淫羊藿總黃酮提取工藝優(yōu)化與抗氧化活性研究

王瑜婷，曹 嵌，何榮榮，楊曉靜，劉遠俊，馮倩儀，孫冬梅

（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai 的干燥葉，性溫，味辛、甘，具有祛風(fēng)濕、補腎陽、強筋骨的功效，常用于治療陽痿遺精、腎陽虛衰、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣[1]等癥。現(xiàn)代研究表明[2-3]，黃酮類成分是其主要活性成分，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫力等作用，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有廣泛的生理活性。

自由基氧化會損傷體內(nèi)的生物大分子如核酸（DNA、RNA）、酶、蛋白質(zhì)、糖等，進而對內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)造成不良影響[4-6]。據(jù)相關(guān)文獻研究[7]，淫羊藿總黃酮成分具有增強抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生的作用，是一種重要的生物活性成分。本研究擬通過單因素試驗篩選出較為重要的影響因子，并采用響應(yīng)面法優(yōu)選淫羊藿總黃酮提取工藝，同時對淫羊藿總黃酮進行體外抗氧化活性評價，并與維生素C 的抗氧化活性進行比較，以期為進一步探討其藥理活性和綜合利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2600i 型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；XP26 型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B型中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品（批號：110737-202017，純度：98.1%）、維生素C 對照品（批號：100425-202105，純度：100.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；DPPH、ABTS 自由基清除能力試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純；淫羊藿藥材（批號：YL2203003，產(chǎn)地：甘肅），經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.的干燥葉，符合2020 年版《中國藥典》（一部）淫羊藿項下相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成質(zhì)量濃度為101.023 4 μg/mL 的溶液，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取“2.1.1”項下對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、3.0、6.0 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，以70%乙醇為空白，照紫外-可見分光光度法（2020 年版《中國藥典》通則0401），在270 nm 波長處測定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 0.036 5X- 0.004 9（2.050 5 ～60.616 4 μg/mL，r=0.999 9）。

2.1.3 含量測定 取淫羊藿粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，超聲提?。üβ剩?50 W，頻率：45 kHz）30 min，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液濃度（μg/mL），并按照下列公式計算總黃酮提取率。

式中，C為供試品溶液中總黃酮濃度（μg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為淫羊藿粉末質(zhì)量（g）。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲溫度對總黃酮提取率的影響 固定乙醇濃度為50%，液料比為50 ∶1，超聲時間為30 min，超聲溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70、80℃。以超聲溫度為自變量，總黃酮提取率為因變量繪圖，見圖1A。由結(jié)果可知，隨著超聲溫度的升高，淫羊藿總黃酮提取率略呈下降趨勢?？赡苁怯捎谶m宜的溫度可以使分子間運動加快[8]，有利于淫羊藿中活性物質(zhì)溶出；當(dāng)溫度升高時，淫羊藿中總黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致提取率下降。因此后續(xù)試驗設(shè)定超聲溫度為30℃。

圖1 單因素實驗結(jié)果Fig.1 Results of single factors test

2.2.2 超聲時間對總黃酮提取率的影響 固定超聲溫度為30 ℃，乙醇濃度為50%，液料比為50 ∶1，超聲時間分別為20、30、40、50、60 min。以超聲時間為自變量，總黃酮提取率為因變量繪圖，見圖1B。由結(jié)果可知，隨著超聲時間的升高，淫羊藿總黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢?？赡苁怯捎谝蜣綐悠分锌傸S酮的總量為定值，大部分總黃酮析出后，其含量便不再升高[8]。

2.2.3 液料比對總黃酮提取率的影響 固定超聲溫度為30℃，乙醇濃度為50%，超聲時間為30 min，液料比分別設(shè)置為20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1。以液料比為自變量，總黃酮提取率為因變量繪圖，見圖1C。由結(jié)果可知，隨著液料比的升高，淫羊藿總黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢?？赡苁怯捎陔S著液料比增加，淫羊藿總黃酮溶出增大；隨著液料比的繼續(xù)增大，淫羊藿中的一些其它醇溶性物質(zhì)溶出也隨之增大，從而抑制了總黃酮的溶出[8]。

2.2.4 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響 固定超聲溫度為30℃，液料比為50 ∶1，超聲時間為30 min，乙醇濃度分別設(shè)置為40%、50%、60%、70%、80%。以乙醇濃度為自變量，總黃酮提取率為因變量繪圖，見圖1D。由結(jié)果可知，隨著乙醇濃度的升高，淫羊藿總黃酮提取率先升高后下降?？赡苁怯捎谠谝掖紳舛容^低時，淫羊藿總黃酮沒有完全溶出，隨著乙醇濃度逐漸增大，淫羊藿中總黃酮的溶出逐漸增多，當(dāng)乙醇濃度超過70%的時候，提取溶劑極性下降，淫羊藿中其他醇溶性非極性物質(zhì)溶出量隨之增加，從而降低了總黃酮的溶解效果[8]。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取超聲時間（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）為影響因素，以總黃酮提取率作為響應(yīng)值，采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Experimental design and results

