超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定藤黃藥材中5種成分的含量

王超 郭春梅 程紅新 史延通

【摘要】目的：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法建立同時測定藤黃藥材中藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸5種成分的含量。方法：藤黃藥材經(jīng)75%乙醇水超聲提取，以ZORBAX Eclipse Plus C18為色譜柱、0.1%甲酸水-乙腈（30∶70，V/V）為流動相，流速為0.4 mL/min，柱溫為35℃；質(zhì)譜采用電噴霧離子（ESI）源、正離子掃描的多反應監(jiān)測（MRM）模式進行定量分析。結果：藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸分別在51.00～1020、3.749～74.98、8.675～ 173.5、60.00～1200、47.95～959 ng/mL（r均大于0.9990）的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。5種成分的平均加樣回收率分別為97.2%、98.1%、97.9%、97.0%、99.3%，RSD分別為2.1%、2.1%、2.3%、1.9%、2.1%。藤黃藥材中上述5種成分含量分別為22.98%～ 23.63%、1.28%～1.35%、2.78%～2.89%、26.13%～26.54%、22.29%～22.40%。結論：該方法操作簡便、準確、可靠，可用于藤黃藥材的多指標成分定量測定。

【關鍵詞】超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；藤黃；含量測定

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.03.033

Simultaneous Determination of Contents of 5 Components in Gamboge by UPLC-MS/MS

WANG Chao，GUO Chunmei，CHENG Hongxin，SHI Yantong

（Liaoning Institute for Drug Control，Liaoning Shenyang 110036，China）

Abstract：Objective：To establish an ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS / MS）method for the simultaneous determination of Gambogic acid，Gambogellic acid，Morellic acid，Isogambogic acid and Gambogenic acid in Gamboge. Methods：Gamboge was extracted by ultrasonic extraction with 75% ethanol-water. The determination was performed on ZORBAX Eclipse Plus C18 column with mobile phase consisted of 0.1 % formic acid solution-acetonitrile（30∶70，V/V）at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 35℃. For quantitation，the electrospray ionization（ESI）source was applied to carry out the positive ion scanning with multiple reaction monitoring（MRM）mode. Results：The linear range of Gambogic acid，Gambogellic acid，Morellic acid，Isogambogic acid and Gambogenic acid were 51.00～1020、3.749～74.98、8.675～173.5、60.00～1200、47.95～959 ng/ mL（all r≥0.9990）respectively，which showed a good linear relationship within the concentration range. The average recoveries were 97.2 %，98.1 %，97.9 %，97.0 %，99.3 %，and RSDs were 2.1%，2.1%，2.3%，1.9%，2.1%，respectively. The content of the above five components were 22.98%～23.63%、1.28%～1.35%、2.78%～2.89%、26.13%～26.54%、22.29%～22.40%，respectively. Conclusion：The method issimple，accurate and reliable，which could be used as the quantitative determination of multiple index components of Gamboge.

Key words：UPLC-MS/MS；gamboge；content determination

藤黃為藤黃科藤黃屬植物藤黃Garcinia hanburyi Hook. f.的樹脂[1]，最早出自《海藥本草》，現(xiàn)收錄于《中藥大辭典》[2]。藥理學研究表明，藤黃具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[3-7]，藤黃酸和新藤黃酸等成分是藤黃的主要成分[8-9]。目前，關于藤黃含量測定的研究文獻報道較少[10-11]，因此有必要建立一種藤黃中多組分的同時含量測定方法。

UPLC-MS/MS（超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜）法是以超高效液相作為分離系統(tǒng)、質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)的分析技術，該分析技術將超高效液相高分離度的優(yōu)勢與質(zhì)譜高靈敏度的特性相結合，具備分離能力強，分析時間短，靈敏度高，專屬性強等優(yōu)點，廣泛應用于中藥材的定性定量分析。本研究基于UPLCMS/MS技術建立了同時測定藤黃中藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸5種成分含量的方法，以期為藤黃藥材質(zhì)量控制及應用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Xevo TQ，美國Waters公司）；電子天平（XP26，瑞士METTLER TOLEDO公司）；超純水儀（Milli-Q Advantage A10，美國Millipore公司）；超聲清洗器（AS3120A，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2材料

