黃精調(diào)控ATR/Chk1 通路干預自然衰老大鼠血管老化的作用研究

石永芳，馮靜月，梁梅，肖珍，秦臻（貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550025）

血管老化是指隨著年齡增長而出現(xiàn)血管結(jié)構(gòu)及功能的退行性變化，它所引起的心腦血管疾病是我國老年人群死亡的主要原因之一[1-3]。隨著我國社會老齡化程度的加深，針對血管老化的干預已迫在眉睫。近年研究[4-6]表明，血管老化與氧化應激、端粒及端粒酶功能低下、內(nèi)皮祖細胞減少、細胞衰老等多種因素有關(guān)。本課題組前期研究[7-9]表明，中藥黃精可有效降低衰老大鼠的氧化應激水平，促進其內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量和功能，提高細胞端粒酶活性，這與抑制細胞衰老的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——DNA 損傷檢測點ATM 與Rad3 相關(guān)蛋白激酶（ATR）/細胞周期檢測點激酶1（Chk1）通路的活化密切相關(guān)。由于黃精對血管老化的多種相關(guān)因素均有調(diào)節(jié)作用，故推測其可能具有干預血管老化的作用。因此，本研究擬觀察黃精對自然衰老模型大鼠老化血管管壁結(jié)構(gòu)及功能的影響，并基于ATR/Chk1 信號通路探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 2 月齡雄性SD 大鼠10 只，SPF 級，體質(zhì)量（247±13）g；18 月齡雄性SD 大鼠40 只，SPF 級，體質(zhì)量（583±17）g。上述動物均購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014，動物質(zhì)量合格證號：430726210100278028。本實驗經(jīng)貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準，批文號：1800014。

1.2 藥物及試劑 黃精，購自貴州威寧天露生物科技開發(fā)有限公司，批號：01137009，經(jīng)貴州醫(yī)科大學藥學院龍慶德教授鑒定為正品。黃精水煎液制備：按每克生藥加飲用水6 mL，浸泡30 min 后煮沸，文火慢煎40 min，趁熱過濾；二煎按每克生藥加水4 mL 煮沸后，煎法同前，合并2 次濾液；60 ℃下水浴濃縮至生藥量為0.5 g·mL-1，置于4 ℃冰箱保存。多聚甲醛，北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：1014A21； 蘇 木 精- 伊 紅（HE）染 液（批 號：CR2103154）、Masson 染液（批號：CR2103039），均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：A015-3-1；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性檢測試劑盒（批號：BC1195）、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒（批號：BC0025）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（批號：P1200-2）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）、高效RIPA 組織/細胞裂解液試劑盒（批號：R0010），均購自北京索萊寶科技有限公司；ATR 抗體（批號：13934）、Chk1 抗體（批號：2360）、p53 抗體（批號：32532）、β-actin（批號：4970）、辣根過氧化物標記羊抗兔二抗（批號：7074），均購自美國Cell Signaling Technology 公司；p21 抗體，英國Abcam 公司，批號：109199；GAPDH 抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10494-1-AP；ECL 發(fā)光液，德國Millipore 公司，批號：WBKLS0100；封閉液（批號：P0023B）、一抗稀釋液（批號： P0023A）、 二抗稀釋液（批號：P0023D），均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 AB104-N 型精密分析天平、160323A型酶標儀，成都錦世昌祥科技公司；MY-20 型手持式電動勻漿機，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；5810R型臺式冷凍離心機，德國艾本德股份公司；TS100 型倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；Mini-PROTEAN 電泳 系 統(tǒng)、Molecular Imager?Chemi DocTMXR System凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；SLK-O3000-S 型LED 數(shù)顯圓周搖床，美國賽洛捷克公司。

