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    燕窩真?zhèn)舞b別研究進展綜述

    2023-07-29 10:20:02邱爽張新科孔文茹王姝麒王東亮
    食品工業(yè) 2023年7期
    關(guān)鍵詞:鑒別方法唾液酸燕窩

    邱爽 ,張新科,孔文茹,王姝麒,王東亮

    1.北京小仙燉生物科技有限公司(北京 100020);2.河北省燕窩鮮燉技術(shù)創(chuàng)新中心(廊坊 065700);3.山東大學(xué)藥學(xué)院(濟南 250012)

    燕窩(Edible Bird’s Nest,EBN)原產(chǎn)于東南亞,是由雨燕科金絲燕屬(Aerodramus)、侏金絲燕屬(Collocalia)和雨燕屬(Apus)在繁殖季節(jié)分泌的唾液與羽毛、草等混合,粘合在墻壁或者洞穴上而鑄成的“育兒床”,用于產(chǎn)卵及孵育雛燕[1]。能夠產(chǎn)燕窩的金絲燕主要分布在印度尼西亞、馬來西亞、泰國、緬甸、越南、菲律賓、柬埔寨和中國南部[2]。印度尼西亞生態(tài)環(huán)境適宜,燕屋應(yīng)用成功,是全球最大的燕窩輸出國,年產(chǎn)量約為全球的85%。

    燕窩性平味甘,歸肺經(jīng)、胃經(jīng)、腎經(jīng),在我國歷史悠久,早在明代就有燕窩記載。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)燕窩含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、唾液酸和微量元素等[3-4],具有抗病毒、抗氧化、抗神經(jīng)退行性疾病及皮膚保護等多種生物功能[5-6]。中國是世界上最大的燕窩消費國,也是每年全球最大的燕窩進口國。僅2021年1月至6月,中國從印尼和馬來進口了約170 t燕窩[2]。燕窩行業(yè)附加值高,供小于求,1 kg燕窩在我國的售價高達6 000美元,不少商家通過摻假來牟取高額利潤,以次充好現(xiàn)象更是屢屢發(fā)生[7]。消費者們并不能很好地對燕窩真?zhèn)渭笆欠駬郊龠M行鑒別。建立一套高效、便捷、準確的燕窩真?zhèn)舞b定方法一直是燕窩行業(yè)的一大難題。針對目前國內(nèi)外燕窩摻假方式及真?zhèn)舞b別方法進行了匯總,為后續(xù)燕窩真?zhèn)舞b別研究提供一定的參考。

    1 目前燕窩常見的摻假方法

    燕窩摻假分為完全造假和部分摻假兩種情況。前者是產(chǎn)品中完全不含有燕窩,將瓊脂、魚鰾、卡拉膠、豬皮、銀耳等摻假物與調(diào)和劑混合制成;后者制成的產(chǎn)品中含有燕窩,為了提高產(chǎn)品重量、風(fēng)味、口感或賣相,在燕窩中混入瓊脂、銀耳、豬皮、蛋清、葡萄糖、卡拉膠等[7-9]。燕窩常見摻假物分為兩類。第一類為魚鰾、豬皮、卡拉膠、珊瑚粉、瓊脂和銀耳等固體,它們附著在燕窩表面,可以利用顯微鏡觀察到表面結(jié)構(gòu)的差異。第二種是水溶性物質(zhì),如糖類(葡萄糖、蔗糖)、多肽(水解膠原蛋白)和鹽,在干燥時很容易被燕窩內(nèi)部吸附形成復(fù)合物,使其難以目視檢測[7]。

    除了人為摻假外,還有許多商家為了牟取高額利潤,混淆燕窩產(chǎn)區(qū)、品種以及生產(chǎn)方式。人們認為天然洞燕的營養(yǎng)價值高于屋燕,燕窩市場便出現(xiàn)了大量將白燕熏制染色成血燕的現(xiàn)象,特別是2011年發(fā)生的“血燕”事件,此次食品安全事件的根本原因就是不法商家采購便宜的白燕窩熏制、發(fā)酵、染色加工成血燕,這給燕窩行業(yè)帶來了嚴重打擊,直到近年才有所恢復(fù)[10]。

    燕窩摻假事件層出不窮,燕窩行業(yè)良莠不齊,使得消費者對燕窩產(chǎn)生信任危機。多數(shù)消費者難以對燕窩真?zhèn)芜M行鑒別,開發(fā)有效、快速的燕窩真?zhèn)舞b別方法一直是重要的研究課題。

    2 燕窩真?zhèn)舞b別檢測方法

    2.1 遺傳學(xué)方法

    蛋白質(zhì)分析和DNA分析是食品溯源和真實性分析最常見的方法。DNA比許多蛋白質(zhì)耐熱,穩(wěn)定性高,這使其成為區(qū)分和鑒定食品成分的首選分子。

