球等鞭金藻MYB基因家族成員全基因組鑒定和特性分析

韓玉瑩　陳璐瑤　陳由強(qiáng)　陳多　陳建楠

摘 要：為了深入理解球等鞭金藻MYB基因家族在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制，使用MYB_DNA-binding保守結(jié)構(gòu)域在球等鞭金藻蛋白序列中篩選出60個(gè)MYB基因家族成員，并對(duì)這些基因家族成員的蛋白（一、二、三級(jí)）結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位、基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域等方面進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：這些MYB基因家族成員可分為3個(gè)cluster，其中R2-MYB和R3-MYB主要集中在cluster 3中，R2R3-MYB則含有大部分家族成員，表明這些基因在球等鞭金藻中起著重要的生物學(xué)功能。不同分支的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同一分支的關(guān)系較近，這表明球等鞭金藻MYB基因家族在演化過(guò)程中形成了一些適應(yīng)性的變化。通過(guò)基因組內(nèi)共線性分析，研究發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻全基因組內(nèi)有177對(duì)片段復(fù)制基因和46對(duì)串聯(lián)復(fù)制基因，其中MYB基因家族有2對(duì)復(fù)制基因，包括串聯(lián)重復(fù)基因?qū)Z004267和IZ007345以及片段重復(fù)基因?qū)Z006462和IZ006102。結(jié)合染色體定位分析，IZ006462和IZ006102位于9號(hào)染色體，這也支持上述片段重復(fù)的判斷。這些重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks值小于1，表明這些基因在擴(kuò)張過(guò)程中受到了基因純化選擇，功能相當(dāng)保守。

關(guān)鍵詞：球等鞭金藻；MYB基因家族；全基因組；光質(zhì)；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q 943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2023）04-0022-14

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.04.004

Genome-wide Identification and Characteristic Analysis ofMYB Gene Family Members in Isochrysis galbana

HAN Yu-ying1，2，3， CHEN Lu-yao1，3， CHEN You-qiang1，2，3， CHEN Duo1，2，3， CHEN Jian-nan1，2，3*

（1. Public Service Platform for Industrialization Development Technology of Marine Biological Medicine and Products，

Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Fujian Key Laboratory of Special Marine Bioresource Sustainable Utilization， Fuzhou，

Fujian 350117， China; 3. College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： In order to further understand the mechanism of the MYB gene family in the gene regulatory network， the MYB_DNA-binding conserved domain was used to screen 60 MYB gene family members from the protein sequences of Isochrysis galbana. Then， the protein （primary， secondary and tertiary） structure prediction and analysis， subcellular structure localization， gene structure， and conserved domains of these gene family members were analyzed. The results showed that： these MYB gene family members could be divided into three clusters， among which R2-MYB and R3-MYB were mainly concentrated in cluster 3， and R2R3-MYB contained most of the family members， indicating that these genes played an important biological function in Isochrysis galbana. The distant relationship between different branches and the close relationship within the same branch indicated that the MYB gene family in Isochrysis galbana had undergone some adaptive changes during the evolution process. Through the analysis of collinearity in the genome， the study found that there were 177 pairs of segmental duplication genes and 46 pairs of tandem duplication genes in the whole genome of Isochrysis galbana， among which there were 2 pairs of duplication genes in the MYB gene family， including the tandem duplicated gene pair IZ004267 and IZ007345， and the segmental duplicated gene pair IZ006462 and IZ006102. By combining with the analysis of chromosomal localization， IZ006462 and IZ006102 were located on chromosome 9， which also supported the above judgment of segmental duplication. The Ka/Ks values of these duplicated gene pairs were less than 1， indicating that these genes were subjected to gene purification selection during expansion and their functions were quite conserved.

