熒光定量PCR檢測在結(jié)核性胸腔積液中的診斷價值

王子君 ，厲銀平

［1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生培養(yǎng)基地（孝感市中心醫(yī)院），湖北 孝感 432000；2.武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)，湖北 孝感 432000］

結(jié)核病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要傳染病，而結(jié)核性胸腔積液是肺外結(jié)核的一種主要形式，也是引起胸腔積液的常見原因。早期結(jié)核性胸腔積液的診斷主要依靠抗酸染色涂片和培養(yǎng)，其中抗酸染色涂片操作簡單、用時短、陽性率低［1］，而胸水結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)的陽性率低，時間周期長［2-3］，胸膜活檢陽性率高，但價格昂貴且有創(chuàng)［4］。PCR 是一種結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)的診斷技術(shù)，PCR 對結(jié)核分枝桿菌的診斷具有高敏感性和高特異性，同時具有操作簡單、高效等優(yōu)點，本文通過PCR 檢測胸水結(jié)核分支桿菌對結(jié)核性胸腔積液的診斷價值進一步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取孝感市中心醫(yī)院2021 年1 月至2022 年5月收治的98 例胸腔積液患者作為研究對象，以胸腔鏡活檢或臨床診斷為診斷金標(biāo)準(zhǔn)。其中確診為結(jié)核性胸腔積液患者52 例，非結(jié)核性胸腔積液患者46 例，并在治療前收集所有患者的胸水熒光定量PCR、ADA 及外周血T-SPOT 的檢測結(jié)果、實驗室相關(guān)指標(biāo)及臨床資料，對收集結(jié)果及數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)表明有胸腔積液；②患者入院均行熒光定量PCR、胸水ADA、外周血T-SPOT 及一般實驗室檢查；③患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①正在接受抗結(jié)核、抗腫瘤治療患者；②合并肝硬化、腎病綜合征、心力衰竭、自身免疫性疾病、精神疾患等；③病因不明確患者。

1.2 儀器與方法

1.2.1 熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR 儀（SLAN96S 實時熒光定量PCR 儀），結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法），按試劑盒說明書處理胸水標(biāo)本，完善上述過程后讀取結(jié)果。

1.2.2 T-SPOT 檢測 使用ELISPOT 試劑盒（上海復(fù)星公司）進行T-SPOT 分析，根據(jù)試劑盒說明書操作后讀取結(jié)果。

1.2.3 完善ADA 檢測 采用使用北京萬泰德瑞診斷技術(shù)有限公司提供的ADA 試劑，檢測儀器為日立HITACHI7600-110 型全自動生化分析儀，根據(jù)儀器說明書操作，讀取結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位間距）［M（P25,P75）］表示，兩組間數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗進行比較，計數(shù)資料以百分率（%）表示，兩組間數(shù)據(jù)采用χ2檢驗進行比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 胸腔積液標(biāo)本中不同方法的檢測結(jié)果

2.1 患者的一般資料

總共納入98 例患者，結(jié)核組共有52 例，其中男39 人，女13 人，患者的年齡中位數(shù)63.50歲；非結(jié)核組46 例，其中男26 人，女20 人，患者的年齡中位數(shù)69.50 歲。兩組患者的年齡及性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者胸水ADA 檢測結(jié)果

結(jié)核組胸水ADA 中位數(shù)38.10 u/L，非結(jié)核組胸水ADA 中位數(shù)9.9 u/L，結(jié)核組患者胸水ADA高于非結(jié)核組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者胸水ADA 比較 [M(P25,P75),u/L]

2.3 不同方法在兩組患者陽性率比較

胸水ADA 根據(jù)受試者操作特征（ROC）曲線最大約登指數(shù)計算最佳臨界值20.05 u/L。結(jié)核組患者胸水PCR、ADA、外周血T-SPOT 陽性率分別為53.8%、86.5%、75.0%；非結(jié)核組患者陽性率分別為0%、23.9%、32.6%。三種方法檢測結(jié)核性胸腔積液組中的陽性率高于非結(jié)核性胸腔積液組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 三種方法在兩組患者陽性率比較 ［n(%)］

2.4 三種方法在兩組患者胸腔積液中的診斷價值

在胸腔積液中，如表4 所示，胸水PCR 敏感度最低，與胸水ADA、外周血T-SPOT 敏感度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.281,P＜0.001；χ2=5.076,P=0.024）；胸水PCR 特異性最高，與胸水ADA、外周血T-SPOT 特異度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.494,P＜0.001；χ2=17.922,P＜0.001）。

