花色苷對糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷拮抗作用研究

鐘紹金，韓珊穎，黃裕昌

（1.上海市第六人民醫(yī)院-?？谑泄强婆c糖尿病醫(yī)院 藥學(xué)部，海南 ?？?570300；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院 藥學(xué)部，海南 海口 570208；3.海南省藥物研究所，海南 ?？?570311）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是發(fā)生于眼部的糖尿病最常見的并發(fā)癥，其致盲具有不可逆性，是導(dǎo)致工作年齡人群視力損害的重要原因之一[1]。多項(xiàng)流行病學(xué)證據(jù)表明，DR 增加了糖尿病死亡率的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。糖尿病各種異常代謝產(chǎn)物積聚所生成的活性氮（RNS）和活性氧（ROS）誘導(dǎo)所致氧化應(yīng)激，是導(dǎo)致DR 的關(guān)鍵因素已被廣泛接受，氧化應(yīng)激通過直接或間接方式潛在攻擊視網(wǎng)膜神經(jīng)元，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，最終影響組織及器官正常功能[4-5]。因此，了解視神經(jīng)的變性機(jī)制有助于DR 的有效防治?；ㄇ嗨厥且活愄烊簧?，廣泛分布于植物界，花色苷是水果和蔬菜中最常見的花青素，由于其多種生物學(xué)益處，如神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、糖尿病預(yù)防等，對健康具有積極影響[6]。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，花色苷可改善多種眼部疾病，證實(shí)其具有視網(wǎng)膜保護(hù)作用，然而，目前尚無其在DR 方面的應(yīng)用及機(jī)制相關(guān)研究[7]。本研究選取植物界花色苷含量較高的藍(lán)莓進(jìn)行花色苷提取，評估花色苷對DR 大鼠的干預(yù)效果，探討花色苷對DR 的影響作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級健康SD 大鼠40 只，雄性，8 周齡，體質(zhì)量為（193.36±8.11）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK（湘）2016-0005。大鼠飼養(yǎng)在溫度為20 ～ 26℃，相對濕度為（55±15) %的安靜環(huán)境下，避免強(qiáng)光照射，按需飲水、攝食。實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)1 周基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

藍(lán)莓（購于本地水果市場）；鏈脲佐菌素（STZ，批號：S0185，美國Sigma 公司）；中性樹膠、HE 染色試劑盒、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）；小鼠抗β-actin（美國Sigma 公司）；一抗：兔Anti-SREBP1 抗體、兔Anti-SREBP2（美國abcam 公司）；山羊抗兔IgG 抗體、山羊抗小鼠IgG 抗體（北京中杉金橋生物有限公司）；BCA 蛋白測試試劑盒（上海碧云天公司）；2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，美國Sigma 公司）。

1.3 主要儀器

VFD-21S 型冷凍干燥儀（日本SHINKKU VD）；SFE-650M 型超臨界萃取儀［適安佳（北京）生物科技有限公司］；11BS25 型食品粉碎機(jī)（德國IKA 公司）；One Touch 型血糖儀（美國強(qiáng)生公司）；DKB-8A 型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BYR320 型低速冷凍離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；Synergy2 型多功能酶標(biāo)儀（美國BIOTEK 公司）；BK400 型全自動(dòng)生化分析儀（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Invitrogen E-Gel Imager 型凝膠成像儀（美國Thermo Scientific）；CytoFlex S 型流式細(xì)胞儀（美國Beckman 公司）。

2 方法

2.1 花色苷提取

采用CO2超臨界萃取法。提取步驟：取冷凍干燥好的藍(lán)莓適量，充分粉碎成漿，經(jīng)冷凍干燥后，過5 號篩（80 目），即得藍(lán)莓粉；稱取藍(lán)莓粉約5 g，置于萃取釜，加入7 倍量的80%乙醇密閉萃取60 min，萃取條件：溫度為40 ℃，壓力為28 MPa；萃取結(jié)束后，可得到花色苷；再經(jīng)大孔樹脂純化后，即得純度為78.6%的花色苷[8]。