Key words： Isochrysis galbana；MYB gene family； Whole genome； Light quality； Expression analysis

球等鞭金藻Isochrysis galbana是一種單細(xì)胞海藻，大小約5 μm，呈金褐色，通常呈橢圓形或球形，有兩條等長(zhǎng)光滑的鞭毛，在水體中能緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)或旋渦狀運(yùn)動(dòng)[1]。球等鞭金藻具有完整的生物代謝通路和細(xì)胞器，具有較高的研究?jī)r(jià)值。作為一種模式生物，球等鞭金藻在光合作用、細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架和藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域被廣泛研究。球等鞭金藻富含多種不飽和脂肪酸，如巖藻黃素和DHA，是一種珍貴的藻類資源[2-5]。MYB基因家族是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝物合成、激素信號(hào)傳導(dǎo)等生理過(guò)程。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中數(shù)量和功能最多[6-7]。對(duì)于該轉(zhuǎn)錄因子在類胡蘿卜素合成過(guò)程中調(diào)控作用的研究也比較多。王拓璋等[8]通過(guò)對(duì)鱷梨全基因組的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因序列分析，得到92個(gè)PaMYB基因序列，轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析顯示有68個(gè)PaMYB基因在干旱脅迫下表達(dá)，72個(gè)PaMYB基因在低溫脅迫下表達(dá)。為深入研究PaMYB轉(zhuǎn)錄因子非生物脅迫提供科學(xué)理論依據(jù)。闕秋霞等[9]從刺葡萄愈傷組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定并克隆出9個(gè)VdMYB家族基因，并利用生物信息學(xué)方法分析和預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)分析其在不同光質(zhì)誘導(dǎo)下的表達(dá)模式，9個(gè)VdMYB啟動(dòng)子序列中均有大量光響應(yīng)等多種生物/非生物響應(yīng)元件。qRT-PCR分析表明，光質(zhì)顯著影響VdMYBs基因的表達(dá)，不同光質(zhì)作用下，VdMYBs基因響應(yīng)模式與結(jié)構(gòu)特征相對(duì)應(yīng)；VdMYB31/VdMYBB1和VdMYB4A基因分別作為正負(fù)調(diào)控因子參與花青素生物合成。本研究為進(jìn)一步解析MYB基因通過(guò)響應(yīng)光信號(hào)參與調(diào)控刺葡萄愈傷組織花青素生物合成的分子機(jī)制提供理論參考。

本課題組前期在球等鞭金藻研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些MYB基因的存在，MYB基因在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的表達(dá)模式也存在差異，藍(lán)光抑制球等鞭金藻巖藻黃素含量的積累，不利于脂肪酸積累，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了R2-MYB轉(zhuǎn)錄因子IZ014151可能是球等鞭金藻光合色素巖藻黃素合成的關(guān)鍵調(diào)控基因。本研究對(duì)球等鞭金藻MYB基因家族進(jìn)行了全面鑒定，包括基因家族成員鑒定和蛋白質(zhì)理化特性分析、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析、基因家族結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析、基因家族特征motif分析、染色體定位分析、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、共線性分析及基因復(fù)制對(duì)中的Ka/Ks分析和基因家族啟動(dòng)子分析，并揭示了其在不同光質(zhì)下的表達(dá)模式和進(jìn)化特征，可為后續(xù)深入研究球等鞭金藻中MYB基因家族的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

球等鞭金藻Isochrysis galbana藻株為L(zhǎng)G007，系本課題組林崗教授分離，保藏于本實(shí)驗(yàn)室。將球等鞭金藻以1×106個(gè)·mL-1密度接種于錐形瓶?jī)?nèi)，均放置于白光培養(yǎng)箱培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度70 μmol·m-2·s-1，溫度（22±1）℃，光照周期24 h，每天定時(shí)搖瓶3次。

