基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討腦脈泰膠囊治療腦梗死的作用機(jī)制

王卓媛，黃穎，胡文艦，郭思思，茍小軍（.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 0999；.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 00700）

腦梗死（Cerebral infarction，CI）是多種原因引起的局部腦組織區(qū)域供血障礙，導(dǎo)致腦缺血、缺氧病變、壞死以及臨床上相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損[1]。腦梗死又稱缺血性中風(fēng)，屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇[2]，其典型特征是由于血管性疾病（包括腦梗塞等）引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性損傷所導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損，是在全世界范圍內(nèi)致殘甚至致死的主要疾病[3]。臨床治療腦梗死重在對腦組織的保護(hù)，促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)[4]。中醫(yī)藥在治療腦梗死方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，一般以活血化瘀為主要治療原則[5-6]。腦脈泰膠囊具有益氣活血、熄風(fēng)豁痰的功效，主要用于腦梗塞恢復(fù)期氣虛血瘀、脈絡(luò)阻塞的患者，臨床療效確切[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，腦脈泰膠囊可以增加腦部血流量，改善腦組織供血不足的情況，減少腦組織病變，抑制腦部血栓的形成。但其作用機(jī)制尚不夠明確，故本研究擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)探討腦脈泰膠囊治療腦梗死的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 腦脈泰膠囊活性成分及其作用靶點(diǎn)的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php/）[9]、中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP，http://www.tcmip.cn）[10]檢索腦脈泰膠囊中紅參（HS）、三七（SQ）、當(dāng)歸（DG）、丹參（DS）、雞血藤（JXT）、紅花（HH）、銀杏葉（YXY）、山楂（SZ）、菊花（JH）、何首烏（HSW）、石菖蒲（SCP）、葛根（GG）等12 味中藥的化學(xué)成分，并通過查閱文獻(xiàn)搜集石決明（SJM）的化學(xué)成分[11-13]。設(shè)置參數(shù)口服吸收利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18 為篩選條件[14]，獲取腦脈泰膠囊的活性成分。通過上述2 個數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步預(yù)測活性成分的作用靶點(diǎn)，將所有靶點(diǎn)通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）進(jìn)行靶點(diǎn)信息確認(rèn)，最終得到腦脈泰膠囊活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2 腦梗死的疾病相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測 以“Cerebral infarction” 為 關(guān) 鍵 詞， 通 過 OMIM 數(shù) 據(jù) 庫[15]、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫[16]、TTD 數(shù)據(jù)庫[17]、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫[18]、DrugBank 數(shù)據(jù)庫[19]檢索、篩選腦梗死的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)信息確認(rèn)，并將結(jié)果篩選匯總后去重。

1.3 藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用R 4.0.3 軟件繪制腦脈泰膠囊活性成分作用靶點(diǎn)與腦梗死疾病相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩（Venn）圖，取二者的交集（共同靶點(diǎn)），作為腦脈泰膠囊治療腦梗死的潛在作用靶點(diǎn)。將腦脈泰膠囊的組方中藥、活性成分及交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)，并利用Network Analyzer 插件功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出腦脈泰膠囊治療腦梗死的關(guān)鍵活性成分。

1.4 潛在作用靶點(diǎn)的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.3”項(xiàng)下的交集靶點(diǎn)在線導(dǎo)入STRING 平臺（https://string-db.org），設(shè)定物種為“Homo sapiens”、置信度（Medium_confidence）≥0.4，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，獲得腦脈泰膠囊治療腦梗死的靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。為了進(jìn)一步全面研究和挖掘網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將“tsv”格式文件下載后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建PPI可視化網(wǎng)絡(luò)。利用CytoNCA 插件工具分析靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò) 拓 撲 參 數(shù)， 包 括 連 接 度（Degree）、 介 度（Betweenness）、緊密度（Closenesss）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality， EC）、 局 部 邊 連 通 性（Local Average Connectivity，LAC）以及網(wǎng)絡(luò)中心性（Network Centrality，NC）等6 個參數(shù)的中位數(shù)，分別記為d1、b1、c1、e1、l1、n1，篩選出同時滿足大于6 個中位數(shù)的核心靶點(diǎn)。

