番木瓜賴氨酸基序類受體激酶LysM-RLK基因家族鑒定及生物信息學(xué)分析

郭盼　孔華　王雨　戴云素　賈瑞宗　周瑤　郭安平　紀(jì)長綿　馬春花

關(guān)鍵詞：番木瓜；LysM-RLK 家族；生物信息分析；基因表達(dá)；蛋白三維結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因在植物基因組中以多拷貝或基因家族的形式存在[1–3]。例如，水稻和擬南芥分別有41 908 和31 135 個(gè)基因，分別包含13 055 和10 193 個(gè)基因家族[1]。ZHANG 等[2]研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因家族基因成員的數(shù)量不僅在屬內(nèi)物種之間存在差異，而且在一個(gè)物種內(nèi)也存在變化，基因家族成員數(shù)量的變化與生物性狀的遺傳變異顯著相關(guān)。因此，系統(tǒng)鑒定并解析基因家族進(jìn)化關(guān)系是理解目標(biāo)基因家族參與植物生物學(xué)過程的基礎(chǔ)。類受體蛋白激酶家族（receptor-like kinase，RLK）是植物基因組中一個(gè)大基因家族，前期研究主要集中于基因家族的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析[4]，較少涉及解析該家族成員的功能和活性。第一個(gè)植物RLK 基因在玉米（Zea mays L.）中被鑒定[5]。在雙子葉植物模式物種擬南芥（ Arabidopsisthaliana）中，至少鑒定了610 個(gè)RLK 基因，約占其蛋白質(zhì)編碼基因的2.5%[4]。在單子葉植物模式物種水稻（Oryza sativa L.）中，RLK 家族由1130個(gè)基因組成，其成員數(shù)量是擬南芥的1.85 倍[6]。

RLK 基因已被證明參與包括植物生長發(fā)育、激素信號(hào)感知、抗病和抗逆等在內(nèi)的生物學(xué)過程[7]。賴氨酸基序受體激酶（LysM-RLK）是植物中重要的RLK 亞家族之一，其成員屬于包含賴氨酸基序（LysM）的蛋白質(zhì)，是識(shí)別微生物相關(guān)分子模式（ microbe-associated molecular patterns，MAMPs）的模式識(shí)別受體（pattern recognitionreceptors， PPR）[8-10]。LysM 首次在芽孢桿菌噬菌體溶菌酶中發(fā)現(xiàn)之后，在來自糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）的名為肽聚糖水解酶的酶中亦發(fā)現(xiàn)了LysM[11-12]。植物細(xì)胞膜上有一個(gè)識(shí)別受體，其包含LysM 結(jié)構(gòu)域，能夠與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)結(jié)合并傳遞信號(hào)以激活免疫反應(yīng)，這一類蛋白根據(jù)亞細(xì)胞定位的預(yù)測和結(jié)構(gòu)域的差異，可以分為LysM 類受體激酶（LysM-containing recetor-likekinases， LYKs ） 、LysM 類受體蛋白（ LysMcontainingreceptor-like protein， LYPs）、細(xì)胞外LysM 蛋白（extracellular LysM， LysMe）及非分泌型胞內(nèi)LysM 蛋白（ intracellular non-secretoryLysM genes， LysMn），不同物種的單個(gè)蛋白含LysM結(jié)構(gòu)域的數(shù)量有所不同，這是長期進(jìn)化導(dǎo)致的差異，且與蛋白的功能相關(guān)[13]。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展和相關(guān)組學(xué)數(shù)據(jù)的積累，已證實(shí)LysM 結(jié)構(gòu)域蛋白廣泛存在于動(dòng)植物生物體基因組中[14-15]。

