(jié)合。

除熱處理聯(lián)合超聲處理下的PC-MC-Chl復(fù)合物外，在三元復(fù)合物中，第2個(gè)分子結(jié)合的Ka值隨處理溫度的增加而減小，這表明低溫有助于三元復(fù)合物的形成。此外，298 K熱處理?xiàng)l件下，Chl和Cat與二元復(fù)合物結(jié)合的Ka值比它們與游離MC結(jié)合的Ka值大，而PC的Ka值變化與此相反，這可能是由于PC分子體積較大，其與MC的結(jié)合域與其他分子不同所致?？偟膩?lái)說(shuō)，MC可以連續(xù)結(jié)合兩個(gè)生物活性分子，并具有較單一分子高或相似的結(jié)合強(qiáng)度。298 K時(shí)，熱處理下的三元復(fù)合物的Ka值高于熱處理聯(lián)合超聲處理，這表明當(dāng)MC與一個(gè)分子結(jié)合后，超聲處理不利于另一個(gè)分子的結(jié)合。

由表1可知，MC上有一個(gè)PC或Cat的結(jié)合位點(diǎn)。PC-β-乳球蛋白和Cat-大豆分離蛋白也表現(xiàn)出類似的 結(jié)果[23-24]。MC上Chl的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)較PC和Cat多，表明Chl與MC產(chǎn)生結(jié)合作用的基團(tuán)比PC、Cat更多。298 K熱處理?xiàng)l件下，三元復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)也接近1，且相較于二元復(fù)合物表現(xiàn)出較大或相近的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。進(jìn)一步證實(shí)，第一個(gè)活性分子的結(jié)合有利于另一個(gè)分子與MC的結(jié)合。

2.1.3 熱力學(xué)參數(shù)分析

蛋白質(zhì)與酚類化合物的結(jié)合方式可通過(guò)熱力學(xué)參數(shù)判定。采用Van’t Hoff方程計(jì)算得到的二元、三元復(fù)合物形成過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)，如表1所示。各條件處理組中，二元復(fù)合物形成過(guò)程中ΔH和ΔS均為正值，表明PC、Cat、Chl與MC之間的結(jié)合方式主要以疏水作用為主。熱處理?xiàng)l件下，第2個(gè)分子與MC結(jié)合的ΔH和ΔS均為負(fù)值，即MC以疏水作用與一個(gè)分子結(jié)合后，另一個(gè)分子則以范德華力和氫鍵與之結(jié)合。由于第1個(gè)分子已經(jīng)占據(jù)了MC上易于結(jié)合的疏水位點(diǎn)，另一個(gè)分子只能以其他方式結(jié)合在其他位點(diǎn)上。然而，超聲處理下，Chl仍然以疏水作用與PC-MC結(jié)合，這是因?yàn)镻C和Chl的體積較大，PC結(jié)合在MC的疏水位點(diǎn)后，受PC體積和超聲波的雙重作用，MC的結(jié)構(gòu)變化較大，由于位阻效應(yīng)，不能在臨近位置繼續(xù)結(jié)合第2個(gè)分子。因此，第2個(gè)分子可能結(jié)合于MC的其他疏水位點(diǎn)。受到超聲波的影響，第2個(gè)分子與MC的結(jié)合作用弱于其單獨(dú)與MC的結(jié)合作用。但是，二元、三元復(fù)合物的ΔG均為負(fù)值，表明復(fù)合物的形成均為自發(fā)過(guò)程，證明MC具有自發(fā)結(jié)合多個(gè)活性分子的能力，這與其特殊的納米結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.2 多元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 FTIR分析

如圖3所示，游離PC、Cat在1604 cm-1處為C＝C 的伸縮振動(dòng)，1518 cm-1處為C＝C骨架的伸縮振動(dòng)，1440 cm-1處為C—H的彎曲振動(dòng)[26-27]；游離Chl在2975 cm-1處為CH3的不對(duì)稱C—H伸縮振動(dòng)，2855 cm-1處為醛基的伸縮振動(dòng)，1525 cm-1和1356 cm-1處為卟啉環(huán)的C—C和C—N骨架振動(dòng)[28]。MC中，酰胺I（1640 cm-1）和酰胺II帶（1514 cm-1）的位置分別與蛋白質(zhì)的C—O和N—H的伸縮振動(dòng)有關(guān)[12]。MC與PC、Cat、Chl在不同處理?xiàng)l件下結(jié)合后，酰胺I、II帶未出現(xiàn)明顯的偏移，但PC、Cat、Chl的特征峰均消失，三元復(fù)合物也表現(xiàn)出類似的變化。這可能是由于MC自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高，低濃度的PC、Cat、Chl通過(guò)物理作用結(jié)合在MC表面或孔隙間，從而對(duì)其酰胺帶沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。前期研究表明，MC與葛根素/黃豆苷元結(jié)合后，其酰胺帶也未發(fā)生明顯變化[29]。

圖3 熱處理（A）或熱處理聯(lián)合超聲（B）處理下復(fù)合物的FTIR圖Fig.3 FTIR spectra of complexes with heat treatment (A) or combined heat and ultrasonic treatment (B)