1.2 基因家族成員鑒定和蛋白質(zhì)理化特性分析

從Pfam（http：//pfam.xfam.org）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載MYB_DNA-binding的隱馬爾科夫模型的HMM文件，Pfam編號(hào)PF00249。在HMMER 3.0軟件通過(guò)hummerseach命令（hmmsearch.exe./ MYB_DNA-binding.hmm./ IZ.pep>IZ-MYB.txt）提取出含有MYB保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列ID（E-value為1e-05），利用TBtools軟件和球等鞭金藻蛋白fasta文件提取候選ID的序列。通過(guò)Batch CD-Searc（CDD）（Batch CD-Search：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi），將結(jié)構(gòu)域不完整以及重復(fù)冗長(zhǎng)的序列刪除，剩余的即為基因家族成員。將鑒定的基因家族成員的蛋白序列上傳至ProtParam（ProtParam：https：//web.expasy.org/protparam），分析其等電點(diǎn)、分子量等理化性質(zhì)，從基因組的gff文件中提取MYB家族成員的全長(zhǎng)和CDS長(zhǎng)度信息。

1.3 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析

1.3.1 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析 利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi）、ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/all.htm）和WolfPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）在線軟件分別對(duì)基因家族成員蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測(cè)。綜合3種預(yù)測(cè)結(jié)果，評(píng)估預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.3.2 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 利用在線軟件TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.3.3 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 利用在線軟件SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1）對(duì)基因家族蛋白成員進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，輸出結(jié)果mean D顯示“YES”則表示有信號(hào)肽，“NO”表示沒(méi)有信號(hào)肽。

1.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

通利用在線軟件GOR IV（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）預(yù)測(cè)基因家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

利用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用GMQE值和QMEAN值進(jìn)行評(píng)估，GMQE值為0～1，QMEAN值為-4～0，其中GMQE值越大表示模型越可靠，QMEAN值越大表示預(yù)測(cè)蛋白與模板蛋白的匹配度越高。

1.5 基因家族結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

首先利用Batch WB CD search tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在線工具將最終確定的基因家族進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，將分析結(jié)果下載后在Excel中打開(kāi)，只保留Query、From、To、short name這四列，將這四列的信息復(fù)制到TBtools軟件中，并將gff3文件也拖入該軟件中，繪制基因結(jié)構(gòu)圖。將基因家族成員的蛋白序列上傳至Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，分析其保守結(jié)構(gòu)域，保存結(jié)果，然后利用TBtools的Visualize Domain Pattern程序?qū)fam的分析結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.6 基因家族特征motif分析

通過(guò)在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.org）分析保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，將已確定的蛋白序列上傳到MEME中，將得到的mast.xml文件結(jié)果保存，利用蛋白ID和mast.xml文件在TBtools軟件中繪制并優(yōu)化圖片。

1.7 染色體定位分析

用TBtools在gff3文件中提取出球等鞭金藻的基因所在染色體的位置文件以及染色體的長(zhǎng)度文件，在這兩個(gè)文件中提取出基因家族的信息和基因所在染色體的長(zhǎng)度。之后用MapGene2Chromosome v2（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）在線工具進(jìn)行基因染色體定位的繪制和編輯。

1.8 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）和三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum）蛋白質(zhì)序列fasta文件，用ClustalW軟件對(duì)Phaeodactylumtricornutum、Chlamydomonasreinhardtii以及球等鞭金藻基因家族成員蛋白序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，分別構(gòu)建球等鞭金藻、萊茵衣藻和三角褐指藻的MYB家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。利用iTOL在線軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)優(yōu)化。

1.9 共線性分析及基因復(fù)制對(duì)中的Ka/Ks分析

首先利用MCScanX（http：//chibba.pgml.uga.edu/mcscan2）軟件進(jìn)行基因組內(nèi)共線性分析，利用TBtools軟件對(duì)共線性分析結(jié)果進(jìn)行可視化。利用gff文件和blast文件（基因組內(nèi)自身blast文件），運(yùn)行MCScanX軟件得到collinearity 共線性文件和tandem串聯(lián)基因?qū)ξ募?/p>

