子癇前期孕婦外周血、胎盤組織中信號肽-CUB-表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白2的表達(dá)及意義

蔡燕麗 朱錦明 張躍輝 欒曉梅 彭鳳云 李青 杜長江

1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院（江蘇徐州 221006）；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州婦幼保健院（江蘇徐州 221009）；3黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（哈爾濱 150040）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種常見的、具有潛在致命性的妊娠多系統(tǒng)疾病，其特征是妊娠20 周后出現(xiàn)新發(fā)的高血壓和蛋白尿，或者在沒有蛋白尿的情況下出現(xiàn)新發(fā)的PE 相關(guān)體征［1］，該疾病在所有妊娠孕婦中的發(fā)病率為2%～7%，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒發(fā)病率和病死率的主要原因［2］。目前普遍認(rèn)為＜34 周發(fā)病者為早發(fā)型PE，≥34 周者發(fā)病者為晚發(fā)型PE［3］。PE 病因復(fù)雜，其機(jī)制尚未闡明。SCUBE2 是一個進(jìn)化保守的小基因家族的第二個成員，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和非內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)［4］。LIN 等［5］研究發(fā)現(xiàn)SCUBE2 可與內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）相互作用促進(jìn)血管增殖、遷移。VEGFR2 是促血管生成的主要受體［6］，已被證明其與VEGF 相互作用，介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和假性血管形成［7］導(dǎo)致胎盤重鑄障礙。目前，SCUBE2 在妊娠相關(guān)疾病中鮮有研究，其是否通過VEGFR2 通路參與PE 的發(fā)生尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道，本研究將通過對PE 孕婦及正常足月分娩孕婦的血清和胎盤組織中SCUBE2 及VEGFR2 進(jìn)行檢測，研究其表達(dá)水平差異與PE 之間的關(guān)系，分析SCUBE2 與VEGFR2 之間的關(guān)系，討論SCUBE2在PE 發(fā)生發(fā)展中的可能作用，為PE 的發(fā)病機(jī)制提供新的思路及治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2021 年6 月至2022 年6 月于醫(yī)院住院分娩的PE 孕婦共58 例。根據(jù)其發(fā)病孕周將PE 組劃分為早發(fā)型PE 組（發(fā)病孕周＜34 周）和晚發(fā)型PE 組（發(fā)病孕周≥34 周）；并以同期足月妊娠分娩的孕婦30 例設(shè)定為對照組。三組孕婦的孕次、產(chǎn)次、年齡和BMI 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），分娩孕周比較，早發(fā)型PE 組分娩孕周早于晚發(fā)型PE 組及對照組（P＜0.05），晚發(fā)型PE 組與對照比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床確診為PE 孕婦且臨床資料完整；產(chǎn)婦及其家屬均自愿簽署知情同意書；妊娠20～40 周；單胎自然受孕患者；無吸煙、飲酒不良嗜好。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除既往高血壓、糖尿病病史；輔助生殖及多胎妊娠；有心、肝、腎、內(nèi)分泌疾病及自身免疫性疾??；其他妊娠合并癥或并發(fā)癥；精神異常。所有的研究對象均征得本人書面同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

表1 三組孕婦一般情況比較Tab.1 Comparison of the generral situation of three groups of pregnant women ±s

表1 三組孕婦一般情況比較Tab.1 Comparison of the generral situation of three groups of pregnant women ±s

注：與早發(fā)型PE 組比較，*P＜0.05

組別對照組早發(fā)型PE 組晚發(fā)型PE 組F 值P 值例數(shù)30 30 28年齡（歲）29.90 ± 3.35 31.30 ± 4.29 30.04 ± 5.26 0.939 0.395 BMI（kg/m2）27.71 ± 3.43 29.01 ± 3.19 29.30 ± 3.37 1.901 0.156孕次［M（P25，P75）］2.00（2.00）2.00（1.50）3.00（3.00）產(chǎn)次［M（P25，P75）］2.00（1.00）1.00（1.00）1.00（1.00）0.476 0.407分娩孕周39.00 ± 1.06*33.51 ± 2.10 38.29 ± 1.05*118.869 0.000

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)PE 診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》［3］。

1.3 ELISA 檢測三組孕婦血清中SCUBE2、VEGFR2的表達(dá)量均于入院治療前抽取肘靜脈血4 mL，靜置20～30 min，3 800 r/min 離心10 min，留取血清，標(biāo)記后存放于-80 ℃冰箱，使用ELISA 法（試劑盒購江蘇酶標(biāo)公司）測定血清樣本中SCUBE2 和VEGFR2 表達(dá)水平，使用Rayto RT-6100 酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜公司）在450 nm 波長下測定吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各樣品對應(yīng)濃度值。