藤黃酸（批號111966-201401）來自中國食品藥品檢定研究院；轉(zhuǎn)位藤黃酸（批號10594）來自上海詩丹德標準技術服務有限公司；藤黃酸B（批號J15 GB 150695）來自上海源葉生物科技有限公司；異藤黃酸（批號CFS202001）、新藤黃酸（批號CFS202002）來自武漢天植生物技術有限公司；藤黃對照藥材（編號S-01～S-05，批號121215-200602）來自中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇、色譜純乙腈、色譜純乙醇（德國Merck公司）；質(zhì)譜級甲酸（美國Sigma公司）。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1×100 mm 1.8-Micron）；流動相為0.1%甲酸水-乙腈（30∶70，V/V）；流速為0.4 mL/min；柱溫為35℃；進樣量為2μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子（ESI）源，正離子掃描，多反應監(jiān)測（MRM）模式；毛細管電壓為3.0 kV；脫溶劑溫度為550℃；錐孔氣流速為50 L/Hr；脫溶劑氣流速為850 L/Hr；碰撞氣流速為0.15 mL/min；碰撞氣為氬氣；其他參數(shù)見表1。

1.3.3對照品儲備液的制備

精密稱取藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解后，加甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度分別為藤黃酸510.0μg/ mL、轉(zhuǎn)位藤黃酸499.9μg/mL、藤黃酸B 399.9μg/mL、異藤黃酸479.4μg/mL、新藤黃酸433.7μg/mL的對照品儲備液。精密吸取上述各單一對照品儲備液適量，加甲醇配制為上述成分質(zhì)量濃度依次為10.20、0.7498、12.00、0.959、1.735μg/mL的混合對照品儲備液。

1.3.4供試品溶液的制備

取藤黃藥材約5 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加75%乙醇水80 mL，浸泡5 min，超聲處理10 min，放冷至室溫，用75%乙醇水定容，搖勻，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2結果與分析

2.1色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過全掃描模式確定母離子并對錐孔電壓進行優(yōu)化，通過不斷增加碰撞能量確定合適的子離子，最終確定5種成分各自的定量、定性離子對。由于待測成分復雜且成分中具有極性相近的同分異構體，因此比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸溶液、乙腈-乙酸銨溶液等多種流動相系統(tǒng)，結果發(fā)現(xiàn)，在流動相中加入適量的甲酸可以使同分異構體達到基線分離，因此選擇乙腈-甲酸溶液作為流動相。各化合物在正、負離子模式下均有響應，但當流動相系統(tǒng)中加入甲酸后，負離子模式響應明顯降低，因此選擇在正離子模式下進行檢測。

2.2樣品前處理條件的選擇

考察了甲醇、乙醇、乙腈三種不同提取溶劑及25%、50%、75%、100%四種不同溶劑質(zhì)量分數(shù)藤黃中各成分含量的影響，結果顯示，不同提取溶劑對提取效率的影響不大，當以75%乙醇作為提取溶劑時提取效果相對較好，因此選擇75%乙醇作為提取溶劑。比較直接超聲處理和浸泡后超聲處理兩種不同超聲提取方法，結果顯示，在相同提取時間下，浸泡后超聲提取液的含量高于直接超聲提取液，最終選用浸泡后超聲提取法。比較浸泡5、10、15 min和超聲10、15、20、30 min的結果，發(fā)現(xiàn)延長浸泡時間和提取時間對各成分的含量無顯著影響，最終選擇浸泡5 min后超聲提取10 min。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性

分別取空白溶劑、混合對照品溶液和供試品溶液適量，按照上述條件進樣測定，色譜圖見圖1。由圖1可知，待測成分的分離良好，空白無雜質(zhì)峰干擾，表明本方法專屬性較強。

2.3.2線性關系

分別精密吸取混合對照品儲備液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照上述條件進樣測定，以各成分的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸分析，得各組分的回歸方程和線性范圍，結果見表2，表明藤黃中各成分在相應的濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.3.3精密度試驗