番木瓜（Carica papaya L.）是熱帶特色水果，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，屬于熱區(qū)重要經(jīng)濟(jì)作物之一。番木瓜基因組?。?50.3 Mb）、常年開花結(jié)果、種子多、生長快、代際短及遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟，是果樹研究重要模式材料[16]。已有研究報(bào)道表明LysM-RLK 家族參與植物抗病和脅迫響應(yīng)[17]，然而其在番木瓜全基因組水平基礎(chǔ)特征信息、進(jìn)化關(guān)系及基因表達(dá)模式研究的不足嚴(yán)重阻礙了其在番木瓜新品種選育中的開發(fā)利用。本研究采用生物信息學(xué)方法在全基因組水平系統(tǒng)鑒定了番木瓜LysM 家族基因，并分析了其家族成員的進(jìn)化關(guān)系、染色體分布、基因蛋白和結(jié)構(gòu)特征等?；谝延械?4 份代表性轉(zhuǎn)錄組樣品數(shù)據(jù)，系統(tǒng)解析了番木瓜LysM 家族成員在不同組織、不同發(fā)育過程和不同脅迫處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄模式及表達(dá)分化。相關(guān)研究為理解番木瓜LysM家族起源演化，復(fù)制基因表達(dá)分化及其在不同生物學(xué)過程中轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式提供重要理論基礎(chǔ)，將促進(jìn)其在番木瓜抗病育種中的研究和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

從Pfam 數(shù)據(jù)庫下載LysM 種子文件，用hmmer search 方法篩選番木瓜和葡萄（Vitis viniferaL.）基因組中對(duì)應(yīng)的同源基因作為候選基因。

1.2 方法

1.2.1 番木瓜LysM-RLK 成員鑒定及理化性質(zhì)與亞細(xì)胞定位分析 利用NCBI Conserved DomainSearch（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫，基于保守結(jié)構(gòu)域、在線分析工具Pfam（ http：//pfam.xfam.org/ ） 和SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）[18]預(yù)測保守域[19]。利用ExPASy（http：//expasy.org/）在線軟件對(duì)從番木瓜基因組中鑒定到的7 條候選類受體蛋白激酶家族的蛋白序列進(jìn)行分子量、理論等電點(diǎn)預(yù)測。利用SMART（http：//smart.embi-heidelberg.de/）在線軟件對(duì)所有基因保守結(jié)構(gòu)域的位置進(jìn)行預(yù)測。進(jìn)一步利用在線工具WoLFPSORT（http：//wolfpsort.hgc.jp）對(duì)番木瓜LysM-RLK 基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.2 番木瓜LysM-RLK 家族蛋白的基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域分析及蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用TBtools 軟件[20]對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線軟件基于相似度較高的基序（motif），分析番木瓜LysM-RLK基因家族成員蛋白序列保守特征及特征展示。使用SMART（https：//smart.embl.de/）在線軟件進(jìn)行LysM-RLK 基因結(jié)構(gòu)域預(yù)測。使用人工智能網(wǎng)絡(luò)算法工具AlphaFold2[21]預(yù)測番木瓜LysM-RLK 家族蛋白三維結(jié)構(gòu)，獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)PDB 文件。將獲得的PDB 文件輸入到PyMOL V2.3[22]軟件包中，對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化展示。

1.2.3 番木瓜LysM-RLK 蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析及LysM-RLK 基因染色體定位 為了闡明番木瓜（Carica papaya）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和葡萄（Vitis vinifera L.）中的LysM-RLK 家族成員之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，構(gòu)建LysM-RLK 家族進(jìn)化樹。采用muscle v3.8.31 軟件對(duì)來自番木瓜（7個(gè)LysM-RLKs）、擬南芥（4 個(gè)LysM-RLKs）和葡萄（11 個(gè)LysM-RLKs）的22 個(gè)LysM-RLK 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。使用BMGE1.12 軟件，選用參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，在多重序列比對(duì)中選擇適合系統(tǒng)發(fā)育推斷的高質(zhì)量比對(duì)區(qū)域。最后，利用IQ-TREE（V2.1.2）軟件[23]構(gòu)建LysM-RLK亞基因家族的最大似然（ maximum-likelihood，ML）系統(tǒng)發(fā)育樹。

根據(jù)番木瓜基因組注釋文件，提取番木瓜LysM-RLK 基因在染色體上的位置信息，利用在線程序（http：//mg2c.iask.in/mg2c v2.1/）展示其在番木瓜基因組上位置分布特征。