1.4 免疫組化SP 法檢測三組孕婦胎盤組織中SCUBE2 蛋白表達(dá)水平及定位免疫組化法檢測胎盤組織中SCUBE2 蛋白，一抗為兔抗人單克隆SCUBE2 抗體（英國Abcam 公司）按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。使用倒置顯微鏡（日本Olympus公司）進(jìn)行觀測玻片，以無著色或與背景顏色一致的為陰性細(xì)胞，胞膜、胞質(zhì)及細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，按照FROMOWITZ 等［8］綜合計分法進(jìn)行半定量分析，根據(jù)陽性細(xì)胞的染色范圍和強(qiáng)度確定蛋白的表達(dá)水平。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定三組孕婦胎盤組織中SCUBE2、VEGFR2 mRNA的表達(dá)量Trizol 法提取總的RNA，測量其濃度后并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（試劑購自日本TaKaRa 公司），隨后使用LightCycler480 System（瑞士Roche 公司）進(jìn)行Real Time PCR 反應(yīng)（試劑購自日本TaKaRa 公司）。目的基因SCUBE2 引物序列，上游：5＇-GACGAGTGCCTGGAGAACAATGG-3＇，下游：5＇-GCAGATGTGACTACAGCCGTGATC-3＇；目的基因VEGFR2 引物序列，上游：5＇-GACAGTGGTATGGTTCTTGCCTCAG-3＇，下游：5＇-GTGGTGTCTGTGTCATCGGAGTG-3＇。目的基因擴(kuò)增40 個循環(huán)，以甘油醛-3 磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，計算相對表達(dá)量，用2-△△CT法計算各組表達(dá)水平的倍數(shù)的差異。

1.6 Western blot 法檢測胎盤組織中SCUBE2、VEGFR2 蛋白量表達(dá)取80 mg 胎盤組織，加入800 μL RIPA 裂解液及8 μL 蛋白酶抑制劑（10∶100∶1），-4 ℃條件下離心20 min，取上清液，BCA法檢測蛋白濃度，使用7.5% 雅酶快速制膠劑制膠，電泳、電轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶室溫封閉，加入SCUBE2 單抗（1∶500）（英國Abcam 公司）、VEGFR2 單抗（1∶500）（英國Abcam 公司）4 ℃搖床孵育過夜，洗膜3 次，加入二抗（1∶2 000）孵育，洗滌后使用ChemiDocM 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）進(jìn)行曝光，以β-tubulin 作為內(nèi)參，使用Image J進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS 23.0資料分析，正態(tài)分布資料采用（）表示，在多個樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料使用（%）或例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson分析法進(jìn)行相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。繪圖使用Graphpad prism 8 軟件。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測結(jié)果PE組孕婦血清中的SCUBE2和VEGFR2表達(dá)量低于對照組（P＜0.05），其中早發(fā)型PE組表達(dá)量明顯低于晚發(fā)型PE組（P＜0.000 1），見表2。

表2 三組孕婦血清中SCUBE2、VEGFR2 的表達(dá)量Tab.2 Expression levels of SCUBE2 and VEGFR2 in serum of three groups of pregnant women ±s，pg/mL

表2 三組孕婦血清中SCUBE2、VEGFR2 的表達(dá)量Tab.2 Expression levels of SCUBE2 and VEGFR2 in serum of three groups of pregnant women ±s，pg/mL

注：*對照組和早發(fā)型PE 組相比較；#早發(fā)型PE 組和晚發(fā)型PE 組相比較；△晚發(fā)型PE 組與對照組相比較

組別對照組早發(fā)型PE 組晚發(fā)型PE 組F 值P 值SCUBE2 蛋白表達(dá)量14.32 ± 2.43 9.94 ± 1.96 12.73 ± 2.34 29.14＜0.000 1 P 值＜0.000 1*＜0.000 1#＜0.05△VEGFR2 蛋白表達(dá)量784.79 ± 148.60 486.19 ± 122.64 667.15 ± 156.09 33.24＜0.000 1 P 值＜0.000 1*＜0.000 1#＜0.05△

2.2 PE 孕婦血清中SCUBE2、VEGFR2 表達(dá)水平相關(guān)性分析PE 孕婦血清中SCUBE2、VEGFR2 在孕婦血清中表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.602 2，P＜0.000 1）。見圖1。

圖1 PE 組血清中SCUBE2 和VEGFR2 表達(dá)水平相關(guān)性散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plot of correlation between serum SCUBE2 and VEGFR2 expression levels in preeclampsia pregnant women

2.3 免疫組化結(jié)果SCUBE2 蛋白主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞及胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞中。3 組孕婦胎盤中SCUBE2 蛋白相對表達(dá)量比較，PE 組胎盤組織表達(dá)量低于對照組，早發(fā)型PE 組蛋白表達(dá)量低于晚發(fā)型PE 組，見表3、圖2。