    在燕窩真?zhèn)我约把喔C基源鑒別中,針對特定核酸序列鑒定可以提高檢測的準確度,常見的有線粒體細胞色素b(Cytb)基因和NADH脫氫酶亞基2(ND2)基因。Lin等[11]基于Cytb基因序列,構(gòu)建了用于燕窩樣本遺傳鑒定的系統(tǒng)發(fā)育樹。何國林等[12]設(shè)計了一條特異靶向Taq Man探針,通過鑒定金絲燕屬與雨燕屬Cytb基因進行燕窩的真?zhèn)舞b別。在該類研究中,DNA的提取效率是實驗的關(guān)鍵,研究表明異硫氰酸胍法是燕窩DNA的最佳提取方法[13],特定序列的檢測降低了全基因檢測中可能出現(xiàn)的假陽性誤差。DNA分析用于燕窩真?zhèn)舞b別更準確,可實現(xiàn)燕窩的相對定量。然而DNA技術(shù)操作繁瑣,應(yīng)用于燕窩流通中的真?zhèn)舞b別還存在一定的局限。

    2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

    ELISA具有免疫反應(yīng)的特異性和酶標記物檢測的高敏度雙重優(yōu)勢。豬明膠是食用燕窩中的常見摻假物,為了快速檢測燕窩中的豬明膠,研究針對豬種特異性氨基酸序列的α2 Ⅰ型膠原(pAb 1、pAb 2)與α1 Ⅰ型膠原(pAb 3)鏈建立了競爭性間接ELISA反應(yīng),該技術(shù)能夠檢測到樣品中至少0.05%的豬明膠[14]。對比3種ELISA反應(yīng),pAb 3鏈反應(yīng)穩(wěn)定且未與蛋清發(fā)生交叉反應(yīng),更適合于燕窩中豬明膠的檢測[15]。除了設(shè)計摻假物的特異性抗體外,還可以針對燕窩特定成分進行ELISA反應(yīng)。唾液酸糖蛋白是燕窩中唾液酸的主要載體,由106和128 kda蛋白組成。Zhang等[16-17]利用夾心ELISA法制備了兩種抗特征性唾液酸糖蛋白單克隆抗體,并用Western印跡法檢測,優(yōu)化后的ELISA條件IC50僅為1.5 ng/mL。ELISA的特異性強,但受到摻假物種類的限制,針對不同的燕窩摻假物需篩選制備出不同的抗體。

    2.3 光譜法

    燕窩中的唾液酸與酸性茚三酮能形成穩(wěn)定物質(zhì),利用紫外光譜法(Ultraviolet Spectrophotometry,UV)檢測時在470 nm處有最大吸收峰[18]。對于燕窩本身來說,真品燕窩在280 nm處有最大紫外吸收,而偽品無最大吸收峰[19]。核磁共振技術(shù)操作簡便、普適性高、異構(gòu)體分析能力強。高志亮[20]對比了燕窩及摻假物的1H-NMR譜圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)假燕窩在化學(xué)位移δ3.4~4.0未檢測到與唾液酸相似的共振峰,而真品燕窩能檢測到。然而單從指定成分的光譜結(jié)果衡量燕窩真?zhèn)尾⒉粶蚀_,更不能對摻假物的種類和含量做出準確的判別。擴大樣本量結(jié)合化學(xué)計量學(xué)建模是提高準確度的重要手段。Shi等[21]利用近紅外光譜和化學(xué)計量學(xué)建立了一種快速、簡單的燕窩真?zhèn)渭胺旨壵J證方法。研究從印尼、馬來和泰國共收集了80多種燕窩,制備了200個摻假燕窩,利用化學(xué)計量學(xué)提取與燕窩品質(zhì)相關(guān)的光譜特征,基于這些光譜特征建立的模型對燕窩真?zhèn)巍①|(zhì)量分級的識別率可達到90%以上,該方法通過擴大樣本量和來源建立了一套較為準確的鑒別模型。

    在光譜相關(guān)的鑒別方法上,傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)TIR)技術(shù)應(yīng)用于燕窩真?zhèn)舞b別在不斷發(fā)展。早在2001年,孫素琴等[22]首次將鉆石ATR探頭FTIR技術(shù)應(yīng)用于燕窩鑒別,研究發(fā)現(xiàn)各個燕窩紅外譜圖的峰形相似,但部分營養(yǎng)成分吸收峰的強度和位置存在差異,特別是蛋白質(zhì)、氨基酸和多糖。后續(xù)的研究大多利用燕窩及摻假物的FTIR譜圖、特征峰進行分析建模[23],然而此類模型在摻假物含量較低時判別不準確[8]。