2.2 分組、建模及給藥

首先，將40 只大鼠依體質(zhì)量進(jìn)行隨機(jī)分組，隨機(jī)抽取8 只為健康組，維持基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；其余32只為模型復(fù)制組，以高糖高脂的飼料連續(xù)喂養(yǎng)4 周后，提前禁食12 h，空腹稱重，于左腹下側(cè)單次注射STZ（溶媒為0.1 mol/L 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液），劑量為35 mg/kg，72 h 后經(jīng)尾部取血檢測空腹血糖（FPG），測得FPG 超過16.7 mmol/L 并持續(xù)至少10 d 則認(rèn)為建模成功。最后，32 只大鼠全部造模成功。持續(xù)飼養(yǎng)兩周后，通過熒光素眼底血管造影篩選出符合DR 診斷標(biāo)準(zhǔn)的大鼠27 只。隨機(jī)抽取DR 大鼠24 只，分為模型組8 只、低劑量組8 只和高劑量組8 只。低劑量組和高劑量組分別給予花色苷250 mg/kg、500 mg/kg 連續(xù)灌胃治療4 周，每日2 次。健康組、模型組以等劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，1個(gè)月后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

2.3 一般狀態(tài)觀察及FPG 測定

觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、攝食、飲水及尿量的變化情況；在空腹條件下（禁食至少12 h，但不禁水），經(jīng)尾靜脈取血，采用血糖儀檢測其FPG。

2.4 大鼠視網(wǎng)膜組織獲取

以2%戊巴比妥鈉溶液注射對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后取眼球，解剖鏡下除去角膜、玻璃體及晶狀體，獲取視網(wǎng)膜組織用于后續(xù)研究。

2.5 視網(wǎng)膜病理學(xué)檢查

以0.9%氯化鈉注射液漂洗視網(wǎng)膜組織，用濾紙吸干殘液，置于4%多聚甲醛中固定48 h，然后進(jìn)行脫水，常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋切片，切片厚度4 μm。將切片放入烘箱，65℃烘2 h，經(jīng)二甲苯浸泡20 min 后，依次放入100%、95%、90%、85%、75%及50%乙醇各處理5 min。蘇木精-伊紅（HE）染色順序：蘇木精染液5 s，1%鹽酸-乙醇30 s，純水返藍(lán)，伊紅染液5 s，再經(jīng)梯度脫水，以中性樹膠封片，通過顯微鏡檢查所有大鼠的視網(wǎng)膜病理情況。

2.6 大鼠視網(wǎng)膜活性氧簇（ROS）的檢測

取大鼠視網(wǎng)膜組織，以PBS 清洗3 次后，在室溫下用3%過氧化氫孵育處理10 min，再以10%山羊血清封閉處理60 min，滴加一抗，4℃存放過夜，第二天以PBS 清洗3 次，按（1 ∶200）滴加山羊抗兔并孵育60 min，再次用PBS 沖洗3 次后，加入DAPI 溶液孵育10 min，封片。置于熒光顯微鏡下，選擇最佳視野，檢測視網(wǎng)膜組織中ROS 表達(dá)水平。

2.7 視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平檢測

2.7.1 樣品制備 取視網(wǎng)膜組織，加入適量PBS，于冰上制成勻漿，以10 000 r/min 離心10 min，取上清液，存于-80 ℃冰箱中，待測[9]。

2.7.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測 取上述樣品20 μL，依次加入檢測SOD 的緩沖液、WST-8及反應(yīng)啟動(dòng)工作液，37 ℃條件下孵育30 min，設(shè)置檢測波長為450 nm，測定其吸光度A，計(jì)算抑制率。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算待檢樣品的SOD 酶活力。

2.7.3 丙二醛（MDA）檢測 取上述樣品100μL，依次加入蒸餾水、工作液適量，進(jìn)行水浴處理60 min，設(shè)定溫度為100 ℃，置于冰浴中冷卻，常溫下以10 000 r/min 離心10 min，留存上清液；吸取該上清液200 μL 加入玻璃比色皿中，所有樣品分別在600、532 及450 nm 處測定A值，計(jì)算ΔA=A測定-A空白。MDA 含量= 5×[12.9× （ΔA532-ΔA600）- 2.58 ×ΔA450]。

2.8 大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes-1 蛋白表達(dá)

采用蛋白印跡法檢測。取大鼠視網(wǎng)膜組織，用眼科鑷剪碎，加入裂解液進(jìn)行組織蛋白提取，并用BCA 蛋白測定試劑盒檢測總蛋白表達(dá)；加入loading buffer，混合均勻后放入沸水中處理5 min 致蛋白變性。取蛋白適量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，先以80 V 電泳2 h，之后以60 V 轉(zhuǎn)膜處理2 h，再以5%脫脂牛奶封閉2 h，隨后將條帶放入10 mL 稀釋1 000 倍的Notch1、Hes-1、三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）兔源一抗溶液中，4 ℃孵育12 h 后，用TBST 緩沖液清洗10 min，重復(fù)3 次，然后加入稀釋2 000 倍的羊抗兔二抗溶液中，以37 ℃孵育2 h，再次重復(fù)上述清洗步驟。最后，經(jīng)ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色處理，進(jìn)行蛋白電泳系統(tǒng)及凝膠成像。內(nèi)參物為GAPDH，用Image J 軟件分析各蛋白灰度值，蛋白相對表達(dá)量=待檢物灰度值/內(nèi)參物灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)及空腹血糖情況