1.4 分組及給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，將10 只2 月齡大鼠作為青年組，將40 只18 月齡的自然衰老大鼠按體質(zhì)量隨機分為老年組及黃精低、中、高劑量組（1、2、4 g·kg-1），每組10 只。黃精灌胃劑量按人與動物藥物劑量標準換算，確定大鼠灌胃中劑量為2 g·kg-1，以中劑量的0.5、2 倍作為低、高劑量[7]。灌胃體積為10 mL·kg-1，每天給藥1 次，持續(xù)給藥12 周；青年組和老年組給予等量蒸餾水灌胃。末次灌胃后禁食12 h，頸椎脫臼處死大鼠，迅速打開腹腔；取出主動脈，生理鹽水洗凈，濾紙吸干；取主動脈弓部分血管浸于4%多聚甲醛溶液中固定，其余主動脈置于-80 ℃冰箱備用。

1.5 主動脈病理形態(tài)學觀察 用4%多聚甲醛溶液固定主動脈30 min 后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制成5 μm 厚切片，行常規(guī)HE 染色和Masson 染色。在光學顯微鏡下觀察各組大鼠主動脈組織病理形態(tài)學變化，并利用Image-Pro Plus 顯微圖像處理系統(tǒng)測量血管壁中膜平滑肌細胞（SMC）和膠原纖維（CF）的絕對面積，計算不同著色面積與測試區(qū)域整體面積之比，得出SMC 和CF 在中膜的相對含量（%）。

1.6 微量法檢測主動脈中T-AOC、GSH-Px 活性及MDA 含量 稱取約0.1 g 主動脈組織，加入1 mL 提取液進行冰浴勻漿，4 ℃下以8 000×g離心10 min 后取上清，BCA 法測定蛋白含量。然后按試劑盒說明書步驟操作，采用微量法分別檢測T-AOC、GSH-Px活性和MDA 含量。

1.7 Western Blot 法檢測主動脈中ATR、Chk1、p53及p21 蛋白表達水平 取各組大鼠主動脈組織約20 mg，加入含有PMSF 的RIPA 裂解液，勻漿后在4 ℃下以12 000 r·min-1（離心半徑6 cm）離心15 min，取上清，采用BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。加上樣緩沖液及RIPA 裂解液調(diào)整蛋白濃度，上樣量為40 μg 蛋白；經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜后，用封閉液封閉2 h；加入一抗ATR（1∶1 000）、Chk1（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、p21（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）后，于4 ℃下孵育過夜；加入二抗（1∶3 000）后在室溫下孵育2 h；采用超敏ECL 顯色液顯影并掃描。以GAPDH 或β-actin 為內(nèi)參，采用ImageJ 軟件分析條帶灰度值，并對目的蛋白進行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃精對衰老大鼠主動脈結(jié)構(gòu)的影響 結(jié)果見圖1。與青年組比較，老年組大鼠的主動脈內(nèi)膜出現(xiàn)損傷且不光滑，可見泡沫細胞浸潤，中膜細胞排列紊亂，彈力膜扭曲、斷裂、結(jié)構(gòu)不完整且明顯增厚。與老年組比較，黃精各劑量組大鼠的主動脈內(nèi)膜較為連續(xù)平整，損傷程度較輕，彈力膜結(jié)構(gòu)較完整，扭曲、斷裂現(xiàn)象較少出現(xiàn)，中膜增厚不明顯。結(jié)果表明，黃精能改善衰老大鼠主動脈的結(jié)構(gòu)病理變化，起到延緩血管老化的作用。

圖1 黃精對衰老大鼠主動脈結(jié)構(gòu)的影響（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of Polygonati Rhizoma on aortic structure of aging rats（HE staining，×200）

2.2 黃精對衰老大鼠主動脈SMC、CF 的影響 結(jié)果見圖2、表1。與青年組比較，老年組大鼠主動脈膠原染色區(qū)域明顯增多，SMC、CF 相對含量顯著升高（P＜0.01）；與老年組比較，黃精各劑量組大鼠主動脈膠原染色區(qū)域減少，SMC、CF 相對含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，黃精可降低衰老大鼠主動脈的SMC 及CF 相對含量。