2.3.2 試驗結(jié)果分析 利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表2 中總黃酮提取率進行二次多元回歸擬合，結(jié)果見表3。得到二次多項式擬合回歸方程：總黃酮得率= 6.60 + 0.014A+ 0.18B- 0.065C+ 5×10-3AB-0.012AC+ 0.012BC- 0.038A2- 0.12B2- 0.16C2。建立的二次多元模型F=14.93，模型P= 0.001 ＜0.01，表明該試驗擬合的模型差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。失擬項P= 0.342 ＞0.05，表明失擬項不顯著，未知因素對

表3 擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance results of the fitted regression equation

試驗結(jié)果干擾較小?？傸S酮提取率回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2= 0.951 ＞ 0.9，表明可用此模型來分析和預(yù)測淫羊藿總黃酮提取率結(jié)果[9]。由F值可以看出，各因素對總黃酮提取率影響大小依次是：B＞C＞A，B、B2和C2對總黃酮提取率影響極顯著（P＜ 0.01），其余項影響不顯著，表明各因素對總黃酮提取率的影響并非簡單的線性關(guān)系。為了清晰表達兩個因素同時對總黃酮提取率的影響，根據(jù)回歸模型方程，固定任意一個因素的值，考察另外兩個因素交互作用對總黃酮提取效果的影響，結(jié)果見圖2。由結(jié)果可知，交互項AB、AC、BC對總黃酮提取率并沒有顯著的影響，表現(xiàn)為3D 響應(yīng)面較為平滑，這與方差分析結(jié)果基本一致。

圖2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Fig.5 Results of response surface test

2.3.3 工藝驗證 采用Design-Expert.V.8.0.6.1 軟件，由得到的回歸模型計算可得，淫羊藿總黃酮的優(yōu)化提取工藝為加入47.68 mL 的68.11%乙醇，超聲32.65 min，根據(jù)生產(chǎn)實際調(diào)整為加入50 mL 的70%乙醇，超聲30 min，進行三組驗證試驗，總黃酮提取率分別為6.58%、6.63%、6.60%，均值為6.60%，與預(yù)測值6.67%的偏差為1.05%，說明建立的模型預(yù)測性良好，優(yōu)選的淫羊藿總黃酮提取工藝穩(wěn)定可行。

2.4 抗氧化試驗

2.4.1 供試品溶液的制備及測定 取優(yōu)化條件下的淫羊藿提取液（總黃酮質(zhì)量濃度為256.043 μg/mL）1.0、2.0、6.0、10.0、12.0、18.0、20.0、25.0 mL 于25 mL 容量瓶內(nèi)，加70%甲醇定容至刻度，制得總黃酮質(zhì)量濃度分別為0.010、0.020、0.062、0.102、0.123、0.184、0.205、0.256 mg/mL 的系列樣品溶液，分別測定對ABTS 自由基、DPPH 自由基的清除率，并計算淫羊藿提取液的半數(shù)抑制濃度（IC50），采用SPSS 26.0 軟件中的Probit 方法進行回歸分析，擬合后的方程為Probit（P）＝Intercept + Bx（式中，Intercept表示截距，B 表示斜率，P 為自由基清除率，x 為提取液稀釋后的總黃酮質(zhì)量濃度；Probit ＝0.50 時，對應(yīng)的總黃酮質(zhì)量濃度即IC50）[10]。同時配制系列濃度的維生素C 溶液作為陽性對照試驗，計算IC50。