給藥結(jié)束后，各組大鼠一般狀態(tài)出現(xiàn)明顯差異，其中，狀態(tài)最差為模型組。相較于模型組，花色苷低、高劑量組狀態(tài)明顯恢復(fù)，其FPG 均低于模型組（P＜0.05），且高劑量組FPG 改善更加明顯（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠一般狀態(tài)及空腹血糖情況（±s，n = 8）Tab.1 General status and fasting blood glucose of rats in each group（±s，n = 8）

表1 各組大鼠一般狀態(tài)及空腹血糖情況（±s，n = 8）Tab.1 General status and fasting blood glucose of rats in each group（±s，n = 8）

注：與健康組相比，*P ＜ 0.05；與模型組相比，#P ＜ 0.05；與低劑量組相比，△ P ＜0.05。表2、3 同。

組別一般狀態(tài)FPG/（mmol/L）健康組 行動(dòng)敏捷，飲食及二便正常，皮毛順滑有光澤。4.43±0.30模型組行動(dòng)遲緩，精神萎靡，多飲、多食、多尿現(xiàn)象明顯，皮毛枯黃無光澤，出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象。24.49±1.97*花色苷低劑量組精神狀態(tài)改善，行動(dòng)較模型組敏捷，多飲、多食、多尿現(xiàn)象明顯改善，皮毛略有光澤。16.83±1.78*#花色苷高劑量組精神狀態(tài)較好，行動(dòng)較低劑量組敏捷，多飲、多食、多尿現(xiàn)象明顯改善，皮毛有光澤。13.53±1.01*#△F 270.824 P＜0.001

3.2 大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)檢查

HE 染色可知，健康組大鼠的視網(wǎng)膜具有規(guī)則的組織結(jié)構(gòu)，層次明顯；與健康組視網(wǎng)膜相比，模型組組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，界限不明，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見明顯空泡型變化；相較于模型組，盡管花色苷低、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)仍顯疏松，但層次相對清晰，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯增加并基本規(guī)則排列，新生血管生成較少，見圖1。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)檢查（HE×400）Fig.1 Pathological examination of rat retina（HE×400）

3.3 各組大鼠視網(wǎng)膜的ROS 水平

與健康組大鼠相比，模型組的熒光強(qiáng)度更高，ROS 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，花色苷低劑量組和高劑量組熒光強(qiáng)度明顯更低，ROS水平明顯降低（P＜0.05），且高劑量組較低劑量組下降幅度更加明顯（P＜0.05），見圖2、3。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜的ROS 表達(dá)圖（×200）Fig.2 ROS expression in retina of rats in each group（× 200）

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜的ROS 水平Fig.3 ROS level of rat retina in each group

3.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織的SOD 活性和MDA 水平

與健康組大鼠相比，模型組的視網(wǎng)膜SOD 活性更低，MDA 水平更高（P＜0.05）；與模型組相比，花色苷低、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜SOD 活性更高，MDA 水平更低（P＜0.05），且高劑量組較低劑量組差異幅度更加明顯（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織的SOD 活性和MDA 水平（±s，n = 8）Tab.2 SOD activity and MDA level of rat retina in each group（±s，n = 8）

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織的SOD 活性和MDA 水平（±s，n = 8）Tab.2 SOD activity and MDA level of rat retina in each group（±s，n = 8）

組別SOD/（U/mg）MDA/（nmol/mg）健康組47.72±4.480.95±0.09模型組 19.67±2.01* 2.86±0.27*花色苷低劑量組 28.26±2.25*# 1.84±0.19*#花色苷高劑量組 36.25±2.48*#△ 1.46±0.09*#△F 129.061167.095 P＜0.001＜0.001

3.5 大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes-1 蛋白表達(dá)

與健康組大鼠相比，模型組及觀察組的視網(wǎng)膜Notch1、Hes-1 蛋白表達(dá)更低（P＜0.05）；相比于模型組大鼠，花色苷低、高劑量組的視網(wǎng)膜具有更高的Notch1、Hes-1 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)果見表3、圖4。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes-1 蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of Notch1 and Hes-1 protein in retina of rats in eachgroup