表1 黃精對衰老大鼠主動脈中平滑肌細胞（SMC）和膠原纖維（CF）的影響（±s，n=3）Table 1 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells（SMC）and collagenous fibers（CF）in aorta of aging rats（±s，n=3）

表1 黃精對衰老大鼠主動脈中平滑肌細胞（SMC）和膠原纖維（CF）的影響（±s，n=3）Table 1 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells（SMC）and collagenous fibers（CF）in aorta of aging rats（±s，n=3）

注：與青年組比較，**P＜0.01；與老年組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

CF 相對含量/%22.35±1.14 32.09±1.16**28.30±0.83##27.56±1.85##25.61±0.93##組別青年組老年組黃精低劑量組黃精中劑量組黃精高劑量組劑量/（g·kg-1）--124 SMC 相對含量/%25.22±0.75 33.67±0.72**31.68±0.67#30.91±1.68##28.91±0.84##

圖2 黃精對衰老大鼠主動脈中平滑肌細胞和膠原纖維的影響（Masson 染色，×200）Figure 2 Effects of Polygonati Rhizoma on smooth muscle cells and coll agenous fibers in aorta of aging rats（Masson staining，×200）

2.3 黃精對衰老大鼠主動脈中T-AOC、GSH-Px活性及MDA 含量的影響 結(jié)果見圖3。與青年組比較，老年組大鼠主動脈中T-AOC、GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.01）， MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與老年組比較，黃精中、高劑量組大鼠主動脈中的T-AOC、GSH-Px 活性顯著升高（P＜0.01），MDA 含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，黃精可能通過提高T-AOC、GSH-Px 活性，降低MDA 含量來緩解衰老大鼠主動脈的氧化應激狀態(tài)。

圖3 黃精對衰老大鼠主動脈中T-AOC、GSH-Px 活性及MDA 含量的影響（±s，n=3）Figure 3 Effects of Polygonati Rhizoma on T-AOC and GSH-PX activity and MDA content in aorta of aging rats（±s，n=3）

2.4 黃精對衰老大鼠主動脈中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達的影響 結(jié)果見圖4。與青年組比較，老年組大鼠主動脈中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）；與老年組比較，黃精中、高劑量組大鼠主動脈中ATR、Chk1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），黃精高劑量組大鼠主動脈中p53 蛋白表達顯著降低（P＜0.01），黃精低、中、高劑量組大鼠主動脈中p21 蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，黃精可能通過調(diào)節(jié)ATR/Chk1 信號通路來延緩衰老大鼠的血管老化。

圖4 黃精對衰老大鼠主動脈中ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達的影響（±s，n=3）Figure 4 Effects of Polygonati Rhizoma on the protein expressions of ATR，Chk1，p53 and p21 in aorta of aging rats（±s，n=3）

3 討論

血管老化引起的動脈供血功能降低會引發(fā)多器官的逐步衰退，提示血管老化可能是生物機體衰老的關(guān)鍵啟動因素[10]，若能有效干預血管老化，對降低心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。中藥黃精具有抗衰老作用，《名醫(yī)別錄》記載了黃精能“補中益氣，除風濕、安五臟，久服輕身延年不饑”。近年來關(guān)于黃精抗衰老的藥理學研究主要集中在提高免疫功能[11]、保護心臟[12]、改善腎功能及認知功能障礙等方面[13-15]，關(guān)于黃精對血管老化干預方面的研究少有報道。因此，本研究分別從組織病理、氧化應激等多方面檢測了主動脈中可直接或間接反映血管老化的指標，探討了黃精干預自然衰老大鼠血管老化的可能機制。