1.2.4 復(fù)制基因鑒定及選擇壓力（Ka/Ks）分析及復(fù)制基因共線性鑒定 使用Dup Gen finder[24]流程鑒定番木瓜LysM-RLK 基因家族的復(fù)制基因?qū)皬?fù)制類型。進(jìn)一步計(jì)算復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks 值，評(píng)估其在進(jìn)化過程中面臨的選擇壓力。首先利用Muscle（https：//www.ebi.ac.uk//Tools/msa/muscle/）在線軟件對(duì)每一個(gè)復(fù)制基因?qū)Φ鞍仔蛄羞M(jìn)行全局比對(duì)。然后，利用ParaAT（V2.0）軟件[25]將比對(duì)序列反向翻譯成對(duì)應(yīng)的cds 序列。最后，利用KaKscalculator 軟件[26]計(jì)算非同義替換率（Ka）、同義替換率（Ks）和Ka/Ks[24]值，使用多重序列共線性搜索工具M(jìn)Cscan 搜索番木瓜全基因組的同源共線片段。

1.2.5 番木瓜LysM-RLK 家族啟動(dòng)子分析 根據(jù)番木瓜基因組注釋gff 文件，提取得到番木瓜LysM 基因翻譯起始位點(diǎn)上游2000 bp 的序列作為候選啟動(dòng)子區(qū)域。通過在線軟件PlantCARE（ http：//bioinformatic.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析LysM-RLK 家族啟動(dòng)子順式作用元件。

1.2.6 LysM-RLK 基因在生物與非生物脅迫條件下的表達(dá)模式分析 番木瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)收集。從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載84 份與番木瓜相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)29條、不同組織轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)15 條，生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)40 條，共組成43 組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，具體信息見附表S1。

基因表達(dá)定量。轉(zhuǎn)錄原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過Fastp軟件包質(zhì)控以后，用HISAT2 軟件[27]將高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)比對(duì)到番木瓜參考基因組得到序列比對(duì)文件。然后采用StringTie 軟件[28]組裝比對(duì)上的reads，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本序列，并采用FPKM 算法對(duì)read count 做歸一化處理計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。

差異表達(dá)及表達(dá)分化基因鑒定。最后利用DESeq2 軟件[29]鑒定差異表達(dá)基因：差異倍數(shù)FC≥2，差異顯著性FDR>0.05。利用R 語言的heatmap函數(shù)繪制LysM-RLK 基因表達(dá)量熱圖。同一組樣品中復(fù)制基因?qū)χg表達(dá)量的比值≥2，定義為表達(dá)顯著分化的復(fù)制基因?qū)Α?/p>

1.2.7 番木瓜LysM-RLK 家族蛋白的基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域分析及蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用TBtools[20]軟件對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線軟件基于相似度較高的基序，即motif，分析番木瓜LysM-RLK基因家族成員蛋白序列保守特征及特征展示。使用在線軟件SMART（https：//smart.embl.de/）進(jìn)行LysM-RLK 基因結(jié)構(gòu)域預(yù)測。使用人工智能網(wǎng)絡(luò)算法工具AlphaFold2[21]預(yù)測番木瓜LysM-RLK 家族蛋白三維結(jié)構(gòu)，獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)PDB 文件。將獲得的PDB 文件輸入到PyMOL V2.3[22]軟件包中，對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化展示。

1.2.8 番木瓜LysM-RLK 家族加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 通過炭疽病、番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus，PLDMV）、禾生素（CTS）、干旱等處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選差異表達(dá)基因（DEGs）。處理組與對(duì)照組差異基因鑒定參數(shù)為|log2 FC（FPKM）|≥1，F(xiàn)DR≤0.05。共篩選出10 490 個(gè)差異基因。采用R 語言的WGCNA 包構(gòu)建LysM-RLK 家族基因的加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。分析鑒定共表達(dá)模塊，在模塊中鑒定基因共表達(dá)差異表達(dá)基因作為核心基因（hub-genes），并利用Cytoscape 軟件對(duì)核心基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（hub-network）可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 LysM-RLK 家族基因鑒定及特征分析