1.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 通過R 4.0.3軟件中的“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“pathview”程序包對腦脈泰膠囊治療腦梗死的潛在作用靶點(diǎn)（交集靶點(diǎn)）進(jìn)行GO 功能及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析包括生物學(xué)過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細(xì)胞組分（Cellular component，CC）。結(jié)果根據(jù)P＜0.05 進(jìn)行篩選，對所得條目以條形圖進(jìn)行可視化展示。

1.6 分子對接驗(yàn)證 選取“藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵活性成分與PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選得到的排前7 位的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.nc-bi.nlm.nih.gov）中下載腦脈泰膠囊活性化合物的sdf 結(jié)構(gòu)文件，導(dǎo)入到ChemBio 3D 14.0 軟件中調(diào)整活性成分的空間構(gòu)象，計算能量的最優(yōu)化結(jié)果，并以mol2 格式保存，經(jīng)AutoDockTools 1.5.6 軟件處理后將文件保存為pdbqt格式。從PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）中下載目標(biāo)蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，利用Notepad 2 軟件將目標(biāo)蛋白中的水分子以及有機(jī)物去除，再將目標(biāo)蛋白導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6 軟件，加氫、分配電荷、添加原子類型后保存為pdbqt 格式文件。最后，利用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接，使用Pymol 軟件對所得對接結(jié)果進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 腦脈泰膠囊治療腦梗死的潛在作用靶點(diǎn) 通過TCMSP、TCMIP 數(shù)據(jù)庫檢索，并根據(jù)OB、DL 條件篩選，刪除重復(fù)值后，共得到腦脈泰膠囊的140 個活性成分及其349 個作用靶點(diǎn)。通過OMIM、PharmGkb、DrugBank、TTD、DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫 檢索、篩選及匯總?cè)ブ睾螅罱K得到926 個腦梗死疾病相關(guān)靶點(diǎn)。通過韋恩分析（見圖1），得到腦梗死的疾病相關(guān)靶點(diǎn)與腦脈泰膠囊活性成分作用靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)（交集靶點(diǎn)）111 個，即腦脈泰膠囊治療腦梗死的潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 腦脈泰膠囊治療腦梗死的潛在作用靶點(diǎn)Figure 1 Potential targets of Naomaitai Capsules in the treatment of cerebral infarction

2.2 “藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 將通過篩選得到的140 個活性成分與111 個潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建腦脈泰膠囊治療腦梗死的“藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。利用軟件的Network Analyzer 插件功能進(jìn)行分析，圖中節(jié)點(diǎn)的大小和度值的大小對應(yīng)，節(jié)點(diǎn)的面積越大則說明度值越高。該網(wǎng)絡(luò)的平均度值為12.01，網(wǎng)絡(luò)中大于平均度值的活性成分見表1，度值排前5 位的活性成分為Quercetin（槲皮素）、Luteolin（木犀草素）、Kaempferol（山柰酚）、Betasitosterol（β-谷甾醇）、Resveratrol（白藜蘆醇），其可能在腦脈泰膠囊治療腦梗死中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

表1 腦脈泰膠囊治療腦梗死的關(guān)鍵活性成分信息Table 1 Information on the key components of Naomaitai Capsules in the treatment of cerebral infarction

圖2 腦脈泰膠囊治療腦梗死的“藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Figure 2 “Drugs-active components-potential targets”network of Naomaitai Capsules in the treatment of cerebral infarction

2.3 腦脈泰膠囊治療腦梗死的PPI 網(wǎng)絡(luò) 通過STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行111 個交集靶點(diǎn)的PPI 分析，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。并基于CytoNCA 插件工具的算法，通過2 次篩選，共獲得核心靶點(diǎn)18 個，見圖3。核心靶點(diǎn)包括JUN、 TP53、 PTGS2、 MAPK1、 IL1B、 VEGFA、AKT1、 IL6、 FOS、 CXCL8、 ICAM1、 STAT3、MAPK3、TNF、MAPK14、MAPK8、MMP9、EGFR，上述靶點(diǎn)可能在在腦脈泰膠囊治療腦梗死中起到關(guān)鍵作用。