TBtools軟件可視化步驟如下：先將collinearity文件轉(zhuǎn)換成基因?qū)xt文件（用Text Merge for MCScanX功能），然后利用TBtools軟件從gff文件中提取染色體長(zhǎng)度和基因位置的信息，整理成txt文件，在Text Transformat for Micro-Synteny View功能中輸入染色體長(zhǎng)度和位置的txt文件，得到基因?qū)nks文件。最后在Advanced Circos程序中輸入染色體長(zhǎng)度txt文件和基因?qū)nks文件進(jìn)行可視化分析。

利用TBtools程序中的Simple Ka/Ks Calculator9（NG）計(jì)算重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks（非同義替換率與同義替換率的比值）。當(dāng)Ka/Ks>> 1，基因受正向選擇（Positive selection）；當(dāng)Ka/Ks=1，基因中性進(jìn)化（Neutral evolution）；當(dāng)Ka/Ks<< 1，基因受純化選擇（Purify selection）。

1.10 基因家族啟動(dòng)子分析

利用TBtools程序中的Gtf/Gff3 Sequences Extractor，提取球等鞭金藻CDS上游2000 bp的fasta文件，然后再利用啟動(dòng)子序列在Quick Fasta Extractor or Filter 中提取目標(biāo)基因的啟動(dòng)子序列，檢查文件信息是否正確（Fasta Stater），最后將其序列全部轉(zhuǎn)化成大寫，提交到PlantCARE（http： //bioinformatics. psb. ugent.be/webtools/plantcare/html）網(wǎng)站進(jìn)行順勢(shì)作用元件預(yù)測(cè)。將得到的結(jié)果進(jìn)行整理和簡(jiǎn)化，上傳至TBtools進(jìn)行啟動(dòng)子可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYB基因家族成員鑒定及蛋白特性分析

由表1可知，這60個(gè)MYB基因序列長(zhǎng)度差異較大，長(zhǎng)度在752～4561 bp；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在17517.93～116173.07 Da；氨基酸數(shù)目差異較大，最少的有155個(gè)氨基酸，最多的有1463個(gè)；等電點(diǎn)在4.34～10.18，其中只有少數(shù)為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)在22.02～77.91（>40時(shí)認(rèn)為是不穩(wěn)定蛋白），脂肪系數(shù)在52.48～84.96，平均親水性均小于0，所以該家族成員多為不穩(wěn)定親水性蛋白。以上結(jié)果表明，同一家族成員的理化特性可能存在較大的差異，因此，它們的結(jié)構(gòu)功能也會(huì)有所不同。

2.2 MYB基因家族亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

利用3種在線軟件對(duì)球等鞭金藻MYB蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。Cell-PLoc的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有59個(gè)MYB蛋白定位于細(xì)胞核，只有1個(gè)蛋白（IZ003768）定位于細(xì)胞膜。ProtComp9.0的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示44個(gè)MYB蛋白定位于細(xì)胞核。WolfPSORT的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示有56個(gè)MYB蛋白定位于細(xì)胞核，其中IZ001203蛋白定位于液泡，IZ007734和IZ008056蛋白定位于線粒體，IZ010753蛋白定位于葉綠體。在WolfPSORT和ProtComp 9.0軟件均預(yù)測(cè)IZ008056蛋白定位于線粒體。對(duì)于IZ001203、IZ007734、IZ010753、IZ008056蛋白，3個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果不一致，還有待進(jìn)一步確定。由表2可知，3個(gè)軟件預(yù)測(cè)均定位于細(xì)胞核的蛋白有34個(gè)（IZ000218、IZ001231、IZ001488、IZ001787、IZ001968、IZ003225、IZ003491、IZ003666、IZ003672、IZ004101、IZ004267、IZ004469、IZ004656、IZ004905、IZ005555、IZ005588、IZ006315、IZ007092、IZ007542、IZ007617、IZ010306、IZ010353、IZ010554、IZ010827、IZ011696、IZ011780、IZ011921、IZ012323、IZ012697、IZ012811、IZ013719、IZ014349、IZ014568、IZ014686），故推測(cè)這些蛋白有著相似的結(jié)構(gòu)和表型理化特征。