利用5 個(gè)擬南芥的LysM-RLK 家族基因作為參考[4]，將其比對(duì)到番木瓜和葡萄的蛋白序列，根據(jù)序列相似性篩選到LysM-RLK 候選同源基因（identify≥45%）。如果其編碼區(qū)同時(shí)存在N 末端LysM 基序、1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和C 末端Pkinase保守結(jié)構(gòu)域的經(jīng)典的LysM-RLK 結(jié)構(gòu)域模式，則認(rèn)為其屬于LysM-RLK 基因家族。本研究在番木瓜、擬南芥和葡萄基因組中分別鑒定到7 個(gè)、4個(gè)和11 個(gè)LysM-RLK 家族基因。為獲得番木瓜LysM-RLK 家族蛋白的理化特征信息，利用生物信息學(xué)方法解析了番木瓜的7 個(gè)LysM-RLK 基因家族成員的蛋白長度、分子量、理論等電點(diǎn)和亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明其氨基酸序列大小為445～692，分子量為49.85～76.10 kDa，等電點(diǎn)為5.12～8.69（表1）。利用在線軟件WoLFPSORT 預(yù)測番木瓜7 個(gè)LysM-RLK 基因的亞細(xì)胞定位信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7 個(gè)家族成員定位于不同亞細(xì)胞區(qū)域。其中1 個(gè)基因（CpLYK5）位于細(xì)胞質(zhì)膜，1 個(gè)基因（ CpLYK5-like ） 位于胞質(zhì)， 1 個(gè)基因位于（CpLYK2）胞外區(qū)域，其余4 個(gè)基因（CpLYK4-1、CpLYK3、CpLysM-RLK3、CpLYK4）定位于葉綠體（表1）。該分析結(jié)果暗示不同的LysM-RLK基產(chǎn)物可能被轉(zhuǎn)運(yùn)到番木瓜不同的亞細(xì)胞區(qū)域，進(jìn)而參與不同的生物學(xué)過程。

2.2 LysM-RLK 家族的基因結(jié)構(gòu)特征及保守結(jié)構(gòu)域分析

外顯子的獲得或丟失可能引起基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能的變化[30]。因而，本研究比較了LysM-RLK家族成員之間的基因結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LysM-RLK 基因主要由1～11 個(gè)外顯子構(gòu)成，其中CpLYK5 屬于單外顯子基因，CpLYK3基因長度達(dá)到53 476 kb，包含11 個(gè)較小的外顯子。CpLYK3 存在多個(gè)大內(nèi)含子插入的現(xiàn)象，導(dǎo)致其基因長度明顯大于該家族的其他基因（圖1A）。外顯子數(shù)量的增加可以增加mRNA 剪接模式多樣性，并導(dǎo)致包括DNA 結(jié)合親和力[31]，蛋白質(zhì)溶解度[32]和蛋白質(zhì)功能[30]等改變，內(nèi)含子的插入能夠增強(qiáng)目標(biāo)基因的表達(dá)并影響轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的衰變或定位[30， 33]。以上證據(jù)暗示內(nèi)含子插入和外顯子數(shù)量差異可能會(huì)引起番木瓜LysM-RLK 家族不同成員之間的結(jié)構(gòu)差異和功能分化。

基因家族中共有的基序（motif）可能是該基因家族保守結(jié)構(gòu)域序列，暗示其是基因家族基礎(chǔ)功能核心序列。利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線工具對(duì)番木瓜的LysM-RLK 基因家族成員進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定（圖1B，表2）。結(jié)果表明番木瓜LysM-RLK 蛋白的motif 長度最小為15，最大為50。在MEME 鑒定得到的10 個(gè)motif中，motif2 的保守性得分最高，并且按照一致的順序排布（圖1B）。

2.3 LysM-RLK 基因家族進(jìn)化關(guān)系及染色體位置分布特征

為了揭示LysM-RLK 基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用極大似然法構(gòu)建了葡萄、番木瓜和擬南芥的LysM-RLK 基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明番木瓜的LysM-RLK 基因家族成員分成3 個(gè)獨(dú)立分支（LysM-Ⅱ～LysM-IV），其中分支LysM-Ⅱ中含有2 個(gè)番木瓜LysM-RLK 基因，分支LysM-Ⅲ中含有2 個(gè)番木瓜LysM-RLK基因，分支LysM-IV 中含有3 個(gè)番木瓜LysM-RLK基因，暗示其在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了功能分化。