取混合對照品溶液，按照上述條件連續(xù)進樣測定6次，計算5種成分峰面積的RSD值，結果顯示，藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸的RSD分別為1.7%、1.8%、2.2%、1.8%、2.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.4重復性試驗

稱取藤黃藥材粉末約5 mg，精密稱定，平行稱取6份，按上述操作制備供試品溶液，進樣測定，計算藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸的含量分別為23.31%、1.28%、2.88%、26.18%、22.08%，RSD分別為1.8%、2.8%、2.9%、1.8%、1.9%，表明方法重復性良好。

2.3.5定性試驗

稱取藤黃藥材粉末約5 mg，按上述操作制備供試品溶液，放置在4℃恒溫進樣器中，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結果顯示藤黃酸、轉(zhuǎn)位藤黃酸、藤黃酸B、異藤黃酸、新藤黃酸峰面積的RSD分別為1.9%、2.9%、2.8%、2.0%、3.0%，表明供試品溶液在4℃恒溫進樣器中放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6加樣回收試驗

取同一藤黃藥材約2.5 mg，精密稱定，平行稱取9份，分別精密加入混合對照品溶液，使加入各成分含量分別為供試品中相應成分含量的50%、100%、150%，按上述操作制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率，結果見表3，藤黃中5種成分的平均回收率為95.1%～101.6%，表明該方法準確度良好。

2.4樣品含量測定

精密稱取編號為S-01～S-04的藤黃藥材粉末約0.5 mg，按上述操作制備供試品溶液，進樣測定，采用外標法計算樣品中各成分的含量，結果見表4。

3結論

本研究建立了一種同時測定藤黃藥材中5種成分含量的UPLC-MS/MS方法。該法快速、簡便、準確度高，可為藤黃藥材質(zhì)量控制及應用提供參考依據(jù)可為藤黃藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

【參考文獻】

[1]鄭趙情，張莉，沈凱凱，等.藤黃的研究進展[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（7）：1180-1188.

[2]南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典（下冊）[M].第2版.上海：上?？茖W技術出版社，2006.

[3]張莉，蔡雙璠，孔思遠，等.中國藤黃屬植物的藥理作用研究進展[J].世界中醫(yī)藥，2016，1（7）：1189-1194.

[4]戰(zhàn)鶴，韓璐，何忠梅，等.藤黃有效成分的納米囊制備及其抗糖尿病活性評價[J].中國藥房，2022，33（9）：1075-1081.

[5]HATAMI E，JAGGI M，CHAUHAN S C，et al. Gambogic acid： a shining natural compound to nanomedicine for cancer therapeutics[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Reviews on Cancer，2020，1874（1）：188381.

[6]Liu Y，Chen Y，Lin L，et al. Gambogic Acid as a Candidate for Cancer Therapy：A Review[J]. International Journal of Nanomedicine，2020，Volume 15：10385-10399.

[7]李麗梅，周俊，婁潔，等.大苞藤黃中的一個新黃酮及其抗煙草花葉病毒活性[J].中國中藥雜志，2015，21（4）：4205-4207.

[8]周安，李慶林，彭代銀，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定中藥藤黃中橋環(huán)類化合物[J].藥學學報，2008（8）：838-842.

[9]楊虹，叢曉東，王崢濤.藥用藤黃化學成分的研究[J].中國藥學雜志，2008，43（12）：900-902.

[10]趙夢中，成志平，馬靜，等.HPLC法測定藤黃藥材中藤黃酸的含量[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2020，26（1）：32-34.

[11]林青華，林宏英，魏雅蕾，等.高效液相色譜法測定藤黃藥材中藤黃酸與新藤黃酸的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28（6）：25-28.

【作者簡介】

王超，女，1985年出生，副主任藥師，研究方向為藥品非法添加及化妝品理化檢驗。

郭春梅，女，1966年出生，高級工程師，研究方向為食品、化妝品檢驗。

程紅新，女，1966年出生，高級工程師，研究方向為食品、化妝品檢驗。

史延通，男，1975年出生，正高級研究員，研究方向為化妝品業(yè)務管理。

（編輯：侯睿琪）