對(duì)目的蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明除了IZ001203、IZ003517蛋白（圖1）外，其他均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明他們都不屬于跨膜類蛋白，因此也不會(huì)產(chǎn)生跨膜運(yùn)動(dòng)。而IZ001203蛋白在前端約25個(gè)氨基酸殘基的位置，IZ003517蛋白在末端約25個(gè)氨基酸殘基的位置有跨膜結(jié)構(gòu)域，故推測(cè)IZ001203和IZ003517蛋白具跨膜功能。對(duì)目的蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明60個(gè)蛋白中只有IZ001203蛋白（圖2）有信號(hào)肽。結(jié)合蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果，IZ001203蛋白具有跨膜功能，與信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果相符。綜上，IZ001203屬穩(wěn)定親水性蛋白，有信號(hào)肽而且可以進(jìn)行跨膜運(yùn)動(dòng)。

2.3 MYB基因家族二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

由表3可知，對(duì)獲得的60個(gè)MYB基因編碼的蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，這60個(gè)蛋白均含有α-螺旋，所占比例在18.61%～58.41%；無(wú)規(guī)則卷曲是最主要的結(jié)構(gòu)形式，所占比例高達(dá)35.2%～68.61%；延伸鏈結(jié)構(gòu)所占比例最少，在2.27%～22.93%。

由圖3可知，對(duì)球等鞭金藻MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)，可知每個(gè)MYB_DNA-binding結(jié)構(gòu)域都有3個(gè)α-螺旋，這3個(gè)螺旋之間互相形成一定的角度，且第2個(gè)與第3螺旋之間形成1個(gè)β-轉(zhuǎn)角，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本相符。

2.4 MYB基因家族結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)MYB_DNA-binding結(jié)構(gòu)域在每個(gè)MYB蛋白上重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)，將60個(gè)MYB家族成員按照R1-MYB、R2-MYB（R2R3-MYB）、R3-MYB、R4-MYB這4種類型進(jìn)行歸類，詳細(xì)信息見(jiàn)表4。結(jié)果表明球等鞭金藻R1-MYB有19個(gè)，R2-MYB有22個(gè)，R3-MYB有6個(gè)，R4-MYB有3個(gè)。

由圖4可知，60個(gè)球等鞭金藻MYB基因家族成員的結(jié)構(gòu)存在較大差異，其中有21個(gè)基因無(wú)內(nèi)含子，其他基因內(nèi)含子數(shù)目為1～10個(gè)，編碼區(qū)數(shù)量為1～10個(gè)。綜合來(lái)看，MYB基因家族成員中IZ004101基因長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為4561 bp，且內(nèi)含子和編碼區(qū)數(shù)量最多。保守結(jié)構(gòu)域大多數(shù)分布在基因的5′端，且保守結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度相似。

此外，還發(fā)現(xiàn)有10個(gè)MYB成員有MYB_DNA-bind_6結(jié)構(gòu)域（IZ00218、IZ012697、IZ012811、IZ001231、IZ003225、IZ004469、IZ007941、IZ011921、IZ003491、IZ004905）。MYB_DNA-binding和MYB_DNA-bind_6家族均包含來(lái)自MYB蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所以推測(cè)MYB_DNA-binding、MYB_DNA-bind_6的保守結(jié)構(gòu)域相似。

2.5 MYB基因家族特征motif分析

由圖5可知，MYB基因家族motif分析，該基因家族共有10個(gè)motif，motif 4、6、2多位于MYB蛋白的5′端，motif 1位于MYB功能結(jié)構(gòu)域中間位置，motif 7位于MYB功能結(jié)構(gòu)域3′端。Motif數(shù)量最少的僅有1個(gè)，最多有12個(gè)。大部分球等鞭金藻MYB蛋白均不含motif 9和motif 8，只有IZ001231、IZ011246、IZ003491含有motif 9，IZ004267、IZ007345含有motif 8。