2.4.2 ABTS 自由基清除試驗 ABTS 是一種介質(zhì)物質(zhì)，用K2S2O8與ABTS 反映生成穩(wěn)定的陽離子自由基ABTS+，ABTS+自由基離子的最大吸收波長為734 nm，抗氧化物質(zhì)與ABTS+反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色[11]，A734nm減小，進而對樣本中ABTS 清除能力進行定量分析。取ABTS 貯備液和K2S2O8貯備液各1 mL，置于50 mL 容量瓶中，搖勻，避光儲存12 ～16 h 后，用無水乙醇定容，即得ABTS 自由基溶液。測定組：移取淫羊藿提取液50 μL 于2 mL 的EP 管中，加入950 μL 的ABTS 自由基溶液，搖勻，室溫 （25 ℃）避光靜置6 min，測定其吸光度，記為A1；對照組：按上述方法，以等體積的無水乙醇替代ABTS 自由基溶液，測定其吸光度，記為A2；空白組：移取50 μL無水乙醇于2 mL 的EP 管中，加入950 μL 的ABTS溶液，搖勻，室溫避光靜置6 min，測定其吸光度，記為A0。ABTS 自由基清除率=1-［（A1-A2）/A0］×100%[11-12]，結(jié)果見圖3。由結(jié)果可知，淫羊藿提取液對ABTS 自由基的IC50為0.201 mg/mL，隨著總黃酮濃度的升高，ABTS 自由基清除率先升高后趨于平穩(wěn)，最高僅達50%左右；維生素C 對ABTS 自由基的IC50為0.057 mg/mL，最高清除率趨于100%，說明淫羊藿提取液具有較好的ABTS 自由基清除能力，但弱于維生素C，淫羊藿提取液對ABTS 自由基的清除作用與淫羊藿總黃酮濃度呈正相關(guān)性。

圖3 不同質(zhì)量濃度淫羊藿總黃酮和維生素C 對ABTS 自由基的清除率Fig.3 ABTS free radical scavenging rate of total flavonoids and vitamin C in Epimedii Folium at different mass concentrations

2.4.3 DPPH 自由基清除試驗 DPPH 法是根據(jù)DPPH 自由基有單電子，在517 nm 處有一強吸收，其醇溶液呈紫色的特性[13]。當(dāng)有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，呈現(xiàn)的顏色越淺，即A值越低，進而對樣本中DPPH 清除能力進行定量分析。測定組：移取淫羊藿提取液400 μL 于2 mL 的EP 管中，加入600 μL 的DPPH自由基溶液，搖勻，室溫（25 ℃）避光靜置30 min，測定其吸光度，記為A1；對照組：按上述方法，以等體積的70%乙醇替代DPPH 自由基溶液，測定其吸光度，記為A2；空白組：移取400 μL70%乙醇于2 mL的EP 管中，加入600 μL 的DPPH 自由基溶液，搖勻，室溫避光靜置30 min，測定其吸光度，記為A0。DPPH 自由基清除率= 1-［（A1-A2）/A0］×100%[13]，結(jié)果見圖4。由結(jié)果可知，淫羊藿提取液對DPPH 自由基的IC50為0.133 mg/mL，隨著總黃酮濃度的升高，DPPH 自由基清除率逐漸增大，濃度達到較高值時清除率可接近100%；維生素C 對DPPH 自由基的IC50為0.027 mg/mL，最高清除率趨于100%，說明淫羊藿提取液具有較好的DPPH 自由基清除能力，但弱于維生素C，淫羊藿提取液對DPPH 自由基的清除作用與淫羊藿總黃酮濃度呈正相關(guān)性。

圖4 不同質(zhì)量濃度淫羊藿總黃酮和維生素C 對DPPH 自由基的清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate of total flavonoids and vitamin C in Epimedii Folium at different mass concentrations

3 討論

黃酮類化合物廣泛分布于自然界中，具有明顯的生物活性及重要的研發(fā)價值。本研究基于單因素試驗，設(shè)計響應(yīng)面法優(yōu)化得到淫羊藿總黃酮提取工藝∶乙醇濃度為70%，液料比為50 ∶1，超聲時間為30 min。此條件下，總黃酮實際提取率為6.60%，與預(yù)測值接近，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。

現(xiàn)代研究表明，自由基氧化造成的損傷能夠誘發(fā)許多疾病。DPPH 法和ABTS 法已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用于定量測定食品藥品的抗氧化能力，并具有典型性[14]?？寡趸钚栽囼灲Y(jié)果顯示，淫羊藿總黃酮對ABTS 自由基的IC50為0.201 mg/mL，但清除率最高僅在50%左右，而后隨著總黃酮濃度升高，ABTS 自由基清除率趨于平穩(wěn)；淫羊藿總黃酮對DPPH 自由基的IC50為0.133 mg/mL，隨著總黃酮濃度的升高，DPPH 自由基清除率逐漸上升，可趨于100%，表明淫羊藿總黃酮具有較強的自由基清除能力。

4 結(jié)論

本研究優(yōu)化了淫羊藿總黃酮的提取工藝，優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可靠，抗氧化試驗結(jié)果表明淫羊藿總黃酮具有較強的自由基清除能力，為淫羊藿總黃酮的開發(fā)利用提供了一定的參考價值。淫羊藿中不僅有黃酮類成分，還含有豐富的多糖類、木脂素類及生物堿類等成分，后續(xù)可對淫羊藿其他成分進行體外抗氧化活性評價，為淫羊藿的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。