解析LysM-RLK 在番木瓜基因組上分布特征，結(jié)果表明番木瓜的7 個(gè)LysM-RLK 家族基因主要分布在chr02、Chr04、chr07 和chr09 染色體上（圖3）。CpLYK5-like 分布在2 號(hào)染色體的遠(yuǎn)端粒區(qū)（chr02： 37 470 447～37 472 556 bp）。CpLYK2（chr04： 4 182 588～4 189 453 bp）、CpLYK5（chr04：32 118 333～32 120 412 bp） 、CpLYK4-1 （ chr04：34 635 116～34 637 111 bp）分別位于4 號(hào)染色體遠(yuǎn)端粒區(qū)域。CpLYK3（chr07： 9 452 026～9 505 502 bp）、CpLYK4（chr07： 15 723 626～15 726 091 bp）分布在7號(hào)染色體的遠(yuǎn)端粒區(qū)域。CpLysM-RLK3（chr09：7 478 070～7 487 382 bp）分布于9 號(hào)染色體的遠(yuǎn)端粒區(qū)域。

2.4 早期基因復(fù)制事件驅(qū)動(dòng)番木瓜LysM-RLK家族的形成

已有研究表明基因復(fù)制是導(dǎo)致植物基因家族擴(kuò)張的重要進(jìn)化驅(qū)動(dòng)力，促進(jìn)基因家族內(nèi)部同源基因之間功能分化，為植物的遺傳多樣性提供重要支撐[33]?；驈?fù)制分析發(fā)現(xiàn)番木瓜LysM-RLK家族中5 個(gè)基因均來源于dispersed 類型復(fù)制（表3），表明基因復(fù)制對(duì)其家族成員形成具有重要貢獻(xiàn)。番木瓜與葡萄、擬南芥一樣經(jīng)歷了大約1.2億年前的一次真雙子葉植物共有的祖先全基因組三倍化事件（γ-WGT）[34-35]。然而，本研究未發(fā)現(xiàn)由全基因組復(fù)制事件（whole genome duplication，WGD）對(duì)番木瓜LysM-RLK 基因家族的貢獻(xiàn)（表3），暗示LysM-RLK 基因家族的基因復(fù)制可能發(fā)生在γ-WGT 事件之后。因而，本研究進(jìn)一步評(píng)估了基因復(fù)制發(fā)生的時(shí)間（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)番木瓜LysM-RLK 家族的基因發(fā)生復(fù)制的時(shí)間大約在1.83 百萬年～3.00 百萬年之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于真雙子葉γ-WGT 事件發(fā)生時(shí)間。推測祖先基因組三倍化事件（γ-WGT）產(chǎn)生的LysM-RLK 復(fù)制基因（wgd-type duplicated genes）可能在番木瓜基因組進(jìn)化過程中被丟失[33， 35]，而番木瓜基因組中新的基因復(fù)制促進(jìn)了番木瓜LysM-RLK 家族的形成。

為了明確重復(fù)基因的位點(diǎn)關(guān)系，在番木瓜基因組上用紅線將LysM-RLK 復(fù)制基因?qū)ο噙B（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 號(hào)染色體上含有3 個(gè)基因參與復(fù)制，2 號(hào)染色體和9 號(hào)染色體上都含有1 條基因參與復(fù)制。在番木瓜的7 個(gè)LysM-RLK 基因中有5 個(gè)基因被鑒定為基因復(fù)制來源基因。LysM-RLK基因家族中，位于2 號(hào)染色體的基因CpLYK5-like是LysM-RLK 基因家族中最早出現(xiàn)基因復(fù)制的基因，并分化出基因CpLYK2 和基因CpLYK4-1 兩個(gè)基因，推測4 號(hào)染色體的CpLYK2、CpLYK4-1可能來自2 號(hào)染色體CpLYK5-like 內(nèi)部的基因復(fù)制事件。CpLysM-RLK3 由CpLYK5 復(fù)制得到，推測9 號(hào)染色體的CpLysM-RLK3 可能來自4 號(hào)染色體CpLYK5 的基因復(fù)制事件。