圖3 腦脈泰膠囊治療腦梗死的核心靶點(diǎn)篩選流程Figure 3 Screening flow chart of core potential targets of Naomaitai Capsules in the treatment of cerebral infarction

2.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 結(jié)果見圖4、圖5。腦脈泰膠囊治療腦腦梗死的潛在作用靶點(diǎn)的主要生物學(xué)過程包括DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等；主要集中在癌癥中的通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路等。

圖4 腦脈泰膠囊治療腦梗死的GO 功能富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of Naomaitai Capsules in the treatment of cerebral infarction

圖5 腦脈泰膠囊治療腦梗死的KEGG 通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis of Naomaitai Capsules in the treatment of cerebral infarction

2.5 分子對接驗(yàn)證 選取“2.3”項(xiàng)下PPI 網(wǎng)絡(luò)中排前7 位的核心靶點(diǎn)（IL6、TNF、CXCL8、PTGS2、STAT3、JUN、MAPK1）與“2.2”項(xiàng)下排前5 位的腦脈泰膠囊關(guān)鍵活性成分（槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、白藜蘆醇）進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)果如表2。所有對接結(jié)果的最小結(jié)合能基本＜-6.0 kcal·mol-1，表明配體分子與受體蛋白對接良好。選擇4 個結(jié)合能最小的“靶點(diǎn)蛋白-活性分子”繪制對接模式圖，見圖6。關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)均有較好的親和力，其可能在腦脈泰膠囊治療腦梗死中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

表2 腦脈泰膠囊治療腦梗死的關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果Table 2 Molecule docking results of key components and core targets of Naomaitai Capsules in the treatment of cerebral infarction

3 討論

近年來，腦梗死的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[20]，該病具有高致殘率、高死亡率等特點(diǎn)，患者通常會出現(xiàn)癱瘓、吞咽困難、思維混亂、說話或理解言語困難等臨床表現(xiàn)[21]，給患者家庭及社會帶來巨大負(fù)擔(dān)。中醫(yī)認(rèn)為腦梗死大多由于氣血兩虛導(dǎo)致血溢脈外或腦脈痹阻[22]，故多采用活血化瘀、益氣活血等治法[23]。腦脈泰膠囊中紅參大補(bǔ)元?dú)?；?dāng)歸、三七、丹參、紅花、雞血藤、制首烏等協(xié)同作用，活血祛瘀、疏通經(jīng)絡(luò)；山楂、石菖蒲同用以散化痰濁；菊花清肝熱，石決明平肝熄風(fēng)；銀杏、葛根2 味藥常用于治療中風(fēng)。研究發(fā)現(xiàn)，腦脈泰膠囊能夠提高腦部的血流量，促進(jìn)腦部血液循環(huán)[24]；同時能夠治療腦缺血再灌注損傷以及自由基損傷，減少腦梗死體積及神經(jīng)元凋亡，降低缺血組織周圍的毒性反應(yīng)，從而保護(hù)腦功能[25]。目前，已有諸多臨床研究[26-28]表明，腦脈泰膠囊能夠降低腦梗死患者的腦部梗死體積，是治療腦梗死的一種安全有效策略。

本研究通過“藥物-活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、白藜蘆醇等活性成分可能是腦脈泰膠囊治療腦梗死的關(guān)鍵成分。近年來，山柰酚在抗炎、抗氧化和抗凋亡活性方面的作用備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚在體內(nèi)外脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中具有明顯的抗炎作用[29]；山柰酚能夠通過介導(dǎo)NF-κB 途徑來改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損，從而減輕神經(jīng)炎癥[30]。β-谷甾醇是一種植物甾醇，屬于四環(huán)三聯(lián)體[31]，可以在小膠質(zhì)細(xì)胞中抑制炎癥因子的激活，從而起到抗神經(jīng)炎癥的作用，減少神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[32]。白藜蘆醇是一種天然多酚，可以通過激活PI3K/AKT 信號通路來發(fā)揮對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，從而預(yù)防大鼠腦缺血后的神經(jīng)元死亡[33]。木犀草素在腦缺血再灌注（I/R）中具有抗氧化作用，對神經(jīng)性的腦損傷具有保護(hù)作用[34]；體外實(shí)驗(yàn)[35]發(fā)現(xiàn)，木犀草素能夠通過抑制MMP9 表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)胞活力并降低細(xì)胞凋亡。槲皮素具有抗氧化和抗炎特性，其神經(jīng)保護(hù)作用已被證實(shí)，能夠通過調(diào)控細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）/蛋白激酶B（Akt）磷酸化和蛋白磷酸酶活性，從而抑制腦缺血再灌注后的腦損傷加重[36]。