2.6 MYB基因家族染色體定位

由圖6可知，球等鞭金藻MYB基因家族各成員分布在9條染色體上，每條染色體上基因數(shù)目存在差異，數(shù)量在3～12個(gè)，其中8號(hào)染色體上數(shù)量最多，共有12個(gè)基因，且各基因在染色體上的距離較近，其中IZ003517和IZ003491基因在染色體上的位置相近。其次是1號(hào)染色體，包含9個(gè)基因，其中IZ001203和IZ001231這兩個(gè)基因位置相近。12號(hào)和9號(hào)染色體上，IZ010306和IZ010353、IZ005588和IZ005555基因位置也相鄰。從11號(hào)、12號(hào)、8號(hào)染色體中可以看到，在染色體上的某個(gè)區(qū)域家族成員比較集中。IZ004469和IZ004470基因長(zhǎng)度分別為1404 bp、1469 bp，且均定位于細(xì)胞核。結(jié)合染色體定位分析發(fā)現(xiàn)IZ004469和IZ004470這兩個(gè)基因位置緊密相連，形成明顯的基因簇。

2.7 MYB基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

由圖7可知，球等鞭金藻、萊茵衣藻和三角褐指藻的MYB基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)劃分為3個(gè)cluster，cluster 1包含17個(gè)成員，8個(gè)為球等鞭金藻的MYB家族成員；cluster 2僅包含5個(gè)球等鞭金藻的MYB家族成員；cluster 3包含成員最多，83個(gè)成員中包含47球等鞭金藻的MYB家族成員。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)分析可知，4R-MYB主要在cluster 2中，包括IZ001032和IZ001488。此外，第9 d白光組與藍(lán)光組的差異表達(dá)基因IZ014151、IZ006462（R2-MYB轉(zhuǎn)錄因子）也被劃分到cluster 2中。R1-MYB 在cluster1中有分布，但主要和R2-MYB、R3-MYB集中在cluster 3中。

2.8 基因組內(nèi)共線性分析及基因復(fù)制對(duì)分析

由圖8可知，為球等鞭金藻基因組內(nèi)共線性分析，發(fā)掘MYB家族的基因復(fù)制事件。黃色的一圈每個(gè)模塊表示球等鞭金藻基因組的染色體，紅色的一圈代表染色體相對(duì)應(yīng)的基因密度。共線性基因（片段復(fù)制基因）用線條連接，灰色連線為球等鞭金藻基因中全部片段復(fù)制基因?qū)Φ倪B線，最外圈標(biāo)注為MYB基因家族的片段復(fù)制基因ID，其共線性關(guān)系用紅色連線展示。通過(guò)共線性分析發(fā)現(xiàn)，球等鞭金藻全基因組內(nèi)有177對(duì)片段復(fù)制基因和46對(duì)串聯(lián)復(fù)制基因。其中MYB有2對(duì)復(fù)制基因，表明MYB基因家族的擴(kuò)張主要來(lái)自串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制。

由表5可知，顯示這些重復(fù)基因Ka/Ks＜1，表明MYB基因家族擴(kuò)張過(guò)程中，基因復(fù)制對(duì)受到基因純化選擇，所以它們的功能也相當(dāng)保守。