    除了燕窩真?zhèn)舞b別外,光譜法還可用于血燕的區(qū)分。Cheng等[24]通過1H-NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)燕窩熏制后苯環(huán)發(fā)生改變,并將燕窩人工硝化過程中SERS指紋圖譜的變化歸因于氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)改變[25],這些研究證明了燕窩熏制過程導(dǎo)致氨基酸序列改變,從本質(zhì)上實現(xiàn)了對天然血燕和人工熏制血燕的識別。

    相比于遺傳學(xué)和蛋白學(xué),光譜技術(shù)樣品前處理和操作更簡單,通過擴大樣本量聯(lián)合化學(xué)計量學(xué)可以建立一套較為穩(wěn)定的燕窩真?zhèn)舞b別模型。然而該方法無法實現(xiàn)摻假物的定量,對于一些未知摻假原料不能做出準確的判斷,精準度不如其他鑒別方法。

    2.4 色譜法

    利用色譜技術(shù)進行燕窩真?zhèn)舞b別多集中在對特定成分定性或定量來區(qū)分燕窩中是否含有摻假物。燕窩中單糖組成是燕窩真?zhèn)舞b別的重要指標,Tung等[26]采用高效離子交換色譜-脈沖安培檢測器(High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)進行糖譜分析,最終將唾液酸相對含量(10.8%±0.76%)作為評估燕窩含量的指標。此外,真正的燕窩含有甘露糖、半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸,而多數(shù)假冒品不含[27]。利用氣質(zhì)聯(lián)機(Gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)、氣象色譜(Gas chromatography,GC)檢測燕窩中揮發(fā)性成分、氨基酸、脂肪酸組成也被用于燕窩真?zhèn)舞b別、產(chǎn)區(qū)溯源以及加工工藝的區(qū)分[28-30]。

    除單糖組成外,唾液酸含量也是鑒別燕窩真?zhèn)?、衡量品質(zhì)好壞的重要指標,液相色譜是檢測唾液酸最常用的方法。不同品種燕窩中唾液酸含量具有差異,如白燕中唾液酸含量為13%,血燕中為10%,而銀耳、豬皮、瓊脂等常見偽品中不含唾液酸[31-32]。唾液酸含量也可以用作燕窩等級劃分的標準,唾液酸含量在10%以上為A級燕窩,7%~10%為B級,5%~7%為C級[21]。該方法在一定程度上可以區(qū)分燕窩及摻有銀耳、豬皮等成分的摻假燕窩,然而市場上還有商家直接向燕窩中添加唾液酸或其他含有唾液酸的原料,在此類產(chǎn)品的檢測中以唾液酸為基準的鑒別方法便不準確。此外,現(xiàn)有研究中多認為唾液酸是燕窩的核心營養(yǎng)成分,但唾液酸只占燕窩的10%左右,只以唾液酸含量作為燕窩分級的標準過于片面。在燕窩的營養(yǎng)成分中,50%以上均為蛋白質(zhì),特征蛋白或肽段的篩選將成為燕窩真?zhèn)舞b別及分級的重要方向。

    基于以上研究方向,Wu等[33]篩選出了13個標記肽段用于區(qū)分白燕和草燕/摻假物,3個肽段區(qū)分草燕與白燕/摻雜物。特異性肽段的篩選可實現(xiàn)摻假物或燕窩的定量。Ma等[34]篩選出了9種來自摻雜物的特征肽段用于摻雜物的定量分析。類似的方法也被用來定量燕窩產(chǎn)品中瓊脂的含量,瓊脂是燕窩常見摻雜物,因其不吸收紫外,很難對燕窩中瓊脂含量進行檢測。Cheng等[35]開發(fā)了一種子寡糖標記法對瓊脂進行定性定量。研究利用LC-QTOF-MS檢測發(fā)現(xiàn)新瓊四糖信號豐度高且與標準瓊脂線性關(guān)系好,被選為檢測標記用于定性和定量分析,這種低聚物標記法可用于燕窩原料中摻有瓊脂產(chǎn)品的質(zhì)量控制,而且可以定量分析[35]?;谏V檢測的蛋白質(zhì)分析方法不僅可以準確地對燕窩及摻假物進行判別,重要的是可實現(xiàn)產(chǎn)品中燕窩及摻假物的定量,具有廣闊的發(fā)展前景。

    2.5 凝膠電泳法

    凝膠電泳常用于蛋白質(zhì)分析,典型的有聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)。燕窩往往被加工成長梭形、球形,如白燕條、宮燕餅、草燕等。早在1999年,胡珊梅等[36]就利用PAGE對燕窩及燕窩加工品進行區(qū)分,研究通過各實驗樣品在電泳圖譜上譜帶的條數(shù)以及深淺進行鑒別,證實了該方法區(qū)分燕窩及加工品的可行性。真燕窩比豬皮、瓊脂等燕窩偽品的特征圖譜更明顯,蛋白質(zhì)種類更多[31]。