通過分子對接驗(yàn)證表明，腦脈泰膠囊關(guān)鍵活性成分可直接作用于TNF、PTGS2 等核心靶基因。TNF-α是一種與炎癥和其他免疫反應(yīng)相關(guān)的多效細(xì)胞因子，可在各種病理和生理?xiàng)l件下引起刺激[37]，是與創(chuàng)傷性腦損傷和中風(fēng)腦損傷相關(guān)的主要細(xì)胞因子[38]。有研究[39]發(fā)現(xiàn)，TNF-α 可以在急性腦缺血患者的大腦中產(chǎn)生，能夠促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，TNF-α 參與了神經(jīng)炎癥和腦缺血引起的神經(jīng)損傷。研究[40]表明，PTGS2 在大腦中的過度表達(dá)可能會促進(jìn)卒中患者的腦梗塞面積擴(kuò)散。PTGS2 表達(dá)的特異性降低能夠抑制NF-κB 信號通路，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)缺血性腦卒中小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）的增殖、遷移和血管生成，對缺血性腦卒中小鼠起到保護(hù)作用[41]。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，腦脈泰膠囊治療腦梗死的潛在作用靶點(diǎn)主要富集在IL-17 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路等相關(guān)信號通路。IL-17 信號通過NF-κB 和MAPK 途徑激活炎癥轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)基因表達(dá)。研究表明，IL-17 可激活NF-κB 等多種下游通路，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α 等一系列炎癥介質(zhì)，IL-17與這些炎癥介質(zhì)協(xié)同作用，放大炎癥反應(yīng)，加劇腦部動脈粥樣硬化斑塊的形成[42]；腦缺血后，IL-17 主要通過上調(diào)炎癥因子的表達(dá)引起腦組織損傷[43]；IL-17 水平升高會加劇血腦屏障損壞，并對腦組織產(chǎn)生負(fù)面影響[44]。HIF-1 信號通路對維持體內(nèi)氧的穩(wěn)態(tài)具有重要意義，同時參與血管生成和炎癥的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子HIF-1 由HIF-1α 和HIF-1β 組成，對缺氧和缺血反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[45]。在腦缺血過程中，HIF-1α被激活并促進(jìn)參與細(xì)胞存活和血管生成的靶基因轉(zhuǎn)錄及翻譯[46]。HIF-1α 信號可誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)，對缺血性損傷產(chǎn)生雙重作用，一方面可以激活血管生成及紅細(xì)胞生成的相關(guān)下游靶基因，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；相反，也可以誘導(dǎo)具有神經(jīng)毒性的下游靶基因激活，從而引發(fā)神經(jīng)元的凋亡[47]。MAPK 信號通路涉及ERK 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）[48]，ERK 信號傳導(dǎo)與促進(jìn)神經(jīng)元存活及腦缺血后的學(xué)習(xí)有關(guān)，JNK 激活可以引發(fā)腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞色素C 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在腦缺血再灌注損傷過程中，MAPK 通路通過激活由NF-κB 介導(dǎo)的TNF-α 通路來放大體內(nèi)炎癥，在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡中發(fā)揮雙重作用[49]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法初步預(yù)測了腦脈泰膠囊治療腦梗死的關(guān)鍵活性成分、靶點(diǎn)及通路。腦脈泰膠囊治療腦梗死的作用可能是通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、白藜蘆醇等關(guān)鍵活性成分，作用于TNF、PTGS2、MAPK1 等核心靶點(diǎn)，通過IL-17 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路等多條信號通路來實(shí)現(xiàn)的。本研究可為腦脈泰膠囊治療腦梗死的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供參考，但相關(guān)研究結(jié)果仍有待進(jìn)一步的生物學(xué)驗(yàn)證。