隨著年齡的增加，血管在形態(tài)和功能上會出現(xiàn)衰老變化，可見內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞（SMC）形態(tài)學異常，膠原增加，彈力纖維減少、斷裂等[16]。其中，SMC 增殖導致的血管壁增厚是血管老化的特征之一，主要體現(xiàn)在內(nèi)膜和中膜層厚度的變化[17-18]。本研究觀察了自然衰老大鼠主動脈的病理形態(tài)學變化，HE 染色結(jié)果表明，老年組大鼠的主動脈出現(xiàn)內(nèi)膜和中膜明顯增厚，SMC 排列紊亂，彈力膜疏松、厚薄不均且斷裂；經(jīng)黃精干預后，大鼠主動脈內(nèi)膜和中膜增厚不明顯，SMC 排列整齊、規(guī)則，彈力膜疏松、厚薄不均、斷裂現(xiàn)象較少出現(xiàn)。Masson 染色結(jié)果顯示，老年組大鼠主動脈SMC 和膠原纖維（CF）相對含量明顯增多，經(jīng)黃精干預后SMC 和CF 相對含量明顯減少。本實驗結(jié)果從血管形態(tài)學方面證實了黃精能夠改善衰老大鼠的血管老化。

氧化應激在血管老化過程中起著關(guān)鍵作用，T-AOC、GSH-Px、MDA 是氧化應激反應酶或產(chǎn)物的變化指標，可在一定水平上反映血管老化的程度[4，19]。抗氧化酶T-AOC 和GSH-Px 是機體清除細胞內(nèi)活性氧的重要物質(zhì)，是反映機體或者器官（組織）抗氧化能力的重要參數(shù)，也能反映機體內(nèi)氧化應激水平的變化[20]。T-AOC 代表體內(nèi)酶性和非酶性抗氧化物的能力，可綜合反映機體內(nèi)的抗氧化酶活力和抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)；GSH-Px 可有效清除自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，減輕細胞受損程度。MDA 是氧自由基引發(fā)細胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，其含量高低可間接反映細胞的損傷程度。本研究表明，老年組大鼠主動脈氧化應激水平明顯增高，經(jīng)黃精干預后，大鼠主動脈的T-AOC、GSH-Px 活性明顯升高，MDA 含量明顯降低。表明黃精能提高衰老大鼠主動脈的總抗氧化能力，并抑制氧自由基對衰老大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化損傷程度，降低血管氧化應激狀態(tài)，從而延緩血管老化的發(fā)生。

氧化應激是導致血管組織DNA 損傷的主要原因之一[21]。為了避免將損傷的基因組傳遞給子細胞，正常機體內(nèi)具有一套高度保守的DNA 損傷修復機制。DNA 損傷會激活細胞周期DNA 損傷檢測點，使細胞周期停滯，從而給予DNA 充足的時間進行修復，或在損傷不可修復的情況下使細胞死亡。從G1 期結(jié)束到S 期、G2 期，對細胞周期的控制主要由ATR/Chk1通路介導[22]。DNA 損傷發(fā)生后，ATR 聚集于損傷部位并被激活，其下游的Chk1 隨之激活，而Chk1 能激活p53 及其下游基因p21，使細胞周期停滯，以利于DNA 損傷的修復。然而，當ATR 被過度激活或發(fā)生突變時，細胞周期檢測點功能失調(diào)，進而影響到基因組的穩(wěn)定性，使細胞周期過度阻滯，引起細胞增殖出現(xiàn)不可逆的停滯，最終導致細胞衰老[23]。本研究結(jié)果顯示，老年組大鼠主動脈ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達顯著升高；經(jīng)黃精干預后，大鼠主動脈ATR、Chk1、p53、p21 蛋白表達均明顯降低。結(jié)果表明，血管老化涉及到血管組織DNA 損傷檢測點ATR/Chk1 通路的過度激活，而黃精可能通過抑制ATR/Chk1 通路的活化來延緩血管老化。

綜上所述，黃精可延緩自然衰老大鼠的血管老化，可能與其增強血管抗氧化應激能力，抑制ATR/Chk1 通路的活化，從而減輕DNA 損傷應答有關(guān)。