圖2 SCUBE2 蛋白在胎盤中的表達(dá)（DAB 染色，× 400）Fig.2 The expression of SCUBE2 in placental tissues（DAB staining，× 400）

表3 三組孕婦胎盤中SCUBE2 的表達(dá)量Tab.3 Expression of SCUBE2 in placental tissues of three groups pregnant women 例（%）

2.4 三組孕婦胎盤組織中SCUBE2、VEGFR2 蛋白及mRNA 表達(dá)水平PE 組胎盤組織中SCUBE2、VEGFR2 蛋白及mRNA 表達(dá)低于對照組（P＜0.05），早發(fā)型PE組表達(dá)水平低于晚發(fā)型PE組（P＜0.05）。見圖3、表4、5。

圖3 三組孕婦胎盤組織SCUBE2 及VEGFR2 蛋白表達(dá)量Fig.3 The expression of SCUBE2 and VEGFR2 protein in placental tissues of three groups of pregnant women

表4 三組孕婦胎盤中SCUBE2 、VEGFR2 mRNA 表達(dá)量Tab.4 The expression levels of SCUBE2 mRNA and VEGFR2 mRNA in placental tissues of three groups of pregnant women ±s

表4 三組孕婦胎盤中SCUBE2 、VEGFR2 mRNA 表達(dá)量Tab.4 The expression levels of SCUBE2 mRNA and VEGFR2 mRNA in placental tissues of three groups of pregnant women ±s

注：*對照組與早發(fā)型PE 組相比較；#早發(fā)型PE 組與晚發(fā)型PE組相比較；△晚發(fā)型PE 組與對照組相比較

組別對照組早發(fā)型PE組晚發(fā)型PE組F值P值SCUBE2mRNA表達(dá)水平0.95±0.35 0.36±0.23 0.64±0.23 34.11＜0.001 P值＜0.001*＜0.001#＜0.001△P值＜0.001*＜0.001#＜0.050△VEGFR2mRNA表達(dá)水平1.22±0.43 0.35±0.19 0.90±0.49 37.50＜0.001

表5 三組孕婦胎盤中SCUBE2 及VEGFR2 蛋白表達(dá)水平Tab.5 The expression of SCUBE2 and VEGFR2 protein in placental tissues of three groups of pregnant women ±s

注：*對照組與早發(fā)型PE 組相比較；#早發(fā)型PE 組與晚發(fā)型PE組相比較；△晚發(fā)型PE 組與對照組相比較

組別對照組早發(fā)型PE 組晚發(fā)型PE 組F 值P 值SCUBE2 蛋白表達(dá)水平1.04 ± 0.23 0.67 ± 0.22 0.83 ± 0.18 23.25＜0.001 P 值＜0.001*＜0.050#＜0.001△VEGFR2 蛋白表達(dá)水平0.99 ± 0.32 0.52 ± 0.25 0.72 ± 0.25 22.06＜0.001 P 值＜0.001*＜0.050#＜0.001△

3 討論

PE 是以高血壓和尿蛋白為特征的全身性血管相關(guān)性疾病，幾乎可以影響到每一個器官及系統(tǒng)，導(dǎo)致子癇前期相關(guān)不良并發(fā)癥和妊娠結(jié)局，如：子癇、HELLP 綜合征、肝腎功能損傷、心腦血管風(fēng)險、胎盤早剝、胎兒生長受限、早產(chǎn)、死胎等。目前PE發(fā)病原因仍有爭議，但臨床和病理研究表明胎盤是該綜合征發(fā)病機(jī)制的核心。正常妊娠時，血管內(nèi)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞（enEVT）進(jìn)入子宮螺旋小動脈并逐漸替代血管壁內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，使高阻力低血容量血管轉(zhuǎn)變?yōu)榈妥枇Ω哐萘康难?，以確保母體與胎兒之間的物質(zhì)營養(yǎng)交換正常進(jìn)行，而在PE 孕婦胎盤中，絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入過淺，導(dǎo)致胎盤血液循環(huán)障礙、釋放促炎因子、母體炎癥引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、通透性增加、及釋放抗血管生成因子進(jìn)入循環(huán)，如可溶性FMS樣酪氨酸激酶1（sFlt-1），最終導(dǎo)致PE 的發(fā)生、發(fā)展［9-10］。PE 目前尚無治愈方法，病情無法控制時只能終止妊娠，這也是該疾病早產(chǎn)率及胎新生兒死亡率高的原因之一。因此，為預(yù)測和預(yù)防先兆子癇發(fā)生尤為重要。