2.5 番木瓜LysM-RLK 家族基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件預(yù)測

本研究將番木瓜LysM-RLK 基因5?UTR 上游2000 bp 的序列作為啟動(dòng)子序列。通過PlantCARE軟件分析啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。發(fā)現(xiàn)番木瓜LysM-RLK 基因啟動(dòng)子區(qū)域的包括組織特異性元件、非生物脅迫相關(guān)元件、激素響應(yīng)元件和功能相關(guān)元件4 類順式作用元件（圖5）。其中CpLYK4 和CpLysM-RLK3 含有參與低溫響應(yīng)順式元件。CpLYK5、CpLYK4-1 和CpLYK4 含有參與水楊酸反應(yīng)的順式作用元件。部分基因的啟動(dòng)子序列中包含包括多種激素響應(yīng)、低溫應(yīng)答及逆境響應(yīng)等生物學(xué)過程相關(guān)的順式作用元件。上述結(jié)果暗示LysM-RLK 基因可能參與調(diào)控番木瓜的抗逆防御和生長發(fā)育等重要生物學(xué)過程。

2.6 LysM-RLK 基因在番木瓜不同組織和生物學(xué)過程中表達(dá)模式

為了研究番木瓜中LysM-RLK 家族潛在的生物學(xué)功能，本研究系統(tǒng)地解析其在番木瓜生物脅迫、非生物脅迫條件下及不同組織中的基因表達(dá)模式（圖6A）。通過對(duì)84 個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)定量分析，發(fā)現(xiàn)番木瓜LysM-RLK 基因家族成員明顯地分成高表達(dá)和低表達(dá)2 個(gè)模式。CpLYK4-1 和CpLYK5-like 基因整體表現(xiàn)出低表達(dá)的趨勢，而CpLYK2、CpLysM-RLK3、CpLYK4、CpLYK5 和CpLYK3 傾向于高表達(dá)。值得注意的是CpLYK4-1 和CpLYK4 在不同病毒和炭疽病侵染條件下（ANT， AIN1， PAPMV， SIN2， G20， Y61）顯著差異表達(dá)，并且相對(duì)于對(duì)照組其表達(dá)量明顯上調(diào)，暗示它們在番木瓜抗病響應(yīng)中具有重要生物學(xué)功能。相對(duì)于其他組織，CpLYK5-like 在正常的根組織中特異性高表達(dá)，并且在干旱脅迫條件下表達(dá)量明顯下調(diào)，表明其在根組織中負(fù)調(diào)控干旱脅迫。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，干旱脅迫過程（0～20 d）中，CpLYK4 在葉片組織表達(dá)量逐漸上調(diào)，在根組織表達(dá)量逐漸下調(diào)。同時(shí)，CpLYK4 在番木瓜炭疽病侵染過程中高表達(dá)量，并且隨著侵染時(shí)間延長（0、24、48 h）表達(dá)量逐漸上調(diào)。以上結(jié)果表明CpLYK4 同時(shí)參與響應(yīng)葉片干旱脅迫和炭疽病侵染過程。CpLYK5 和CpLYK3 兩個(gè)基因在不同組織、不同發(fā)育過程、生物脅迫和非生物脅迫條件下整體呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，暗示它們的功能對(duì)番木瓜生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)至關(guān)重要。CpLYK3 在WMV 病毒侵染和花粉組織中不表達(dá)，表明其不參與WMV 病毒侵染過程和花粉發(fā)育。

為了解析復(fù)制基因之間功能差異，本研究重點(diǎn)關(guān)注鑒定得到的7 對(duì)復(fù)制基因的表達(dá)情況（圖6B）。發(fā)現(xiàn)CpLYK5-like/CpLYK2、CpLYK5-like/CpLYK4-1、CpLYK2/CpLYK5、CpLYK4-1/CpLYK2和CpLysM-RLK3/CpLYK5 五對(duì)復(fù)制基因在不同組織、生物脅迫和非生物脅迫條件下表現(xiàn)出明顯的基因表達(dá)量分化現(xiàn)象。其中約3 百萬年前產(chǎn)生的復(fù)制基因CpLYK5-like、CpLYK5 和CpLYK4-1 之間出現(xiàn)明顯的表達(dá)量分化。CpLYK5 在不同組織、生物脅迫和非生物脅迫條件下顯著高表達(dá)，而其復(fù)制基因CpLYK5-like 和 CpLYK4-1 則表現(xiàn)出低表達(dá)量，暗示復(fù)制基因在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了功能分化現(xiàn)象。