2.2.2 SEM分析

如圖4所示，游離PC表現(xiàn)為帶有厚壁的光滑球體，部分球體因噴干時(shí)內(nèi)部水分子揮發(fā)皺縮而破裂；游離Cat和Chl則呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀。經(jīng)噴霧干燥后，MC和二元、三元復(fù)合物呈葡萄干狀，粒徑介于5～25 μm之間。超聲處理后，因MC空間結(jié)構(gòu)變得緊湊，尺寸略有減小[30]。但二元、三元復(fù)合物未表現(xiàn)出類似的現(xiàn)象。這可能是由于結(jié)合的PC、Cat、Chl起到了穩(wěn)定MC空間結(jié)構(gòu)的作用。此外，與MC相比，Cat較小的分子結(jié)構(gòu)使得二元復(fù)合物Cat-MC在熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理下均表現(xiàn)出粒徑較小、粒度趨于均勻的特點(diǎn)。

圖4 未經(jīng)任何處理（A）、熱處理（B）或熱處理聯(lián)合超聲處理（C）游離PC、Cat、Chl及其二、三元復(fù)合物的SEM圖Fig.4 SEM images of free PC,Cat,Chl and their binary or ternary complexes without treatment (A),with heat treatment (B) or combined heat and ultrasonic treatment (C)

2.3 多元復(fù)合物性質(zhì)分析

2.3.1 熱穩(wěn)定性分析

如圖5所示，不同條件處理下，游離PC、Cat、Chl與MC及其復(fù)合物在50～100 ℃之間均存在一個(gè)明顯的吸熱峰，這是由于少量水分蒸發(fā)所致。隨著溫度的升高，PC和Chl的DSC曲線沒(méi)有出現(xiàn)明顯的晶體熔融吸熱峰，表明它們具有無(wú)定形結(jié)構(gòu)。Cat的DSC曲線具有樣品熔化的吸熱峰以及與類黃酮氧化和降解相關(guān)的放熱峰[31]。與MC相互作用后，PC、Cat、Chl的特征吸熱峰消失，二元、三元復(fù)合物表現(xiàn)出與游離MC相似的蛋白寬峰特征曲線。

由圖6 可知，P C 在150～425 ℃的質(zhì)量損失為28.43%；Chl在225～425 ℃的質(zhì)量損失為23.31%；而Cat在200～280 ℃的質(zhì)量損失為6.98%，在280～425 ℃的質(zhì)量損失為22.05%。MC在熱處理下于225～425 ℃的質(zhì)量損失為63.28%，熱處理聯(lián)合超聲處理下為58.11%，表明超聲處理改善了MC的熱穩(wěn)定性；這可能與超聲處理使MC的空間結(jié)構(gòu)變得緊湊有關(guān)。二元、三元復(fù)合物的TG曲線與游離MC相似，分別在50～100、100～200 ℃和225～425 ℃ 3 個(gè)階段出現(xiàn)質(zhì)量損失：第1階段是由于水的蒸發(fā)，第2階段是由于PC、Cat、Chl和MC之間的相互作用被破壞，第3階段是由于PC、Cat、Chl和MC的熱分解。熱處理?xiàng)l件下，二元、三元復(fù)合物的質(zhì)量損失低于游離MC，而熱處理聯(lián)合超聲處理則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，表明在熱處理?xiàng)l件下活性分子的結(jié)合增加了MC的熱穩(wěn)定性。

圖6 熱處理（A）或熱處理聯(lián)合超聲（B）處理下復(fù)合物的熱穩(wěn)定性Fig.6 TG curves of complexes with heat treatment (A) or combined heat and ultrasonic treatment (B)

2.3.2 抗氧化性分析

如圖7A所示，3 種分子對(duì)DPPH自由基的清除能力顯著高于同濃度VC，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。PC、Cat、Chl二元或三元復(fù)合物均表現(xiàn)出良好的DPPH自由基清除活力，但低于游離分子和MC的DPPH自由基清除力的總和，說(shuō)明二者的結(jié)合位點(diǎn)與DPPH自由基清除有關(guān)。與MC結(jié)合后，復(fù)合物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨處理?xiàng)l件不同表現(xiàn)出顯著差異。熱處理?xiàng)l件下，MC與PC、Cat、Chl相互作用強(qiáng)于超聲處理，因此熱處理復(fù)合物的DPPH自由基清除率低于相同濃度游離分子的清除率。三元復(fù)合物的DPPH自由基清除力變化趨勢(shì)與二元復(fù)合物一致，且均大于二元復(fù)合物的活性。此外，PC，Cat和Chl的添加順序不會(huì)對(duì)三元復(fù)合物的清除能力產(chǎn)生顯著影響，說(shuō)明不同活性分子都是獨(dú)立結(jié)合于MC的不同位點(diǎn)，其抗氧化性沒(méi)有拮抗作用。如圖7B所示，相較于VC，3 種分子對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力。不同條件處理下，二元、三元復(fù)合物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力遵循以下順序：熱處理組＞熱處理聯(lián)合超聲處理組＞游離分子。ABTS陽(yáng)離子自由基屬于親水性自由基，通常用于確定抗氧化劑屬于氫原子轉(zhuǎn)移還是單電子轉(zhuǎn)移[13]。MC與活性分子均以疏水作用結(jié)合，其親水基團(tuán)不受影響，因此活性分子的ABTS陽(yáng)離子自由基清除力沒(méi)有被削弱。熱處理下，MC與活性分子結(jié)合作用較強(qiáng)，更有利于活性分子的親水基團(tuán)發(fā)揮ABTS陽(yáng)離子自由基清除活力。此外，超聲處理對(duì)MC空間結(jié)構(gòu)的影響也是導(dǎo)致ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力低于熱處理的原因之一。三元復(fù)合物的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力變化趨勢(shì)與二元復(fù)合物一致，且顯著高于二元復(fù)合物，證明MC可以同時(shí)高效結(jié)合多個(gè)活性分子，且對(duì)活性分子的抗氧化性無(wú)拮抗作用，是一種性能較好的天然載體。