信號肽-CUB-表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白2（SCUBE2）是一種分泌型、膜相關(guān)的多結(jié)構(gòu)域糖蛋白，該基因編碼約1 000 個氨基酸的多肽分子，包括5 個可識別的基因序列：即1 個氨基末端的信號肽序列、9 個串聯(lián)的EGF 樣重復(fù)序列、一個間隔區(qū)、3 個富含半胱氨酸的殘基及1 個羧基末端的CUB結(jié)構(gòu)域［11］。SCUBE2 具有多種功能，如抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力、參與胚胎發(fā)育及調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨形成及分化［12-14］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中的SCUBE2 可通過EGF 樣重復(fù)序列和CUB 結(jié)構(gòu)域結(jié)合VEGF 和VEGFR2 形成一個復(fù)合體，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR2 的磷酸化和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)血管的生成［11］，該基因過表達(dá)可導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥、動脈粥樣硬化及腫瘤血管遷移［15-17］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種多功能因子，在妊娠狀態(tài)中，VEGF 被認(rèn)為是由滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的促血管生成因子，在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移，調(diào)控血管生成、滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、浸潤和分化、維持血管內(nèi)皮功能方面均有重要作用［18］。VEGFR2 是VEGF 的受體之一，具有強(qiáng)大的絡(luò)氨酸激酶活性，研究證明VEGF 與VEGFR-2 相結(jié)合對血管內(nèi)皮健康非常重要［19］。劉蕾等［20］研究發(fā)現(xiàn)VEGFR2 表達(dá)于胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞，并可能通過影響胎盤血管功能參與胎兒功能生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）的發(fā)生發(fā)展。因此我們提出假設(shè)，SCUBE2 是否可能與VEGFR2 相互作用影響胎盤正常血管形成和發(fā)育參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。

根據(jù)免疫組化結(jié)果顯示SCUBE2 蛋白主要定位于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞及胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞中，其在蛋白及mRNA 水平上均檢測出SCUBE2、VEGFR2 表達(dá)水平在PE 組中低于對照組。同時，我們還觀察到PE 組的胎盤病理切片中缺乏生理轉(zhuǎn)化的厚肌壁官腔、纖維素樣壞死、蛻膜血管動脈粥樣硬化及胎盤絨毛合體結(jié)節(jié)形成并明顯增多。因此，推測SCUBE2 蛋白可能與VEGFR2 蛋白具有相似功能及作用，影響胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與分化，影響正常胎盤血管形成和發(fā)育，SCUBE2 降低可能導(dǎo)致胎盤重鑄不足。本研究結(jié)果中早發(fā)型PE 組SCUBE2、VEGFR2 在胎盤組織表達(dá)水平低于晚發(fā)型PE 組，這可能與PE 在不同發(fā)病階段胎盤病變程度差異相關(guān)。ELISA 檢測結(jié)果顯示PE 組孕婦血清中SCUBE2 及VEGFR2 的表達(dá)水平低于對照組，其中早發(fā)型PE 血清SCUBE2、VEGFR2 表達(dá)水平低于晚發(fā)型PE 組，與胎盤組織中表達(dá)水平同步降低。此外，PE 組孕婦血清中SCUBE2 蛋白與VEGFR2 蛋白相關(guān)性分析顯示，兩者呈正相關(guān)。因此，推測胎盤中的SCUBE2 與VEGFR2 表達(dá)降低可能引起胎盤假性血管生成不完整，繼而使胎盤缺血缺氧導(dǎo)致胎盤釋放抗血管生成因子抑制血清中SCUBE2 及VEGFR2 表達(dá)，由此形成一個惡性循環(huán)，導(dǎo)致PE 疾病持續(xù)加重。此過程目前尚缺乏有效論證，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，PE 孕婦血清和胎盤中SCUBE2 和VEGFR2 表達(dá)量均降低，且血液中蛋白表達(dá)量相關(guān)性分析提示SCUBE2 與VEGFR2 之間為正相關(guān)。我們有理由懷疑在PE 疾病中，SCUBE2 在孕婦體內(nèi)表達(dá)量降低可能參與了PE 的發(fā)生、發(fā)展，并可能與VEGFR2 共同作用調(diào)節(jié)胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化。PE 病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，該實(shí)驗(yàn)僅淺層次提出了SCUBE2 可能影響胎盤血管侵襲和發(fā)育參與PE 的發(fā)展，其在PE 的胎盤血管上的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。此外，免疫組化顯示SCUBE2 還表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞中，SCUBE2是否還通過其他通路影響PE 的發(fā)生發(fā)展有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)樣本含量少，且未對患病嚴(yán)重程度進(jìn)行分析，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量及更深層次探究該蛋白在PE 影響。