2.7 LysM-RLK 家族的功能結(jié)構(gòu)域和蛋白序列三級(jí)結(jié)構(gòu)解析

根據(jù)表達(dá)分析結(jié)果，推測復(fù)制基因?qū)pLYK5-like/CpLYK5 和CpLYK5-like/CpLYK4-1 之間表達(dá)分化可能引起功能變化。因此對(duì)CpLYK5-like、CpLYK5 和CpLYK4-1 三個(gè)基因的蛋白功能結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)LysM-RLK 基因都含有典型胞外LysM 結(jié)構(gòu)域，CpLYK5-like 和CpLYK5 分別包含1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)胞內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，屬于典型的LysM 型受體激酶，而CpLYK4-1 跨膜結(jié)構(gòu)域缺失（圖7A）。為了解析這3 個(gè)復(fù)制基因之間蛋白空間結(jié)構(gòu)變化，本研究利用人工智能網(wǎng)絡(luò)算法AlphaFold2 進(jìn)行了蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖7B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LysM 結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)均存在-螺旋結(jié)構(gòu)且基因CpLYK5-like 的LysM結(jié)構(gòu)域包含β-折疊，然而它們的蛋白三維空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)表現(xiàn)出明顯差異。結(jié)合其在不同轉(zhuǎn)錄組中的基因表達(dá)分化，本研究認(rèn)為番木瓜復(fù)制基因CpLYK5-like、CpLYK5 和CpLYK4-1 在長期進(jìn)化過程中已經(jīng)表現(xiàn)明顯的基因功能分化。

2.8 番木瓜基因LysM-RLK3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）

為了進(jìn)一步揭示3 個(gè)復(fù)制基因（CpLYK5-like、CpLYK5 和CpLYK4-1）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究對(duì)基于4 個(gè)不同脅迫條件下[炭疽病、番木瓜畸形花葉病毒（PLDMV）、禾生素（CTS）、干旱等]的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建的差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，CpLYK5（Cpa04g020240）位于plum1 共表達(dá)模塊。選取模塊內(nèi)連接度最高的前27 個(gè)基因作為該模塊的核心基因，構(gòu)建了核心共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)?；虮磉_(dá)熱圖（圖8A）表明，這些核心基因在不同脅迫條件下表達(dá)模式出現(xiàn)明顯的表達(dá)差異，尤其是在炭疽病侵染過程中表達(dá)量顯著下調(diào)，而在PLDMV 病毒侵染過程中表達(dá)量明顯上調(diào)，暗示這些核心基因協(xié)同參與不同生物和非生物脅迫響應(yīng)。Cpa01g017940 、Cpa02g003800 和Cpa04g021650 分別為編碼膜結(jié)合蛋白蘇氨酸激酶（CpPHOT2）、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CpSWEET1）、3-酮基-CoA合成酶6（CpKCS6）的基因，其在炭疽病侵染的果實(shí)和干旱脅迫的莖組織中表達(dá)量下調(diào)，而在番木瓜畸形花葉病毒（PLDMV）和禾生素（CTS）處理葉片組織中表達(dá)量上調(diào)。CpLysM-RLK3 是擬南芥AtLYK5 的同源基因，屬于主要的幾丁質(zhì)受體，可與幾丁質(zhì)激發(fā)子受體激酶（AtCERK1）結(jié)合形成幾丁質(zhì)介導(dǎo)的復(fù)合物，誘導(dǎo)植物免疫。在核心共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中（圖8B），CpLysM-RLK3 與膜結(jié)合蛋白蘇氨酸激酶（CpPHOT2）、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CpSWEET1）、3-酮基-CoA 合成酶6（CpKCS6）等核心基因表現(xiàn)出強(qiáng)共表達(dá)關(guān)系，暗示這些核心基因通過相互之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控協(xié)同響應(yīng)植物不同逆境脅迫。CpLYK5-like、CpLYK5 和CpLYK4-1不在同一個(gè)核心共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，為復(fù)制基因之間的功能分化提供新的證據(jù)，其具體功能差異需要后續(xù)進(jìn)行更加深入的研究。

3 討論

LysM 型類受體蛋白激酶基因在植物生長發(fā)育及逆境脅迫中發(fā)揮重要功能，已成為當(dāng)今植物中基因功能研究的熱點(diǎn)之一[36]。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)番木瓜基因組中的LysM-RLK 家族基因進(jìn)行系統(tǒng)鑒定、分類及理化特征評(píng)估。同時(shí)比較基因組學(xué)角度來闡明番木瓜LysM-RLK 家族形成的演化歷史，明確近期的基因復(fù)制對(duì)其家族形成重要貢獻(xiàn)。

