薄荷醇修飾紫杉醇陽離子脂質(zhì)體處方優(yōu)選及體外靶向性評價(jià)

蔡佳雨，劉婉瀅，司佳奇，劉 洋，李灃芮，孔 亮,2，李學(xué)濤*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110847）

腦膠質(zhì)瘤是致死率較高的原發(fā)性腦腫瘤[1-3]。化療作為一種治療腦膠質(zhì)瘤的重要手段，但由于血腦屏障（BBB）的存在，藥物很難進(jìn)入中樞神經(jīng)并在腫瘤部位聚積[4-5]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從紅豆杉樹皮中分離得到的二萜類廣譜抗癌藥，PTX 可在不同細(xì)胞中通過促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2 磷酸化激活Raf-1、促進(jìn)促凋亡蛋白cleaved capase-3、cleaved capase-8 表達(dá)等凋亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，但PTX存在對腫瘤細(xì)胞的選擇性差、副作用大和水溶性差等問題，使其臨床應(yīng)用受到限制[6-10]。陽離子脂質(zhì)體是由磷脂、膽固醇和陽離子材料構(gòu)成的一種封閉的雙層囊泡體系，能夠同時包裹親水性和疏水性藥物，因其磷脂膜表面帶正電荷使其更容易被腫瘤細(xì)胞攝取，但膽固醇會引起心肺副反應(yīng)和過敏反應(yīng)[11-12]。故本研究選用具有與膽固醇相似的類固醇結(jié)構(gòu)的人參皂苷Rh2來代替膽固醇[13-15]，并在陽離子脂質(zhì)體的表面修飾具有芳香開竅作用的薄荷醇，構(gòu)建薄荷醇修飾紫杉醇陽離子脂質(zhì)體（menthol-modified paclitaxel cationic liposomes, Men-PCLPs），對其體外靶向能力進(jìn)行初步考察。

1 材料

1.1 主要儀器

JY92-2D 型超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Agress1100 型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；FACSCCalibur 型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；B-220 型恒溫水浴鍋和RE52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FA1004 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料

磷脂（日本NOF 公司，批號：120025）；PTX（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：J1101A，純度＞99%）；人參皂苷Rh2（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：20082504，純度＞99%）；3β-[N-（N′-N′-二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]膽固醇鹽酸鹽（DC-Chol，批號：201923，美國 Avanti 公司）；DSPE-PEG2000-薄荷醇（批號：RF0222837，西安瑞禧生物科技有限公司）；香豆素（批號：442631，美國Sigma-Aldrich 公司）。鼠源腦膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞、小鼠腦微血管內(nèi)皮bEnd.3 細(xì)胞購自賽百慷生物技術(shù)股份有限公司（上海）。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備

選擇薄膜分散法制備脂質(zhì)體。精密稱取處方量的DSPE-PEG2000-薄荷醇、DC-Chol、人參皂苷Rh2、磷脂和 PTX 置于圓底燒瓶中，加5 mL 甲醇，超聲溶解后在40℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇至成膜。取下圓底燒瓶并在瓶中加入5 mL PBS 后超聲將薄膜溶解，隨后在超聲波細(xì)胞破碎儀中超聲10 min，取出后經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過2 次，即可得到Men-PCLPs。不加PTX，其余步驟同上制備空白脂質(zhì)體。

2.2 PTX 測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速為1 mL/min；檢測波長為227 nm；柱溫為20℃，檢測器為紫外吸收檢測器；進(jìn)樣量為10 μL；流動相為甲醇-乙腈-水= 28 ∶42 ∶30。

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液 取5 mg PTX，加5 mL 甲醇制成濃度為1 mg/mL 的對照品母液，后用甲醇將對照品母液依次稀釋成濃度為5.000、10.000、15.000、20.000、25.000、30.000 μg/mL 的對照品溶液。

（2）供試品溶液 取1 mL Men-PCLPs，加甲醇9 mL 破乳，即得。

（3）空白溶液 取1 mL 薄荷醇修飾空白脂質(zhì)體，加甲醇9 mL 破乳，即得。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 吸取適量空白溶液、對照品溶液與供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，PTX 在6.500 ～ 7.500 min 出峰，而空白溶液在對應(yīng)時間段無色譜峰出現(xiàn)，顯示該方法專屬性良好。