3 結(jié)論與討論

MYB_DNA-binding保守結(jié)構(gòu)域是一種廣泛存在于不同生物界中的轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域，通常由3個(gè)串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域組成：R1-MYB、R2-MYB和R3-MYB。這3個(gè)結(jié)構(gòu)域中的R2-MYB結(jié)構(gòu)域通常是DNA結(jié)合的主要部位，包含了一個(gè)雙頂花環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)通過(guò)與DNA中的核苷酸相互作用，實(shí)現(xiàn)MYB蛋白與DNA序列的結(jié)合[10]。MYB_DNA-binding保守結(jié)構(gòu)域在植物、動(dòng)物和真菌中均有發(fā)現(xiàn)，它對(duì)于調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、代謝物合成以及激素信號(hào)傳導(dǎo)等生理過(guò)程具有重要作用[11]。本研究利用Myb_DNA-binding保守結(jié)構(gòu)域在球等鞭金藻蛋白序列、利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)以及hummer程序中篩選鑒定到60個(gè)MYB基因家族成員。對(duì)這些基因家族成員蛋白一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位、基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域等方面進(jìn)行分析。經(jīng)分析球等鞭金藻MYB家族基因序列長(zhǎng)度差異較大，在752～4561 bp，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在17517.93～116173.07 Da，氨基酸數(shù)目差異較大，155～1463個(gè)，多為不穩(wěn)定親水性蛋白，其中只有IZ001203和IZ003517蛋白為跨膜類蛋白；分布在9條染色體上，IZ004469和IZ004470這兩個(gè)基因在8號(hào)染色體上緊密相連，形成明顯的基因簇。

球等鞭金藻MYB基因家族可以劃分為3個(gè)cluster，其中R2-MYB和R3-MYB主要集中在cluster 3中，不同分支的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同一分支的關(guān)系較近，可以推測(cè)，球等鞭金藻MYB基因家族在不斷的演化過(guò)程中形成一些適應(yīng)性的變化。

基因共線性是指在具有同源性關(guān)系的2個(gè)物種中，其基因組中有共同的連鎖基因，且同源基因的相對(duì)順序具有較高保守性的現(xiàn)象[12]。在生物進(jìn)化中，基因組會(huì)在全基因組復(fù)制、染色體重組、染色體倒位和易位等過(guò)程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化[13-14]。因此，基因組的共線性分析在非編碼序列的確認(rèn)、新測(cè)序物種的注釋和全基因組復(fù)制事件的估計(jì)等過(guò)程中具有重要作用[15-16]。

通過(guò)基因組內(nèi)共線性分析，發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻全基因組內(nèi)有177對(duì)片段復(fù)制基因和46對(duì)串聯(lián)復(fù)制基因。其中MYB基因家族有2對(duì)復(fù)制基因，串聯(lián)重復(fù)基因?qū)Γ篒Z004267與IZ007345；片段重復(fù)基因?qū)Γ篒Z006462與IZ006102。結(jié)合染色體定位分析，IZ006462與IZ006102位于同一條染色體（9號(hào)染色體），且在染色體上的位置相近，這也支持上述片段重復(fù)的判斷。這些重復(fù)基因?qū)a/Ks＜1，表明MYB基因家族擴(kuò)張過(guò)程中，這些重復(fù)基因?qū)Χ际艿交蚣兓x擇，所以它們的功能也相當(dāng)保守。

球等鞭金藻MYB基因家族成員均含有多個(gè)光響應(yīng)元件，且光響應(yīng)元件是基因家族成員所有啟動(dòng)子順式作用元件中最多的作用元件，可能與光的接收、生物鐘的調(diào)控有關(guān)。光會(huì)影響植物在整個(gè)生命周期的發(fā)展過(guò)程，在植物中凡是能感受到不同光現(xiàn)象的物質(zhì)均被稱為光受體。光周期途徑是光受體對(duì)不同的光信號(hào)感知后做出一系列的響應(yīng)活動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控植物開(kāi)花，影響根、莖的形成以及調(diào)節(jié)葉落和芽休眠時(shí)間的作用[17-19]。此外，特定基因組的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是光調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵機(jī)制之一。也有許多與植物生長(zhǎng)激素相關(guān)的響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件及水楊酸響應(yīng)元件等，說(shuō)明這3個(gè)家族與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)；還有其他非生物脅迫響應(yīng)元件，說(shuō)明它們可能參與逆境脅迫響應(yīng)等其他功能。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-03-17

作者簡(jiǎn)介：韓玉瑩，女，1994年生，碩士，主要從事分子生物學(xué)研究。

*通信作者：陳建楠，男，1991年生，實(shí)驗(yàn)師，主要從事球等鞭金藻培育研究（E-mail：381220681@qq.com）。

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目 （CARA-170501）。