本研究鑒定了番木瓜7 個(gè)LysM-RLK 家族基因，LysM-RLK 家族成員數(shù)多于擬南芥（4 個(gè)），小于葡萄（11 個(gè)）。高梅等[36]研究的小立碗蘚（Physcomitrium patens）是早期登陸的植物代表，其LysM-RLK 家族成員數(shù)量多于擬南芥和水稻，推測該家族成員在小立碗蘚中可能存在基因功能的冗余。隨著不斷進(jìn)化發(fā)展，一些高等植物中LysMRLK家族成員數(shù)量得到擴(kuò)展，意味著該家族新功能的引入。

通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，將番木瓜LysM-RLK 基因分為3 個(gè)亞組（LysM-Ⅱ、LysM-Ⅲ和LysM-Ⅳ），它們均與擬南芥和葡萄的部分成員聚為一類，而高等植物中LysM-RLK 家族分為4 個(gè)亞組，推測番木瓜中LysM-RLK 家族成員的功能相對(duì)單一[37]。

順式作用調(diào)控元件作為一個(gè)重要的分子開關(guān)，如王東東等[37]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)LysM-RLK 基因的啟動(dòng)子序列中富含多種激素相關(guān)的作用元件，如水楊酸（salicylic acid， SA）響應(yīng)元件TCA-element（S）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）響應(yīng)元件CGTCA-motif（M）等，但不同基因之間的元件含量和種類均不相同，表明LysM-RLK 家族不同成員能對(duì)不同激素發(fā)生響應(yīng)且響應(yīng)程度不同[38]。本文預(yù)測的番木瓜順式作用調(diào)控元件表明LysM-RLK 參與各種環(huán)境因素（干旱、低溫等）、光響應(yīng)和植物激素[生長素（auxin，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylicacid，SA）、茉莉酸甲酯、赤霉素（gibberellins，GAs）等]，與前人研究一致。

植物脅迫反應(yīng)機(jī)制的一個(gè)潛在創(chuàng)新來源是基因復(fù)制，ZOU 等[38]對(duì)復(fù)制基因參與應(yīng)激調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子順式作用DNA 調(diào)節(jié)元件的分析表明，祖先應(yīng)激反應(yīng)的不對(duì)稱分配可能部分歸因于DNA 調(diào)控元件的差異；失去大部分順式作用元件的重復(fù)基因不參與應(yīng)激反應(yīng)，但可能參與其他反應(yīng)。因此，失去順式作用元件的復(fù)制基因可能形成新功能而保留下來，擬南芥重復(fù)基因之間的順式調(diào)節(jié)元件部分解釋了為什么重復(fù)基因?qū)γ{迫有不同的應(yīng)答反應(yīng)。

左存武等[39]發(fā)現(xiàn)LysM-RLK 在蘋果腐爛病發(fā)生前后，發(fā)生差異表達(dá)的基因較多推測部分蘋果LysM-RLK 基因可能在部分蘋果真菌病害發(fā)生的過程中起重要的感受和調(diào)控，秦春曉[40]研究表明星星草（Borago officinalis）Put LysM 基因可能參與種子萌發(fā)與根的鹽應(yīng)答調(diào)控過程， 表明LysM-RLK 與抗病抗逆相關(guān)，并參與組織發(fā)育。番木瓜基因表達(dá)譜分析表明LysM-RLK 廣泛參與生物脅迫（肯尼亞不知名病毒、PapMV 和PRSV協(xié)同處理、PRSV 和PapMV 協(xié)同處理、PapMV、PLDMV、炭疽?。⒎巧锩{迫（低溫脅迫、乙烯處理、1-甲基環(huán)丙烯、干旱脅迫、凍融處理）和不同組織發(fā)育（胚珠、花粉、雄蕾、葉、根、莖、雌花、雄花和不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)）。

本研究在轉(zhuǎn)錄組水平上挖掘番木瓜抗病和抗逆相關(guān)的LysM-RLK 基因，揭示LysM-RLK 基因參與番木瓜抗病和抗逆反應(yīng)。為番木瓜的遺傳改良和育種提供了必要的LysM-RLK 基因資源。