圖1 PTX 含量測定HPLC 圖Fig.1 HPLC figure of PTX content determination

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取濃度5.000、10.000、15.000、20.000、25.000、30.000 μg/mL 的對照品溶液適量進(jìn)樣測定。用待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）和對應(yīng)峰面積（Y）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，得PTX 的回歸方程為Y= 43.682X+ 2.711（r= 0.999）。結(jié)果表明，PTX 在5.000 ～ 30.000 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取處方優(yōu)選方案樣品6 份，進(jìn)樣測定，將峰面積代入回歸方程計(jì)算PTX 含量。結(jié)果RSD = 1.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液，進(jìn)樣測定6 次，將峰面積帶入回歸方程。結(jié)果RSD =0.90%，表明儀器精密度良好。

不良反應(yīng)組患者的P T（1 0.8 6±2.0 1）s，T T（14.69±0.87）s，APTT（27.71±1.84）s，F(xiàn)ib（1.08±0.11）s；其PLT（139.91±10.76）×109/L，HCT（0.56±0.07），Hb（82.26±7.08）g/L，RBC（2.91±1.45）×109/L。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測定。結(jié)果RSD =0.59%，表明該脂質(zhì)體24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品樣品6 份，按質(zhì)量比1 ∶1 加入對照品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果可得，PTX 的平均加樣回收率為104.07%（RSD = 0.99%）。

2.3 脂質(zhì)體包封率的測定

取Men-CCLPs 樣品2 mL，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜濾過，得到過膜后脂質(zhì)體。分別精密吸取過膜前與過膜后的脂質(zhì)體0.50 mL 加入4.50 mL 甲醇，破乳后經(jīng)0.45μm 微孔濾膜濾過，用HPLC 對破乳后過膜前與過膜后濾液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算PTX 包封率，包封率=M過膜后/M過膜前×100%。

2.4 脂質(zhì)體處方工藝優(yōu)選

根據(jù)課題組前期研究經(jīng)驗(yàn)，選用磷脂質(zhì)量（A）、人參皂苷Rh2質(zhì)量（B）與PTX 質(zhì)量（C）作為考察因素，選定考察指標(biāo)為PTX 平均包封率（Y，%），選擇Box-Benhken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)選脂質(zhì)體的處方工藝，處方量5 mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1 ～ 3。

表1 各因素水平編碼Tab.1 Horizontal coding of each factor

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab.2 Box-Behnken experimental design scheme and results

將表3 中包封率數(shù)據(jù)輸入Design-Expert8.0.6.1 軟件中，擬合的方程為：Y= 92.280 + 8.510A- 13.800B-3.610C+ 8.880AB+ 5.600AC+ 0.570BC- 5.390A2-13.710B2- 5.940C2（r= 0.990 3，P＜0.05）。擬合結(jié)果表明，該模型可以較好地反映Y值的變化，可用于優(yōu)選Men-PCLPs 的處方工藝。對擬合模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC對Y值有顯著影響（P＜0.05），因素BC對Y值沒有顯著影響（P＞0.05）；3 個因素對平均包封率影響的大小順序?yàn)锽＞A＞C，即人參皂苷Rh2質(zhì)量＞磷脂質(zhì)量＞PTX 質(zhì)量。用Design-Expert 8.0.6.1 軟件繪制因變量和自變量的三維效應(yīng)面圖和二維等高圖，見圖2。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis

圖2 各因素對Men-PCLPs 平均包封率影響的等高線圖和效應(yīng)面圖Fig.2 Contour plot and effect surface plot of the influence of various factors on the average encapsulation rate of Men-PCLPs

圖3 各組細(xì)胞存活率的測定結(jié)果Fig.3 Cell survival rate of each group

最終優(yōu)選處方為：處方量5 mL、磷脂106 mg、人參皂苷Rh220 mg、PTX 2.200 mg。制備3 批Men-PCLPs，計(jì)算PTX 平均包封率為（93.800±0.006）%。表明研究優(yōu)選的處方可行、工藝穩(wěn)定。