圖7 熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理下復(fù)合物的DPPH自由基（A）和ABTS陽(yáng)離子自由基（B）清除能力Fig.7 DPPH radical (A) and ABTS radical cation (B) scavenging capacity of complexes under heat treatment or combined heat and ultrasonic treatment

2.4 復(fù)合物的體外模擬消化性分析

因熱處理?xiàng)l件下MC對(duì)活性分子的結(jié)合作用較強(qiáng)，選擇熱處理下的復(fù)合物為樣品，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其不同時(shí)間段的模擬胃腸消化產(chǎn)物。如圖8所示，游離MC的電泳條帶主要為α-酪蛋白和β-酪蛋白[32]。SGF中消化120 min時(shí)，少量MC被SGF中的胃蛋白酶消化。二元、三元復(fù)合物在SGF中也表現(xiàn)出類似的消化結(jié)果，說(shuō)明小分子結(jié)合不影響MC在SGF中的消化速率。

圖8 復(fù)合物體外模擬消化產(chǎn)物的電泳圖Fig.8 Electropherogram of digestion products of complexes during simulated gastrointestinal digestion

在SIF中，游離MC的α-酪蛋白和β-酪蛋白含量隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，消化240 min后被完全水解。二元復(fù)合物在SIF中的消化趨勢(shì)與游離MC一致。相較于PC-MC與Chl-MC，Cat-MC復(fù)合物在各時(shí)間段的消化程度較低，這可能是因?yàn)镃at分子體積較小，其與胰蛋白酶的接觸面積較大，且具有潛在的胰蛋白酶抑制性，因此降低了MC的消化速率[33]。

就三元復(fù)合物而言，其消化性強(qiáng)于二元復(fù)合物，表明三元復(fù)合物的形成對(duì)MC的空間結(jié)構(gòu)影響大于二元復(fù)合物，多個(gè)活性分子的結(jié)合打開(kāi)了MC的肽鏈，更有利于酶與其接觸，加劇了MC的水解。因此，多個(gè)活性分子的結(jié)合改善了MC的消化性。

3 結(jié)論

MC可自發(fā)與PC、Cat、Chl或其二元組合物形成穩(wěn)定的二元或三元復(fù)合物。在熱處理或熱處理聯(lián)合超聲處理下，MC與PC、Cat、Chl的結(jié)合作用為疏水相互作用，且MC對(duì)Chl的結(jié)合作用最強(qiáng)。熱處理?xiàng)l件下，當(dāng)MC與PC、Cat、Chl結(jié)合后，另一個(gè)分子以范德華力和氫鍵與MC結(jié)合，且298 K下第1個(gè)分子的結(jié)合提升了第2個(gè)分子與MC的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。然而，熱處理聯(lián)合超聲處理卻降低了第2個(gè)分子的結(jié)合常數(shù)。MC結(jié)合PC、Cat、Chl或其二元組合物后，噴干物形貌并未發(fā)生顯著變化。此外，PC、Cat、Chl的結(jié)合提高了MC的熱穩(wěn)定性。

熱處理和熱處理聯(lián)合超聲處理對(duì)PC/Cat/Chl-MC二元及三元復(fù)合物的抗氧化性影響規(guī)律不同。熱處理改善了復(fù)合物的ABTS陽(yáng)離子自由基清除力，但削弱了其DPPH自由基清除活性；超聲處理的作用結(jié)果與熱處理相反。然而，兩種處理?xiàng)l件下，三元復(fù)合物的抗氧化性均高于二元復(fù)合物。Cat的結(jié)合降低了MC在SIF中的消化性，但二元活性分子的同時(shí)結(jié)合對(duì)MC的SIF消化性具有改善作用。

綜上所述，MC對(duì)多種分子表現(xiàn)出較高的親和性，可實(shí)現(xiàn)多種活性分子的同時(shí)負(fù)載，且不影響結(jié)合常數(shù)，也不會(huì)對(duì)活性分子的抗氧化性產(chǎn)生拮抗作用，是一種性能優(yōu)異的天然納米級(jí)活性分子載體，在功能食品設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)方面具有潛在的應(yīng)用前景。