    電泳技術(shù)也被用于燕窩產(chǎn)地及生產(chǎn)方式的區(qū)分,郭麗麗[8]采集了來自印尼和馬來的已知生產(chǎn)方式和產(chǎn)區(qū)的燕窩,利用蛋白條帶數(shù)和相對含量建立了產(chǎn)區(qū)和生產(chǎn)方式的判別模型,采用2-DE篩選出了不同生產(chǎn)方式和產(chǎn)地的燕窩差異蛋白點,為后續(xù)的質(zhì)譜分析提供一定的參考。SDS-PAGE結(jié)合多變量分析是鑒別燕窩地理來源和生產(chǎn)方式的一種可行方法,然而該方法的檢測精度受到建模時實驗樣本數(shù)量和覆蓋率大小的影響,應(yīng)通過擴大樣本量和樣本來源以驗證鑒別模型的穩(wěn)定性[37]。

    2.6 其他方法

    除上述方法外,還有一部分研究利用氨基酸分析儀、傳感器陣列、同位素等方法進行燕窩真?zhèn)舞b別。不同燕窩樣品以及摻假物在氨基酸組成和含量上都存在差異,如真品燕窩中不含羥脯氨酸和胱氨酸,偽品在氨基酸組成上和燕窩均不相同[38]。Eric等[39]首次將熱重分析(Thermogravimetry,TG)、微分熱重(Differential thermogravimetry,DTG)和差示掃描量熱分析(Differential scanning calorimetry,DSC)用于燕窩的快速鑒別。燕窩獨特的熱重分析和微分熱重分析曲線可作為燕窩真?zhèn)畏治鰳藴?,該方法只?~10 mg樣品,無需樣品預(yù)處理即可檢查燕窩中是否含有摻假物。

    表1 燕窩真?zhèn)舞b別技術(shù)的應(yīng)用

    Huang等[29]開發(fā)了一種由比色傳感器陣列、智能手機和多層網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)成的低成本智能系統(tǒng)鑒別和定量摻假燕窩,通過收集燕窩的揮發(fā)性成分特征和響應(yīng)信號,利用智能手機獲取圖像,該系統(tǒng)提供了一個實時、可靠的預(yù)測模型。隨后該團隊用同樣的方法識別燕窩的地理來源,使用PCA、HCA和聚類分析研究樣本組之間的相似性,該設(shè)備能夠識別未知燕窩的地理來源[40]。該技術(shù)特異性強,但同樣受到樣本量和樣品來源的影響,且并未實現(xiàn)摻假物的定量。

    3 結(jié)語與展望

    燕窩具有眾多保健功效,一直被認為是名貴的滋補品。然而,目前燕窩行業(yè)沒有規(guī)范的真?zhèn)舞b別標準,燕窩產(chǎn)品魚龍混雜,摻假現(xiàn)象頻頻發(fā)生,一直是燕窩行業(yè)的一大難題。此研究對燕窩常見的摻假物進行匯總,從遺傳學(xué)、ELISA、光譜學(xué)、色譜學(xué)、凝膠電泳學(xué)方向歸納了燕窩的真?zhèn)舞b別方法,并討論了每種方法的優(yōu)缺點,為燕窩行業(yè)質(zhì)量監(jiān)控體系提供參考。

    基因和蛋白層面的燕窩真?zhèn)舞b別比光譜法以及色譜法中特定成分的檢測更準確,然而金絲燕的基因、蛋白數(shù)據(jù)庫不完善,現(xiàn)有研究中燕窩的蛋白和肽段數(shù)據(jù)大部分不具有系統(tǒng)性[33],急需補充金絲燕及燕窩數(shù)據(jù)庫,找到真正的差異基因或蛋白。燕窩真?zhèn)舞b別常涉及專業(yè)儀器和方法,且需要一定的樣品前處理,不利于在進口或商品流通環(huán)節(jié)推廣。后續(xù)還需要開發(fā)準確、快捷的燕窩真?zhèn)舞b別方法,將其與成熟的計量學(xué)分析手段結(jié)合,適合于流通環(huán)節(jié)的使用。

    此外,燕窩造假事件導(dǎo)致的食品安全問題不容忽視。許多生產(chǎn)商為了延長即食燕窩的保質(zhì)期,使用次氯酸鹽漂白燕窩,抑制細菌生長。該過程會形成氨基脲,危害消費者的健康[47]。然而目前對漂白燕窩的鑒別方法十分有限,大多僅從味覺以及觸覺等感官層面上區(qū)分,沒有準確的衡量標準,仍需要更深入的研究。

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