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes-1 蛋白表達(dá)（±s，n = 8）Tab.3 Expression of Notch1 and Hes-1 protein in retina of rats in each group（±s，n = 8）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes-1 蛋白表達(dá)（±s，n = 8）Tab.3 Expression of Notch1 and Hes-1 protein in retina of rats in each group（±s，n = 8）

組別Notch1Hes-1健康組1.06±0.111.13±0.15模型組 0.35±0.04* 0.28±0.03*花色苷低劑量組 0.57±0.05*# 0.55±0.05*#花色苷高劑量組 0.74±0.08*#△ 0.84±0.06*#△F 47.611 54.698 p＜0.001＜0.001

4 討論

本研究建模采用了高脂高糖聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)法，該法應(yīng)用廣泛、易于成模、操作簡單，可隨糖尿病病程發(fā)展而變化，與臨床DR 的相關(guān)病理改變十分相似，是DR 研究的理想動(dòng)物模型[10]。模型組大鼠出現(xiàn)DR 典型癥狀，MDA 和ROS 水平明顯增加，SOD 活性下降，提示造模成功，確保了后續(xù)研究的順利進(jìn)行。

糖尿病高血糖刺激下易導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生過量的ROS，進(jìn)而產(chǎn)生系列組織功能損傷[4,11]。人體中的SOD 具有阻斷氧自由基細(xì)胞損害并保護(hù)受損細(xì)胞的作用，而MDA 通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損害視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)[5]。因此，當(dāng)視網(wǎng)膜病變時(shí)，常表現(xiàn)為ROS、MDA 水平增加，SOD 活力降低。本研究中使用花色苷的大鼠的視網(wǎng)膜的損傷程度明顯改善，其視網(wǎng)膜ROS、MDA 水平明顯降低，SOD 活性明顯增加，表明花色苷能改善DR 大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)，且從各項(xiàng)指標(biāo)可知，高劑量的花色苷具有更強(qiáng)活性。這可能緣于花色苷在眼組織中的大量分布（明顯高于腦部和肝臟）[12]及其多途徑的視網(wǎng)膜保護(hù)作用，如抑制A2E 光氧化和光裂解、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物毒性、激活其他抗氧化通路、抑制炎癥反應(yīng)等[13]。

Notch 信號通路（如Notch1/Hes-1）主要參與機(jī)體的新陳代謝，激活后能夠減少機(jī)體因氧化應(yīng)激所致?lián)p傷，Hes-1 是該信號通路的關(guān)鍵靶基因[14-15]，有研究證實(shí)該通路可調(diào)節(jié)新生血管的退化或重構(gòu)，是DR 治療的潛在靶點(diǎn)[16]。田勇等[9]發(fā)現(xiàn)，治療恢復(fù)期的DR 大鼠的視網(wǎng)膜中存在Notch1 和Hes-1 蛋白高表達(dá)，而本研究中經(jīng)花色苷治療的DR 大鼠視網(wǎng)膜亦檢測到Notch1、Hes-1 蛋白水平增高，提示花色苷可能通過激活Notch1/Hes-1 通路，發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是：（1）高血糖狀態(tài)下，Notch1和Hes-1 蛋白表達(dá)可能受到抑制[17]，花色苷通過改善高糖狀態(tài)而上調(diào)Notch1 和Hes-1 蛋白水平，改善機(jī)體新陳代謝，進(jìn)而產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的作用；（2）DR 狀態(tài)下眼中易產(chǎn)生大量的ROS，引起細(xì)胞中的氧化應(yīng)激[18-19]，花色苷可能通過激活Notch1/Hes-1 通路，清除視網(wǎng)膜中的ROS，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用；（3）可能與被激活的Notch1/Hes-1 通路強(qiáng)化視神經(jīng)保護(hù)作用亦存在相關(guān)性，因?yàn)镈R 早期就已出現(xiàn)神經(jīng)變性[4]。

5 結(jié)論

花色苷可能通過激活DR 大鼠視網(wǎng)膜的Notch1/Hes-1 信號通路，保護(hù)其視神經(jīng)并改善氧化應(yīng)激。但影響DR 氧化應(yīng)激的因素較多，目前相關(guān)研究較少，且研究未對花色苷進(jìn)行更多劑量方面的考察，存在一定的局限，有待后續(xù)研究進(jìn)行補(bǔ)充。