2.5 Men-PCLPs 對C6 細(xì)胞存活率的影響

圖4 細(xì)胞攝取結(jié)果（n = 3）Fig.4 Cell uptake results（n = 3）

結(jié)果顯示, Men-PCLPs 組IC50［（1.540 ± 0.118）μmol/L］和紫杉醇陽離子脂質(zhì)體組（paclitaxel cationic liposomes，PCLPs）IC50［1.670 ±0.134）μmol/L］高于紫杉醇脂質(zhì)體組（paclitaxel liposomes，PLPs）IC50［（2.600±0.425）μmol/L］和空白脂質(zhì)體組。PLPs組毒性低于PCLPs 和Men-PCLPs 組（P＜0.05）。

2.6 Men-PCLPs 體外靶向性研究

2.6.1 熒光脂質(zhì)體的制備 用香豆素代替PTX 按“2.1”項(xiàng)下方法制備薄荷醇修飾香豆素陽離子脂質(zhì)體、香豆素陽離子脂質(zhì)體組、香豆素脂質(zhì)體組和空白脂質(zhì)體。

2.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞攝取量 取C6 細(xì)胞接種至6 孔板中（5×105個/孔）分為不同脂質(zhì)體給藥組，24 h 后加入含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h，經(jīng)處理后，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞攝取量進(jìn)行檢測。bEnd.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法同上。最后用Graphpad-prism-8.02 對各脂質(zhì)體組的攝取量進(jìn)行方差分析。C6 細(xì)胞對Men-PCLPs 和PCLPs 的攝取量明顯高于PLPs（P＜0.05），見圖4A；bEnd.3 細(xì)胞對Men-PCLPs 的攝取量明顯高于PLPs 和PCLPs（P＜0.05），見圖4B。結(jié)果表明，Men-PCLPs 可提高藥物的靶向性。

3 討論

研究表明，腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上帶有負(fù)電荷的大分子物質(zhì)[16-17]，而陽離子脂質(zhì)體表面帶有正電荷可與之通過靜電吸附作用，更容易被腫瘤細(xì)胞攝取，從而產(chǎn)生被動靶向作用。目前常見的腦靶向物質(zhì)有轉(zhuǎn)鐵蛋白、甘露糖和多肽等，但由于受體、生物安全性或轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等問題，使其應(yīng)用存在爭議，因此開發(fā)一種安全有效的跨BBB 途徑尤為重要[18]。薄荷醇是薄荷油的主要成分，是一種從薄荷的莖或葉中提取得到的環(huán)類單萜[19]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)薄荷醇可降低緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)，有效增加血腦屏障的通透性以協(xié)助其他藥物進(jìn)入腦內(nèi)。LIANG J 等[20]發(fā)現(xiàn)薄荷醇的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和生物安全性要比轉(zhuǎn)鐵蛋白高。

通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出影響包封率的3 個主要因素磷脂、人參皂苷Rh2和PTX 質(zhì)量，選擇Box-Benhken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對處方進(jìn)行優(yōu)化，成功制備包封率為（93.800±0.006）%的Men-PCLPs，經(jīng)驗(yàn)證本方法安全可行。本實(shí)驗(yàn)考察不同組脂質(zhì)體對C6 細(xì)胞存活率的影響以及被C6 細(xì)胞、bEnd.3 細(xì)胞的攝取情況。由于陽離子脂質(zhì)體的正電荷與腫瘤細(xì)胞的靜電吸附作用，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中Men-PCLPs 和PCLPs對腫瘤細(xì)胞的抑制能力相似且較PLPs 顯著增強(qiáng)，還可有效增加C6 細(xì)胞對藥物的攝取。薄荷醇可降低腸上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)，增加血腦屏障的通透性，所以在體外靶向性考察中經(jīng)薄荷醇修飾的脂質(zhì)體可有效增加bEnd.3 細(xì)胞對藥物的攝取。

4 結(jié)論

本研究成功制備Men-PCLPs，并篩選出優(yōu)化處方，證明Men-PCLPs 對C6 細(xì)胞有一定的抑制能力，且Men-PCLPs 對 C6 細(xì)胞和bEnd.3 細(xì)胞有明顯的主動靶向能力，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明Men-PCLPs 是一種安全、高效的靶向制劑，為后續(xù)抗腫瘤作用研究提供一定基礎(chǔ)，但藥物進(jìn)入體內(nèi)過程復(fù)雜，Men-PCLPs的抗腫瘤機(jī)制還需要更深入的實(shí)驗(yàn)探究。