表4 三種方法在結(jié)核性胸腔積液的診斷價值 (%)

2.5 三種方法串聯(lián)、并聯(lián)在兩組患者的診斷價值

在串聯(lián)聯(lián)合診斷中，如表5 所示，三種串聯(lián)組合特異度、陽性預(yù)測值均為100%，其中胸水PCR+胸水ADA+外周血T-SPOT 特異度為100%，與胸水ADA、外周血T-SPOT 特異度相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.494,P＜0.001；χ2=17.922,P＜0.001）。在并聯(lián)聯(lián)合診斷中，如表6 所示，胸水PCR+胸水ADA+外周血T-SPOT 聯(lián)合診斷敏感度最高為96.2%，與胸水PCR 敏感度相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.821,P＜0.001）。

表5 三種方法串聯(lián)比較 (%)

表6 三種方法并聯(lián)比較 (%)

3 結(jié)論

PCR 作為分子生物學(xué)的診斷技術(shù)，具有特異、靈敏、快速的特點，本研究通過采用PCR 擴增與熒光探針相結(jié)合，針對結(jié)核分枝桿菌IS6110 和38KD 序列進行檢測，避免常規(guī)PCR 僅以IS6110作為靶標(biāo)帶來的漏檢。在呂純芳等［5］研究中發(fā)現(xiàn)，以痰為標(biāo)本檢測結(jié)核分枝桿菌，其中PCR 與Xpert 兩者檢測結(jié)核分支桿菌敏感性相當(dāng)，均為83.7%，且PCR 較Xpert 便宜，在臨床應(yīng)用中更易推廣。在PCR 以胸水為標(biāo)本檢測結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，PCR 在診斷結(jié)核性胸腔積液中的敏感性各有不同，在 MOLAUDZ 等［6］、KALANTRI 等［7］研究中PCR 敏感性均較高，分別為67%、80%。而在ROSSO 等［8］研究中發(fā)現(xiàn)PCR的敏感性偏低，為42.8%。本文PCR 檢測胸水結(jié)核分枝桿菌敏感性為53.8%，較KALANTRI 等研究敏感性低，其中24 例PCR 為假陰性，原因可能為：①胸腔積液中沒有結(jié)核分枝桿菌，因為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、細胞因子產(chǎn)生的免疫反應(yīng)也會導(dǎo)致胸水的產(chǎn)生；②胸水里結(jié)核分枝桿菌菌量低；③胸水中存在血液或膿液會干擾細胞裂解和引起DNA 聚合酶失活［9］；④操作污染。由于PCR 的敏感度相對較低，如果需要診斷結(jié)核性胸腔積液，最好與其他敏感性高的檢測方法結(jié)合使用。其中腺苷脫氨酶（ADA）是在大多數(shù)細胞中發(fā)現(xiàn)的參與嘌呤分解代謝的酶，特別是在淋巴細胞中，其濃度與分化程度成正比，已被證實是一種有價值的生化指 標(biāo)［10］，AGGARWAL 等［11］meta 分析表示胸水ADA 診斷結(jié)核性胸腔積液的敏感性為92%。一般來說，ADA 水平高于70 IU/L 高度提示TPE，而低于40 IU/L 的水平更有助于排除疾?。?2］，但診斷TPE 的最佳胸水ADA 截止值仍不清楚。本研究中胸水ADA 最佳臨界值20.05 u/L，且結(jié)核組胸水ADA 中位數(shù)38.10 u/L 顯著高于非結(jié)核組胸水ADA中位數(shù)9.9 u/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本研究中胸水ADA 對結(jié)核性胸腔積液敏感性86.5%，與CHEN 等［13］研究中胸水ADA 敏感性87.3% 相當(dāng)。其中胸水PCR 與ADA 并聯(lián)聯(lián)合診斷，其敏感性90.4%，能較好地降低漏診率。T-SPOT 是γ 干擾素釋放試驗（IGRA）的一種，有研究［14］表明胸水T-SPOT 比外周血T-SPOT 對結(jié)核性胸腔積液的診斷價值更高，但GUPTA D 等［15］做了一項Meta分析，在診斷結(jié)核性胸腔積液試驗中，外周血T-SPOT 陽性結(jié)果835 例，胸水T-SPOT 陽性結(jié)果523 例，由此得出外周血T-SPOT 敏感度高于胸水敏感度。本研究選用外周血T-SPOT 診斷結(jié)核性胸腔積液，其敏感性75.0%，特異性67.4%。胸水PCR、胸水ADA 及外周血T-SPOT 三者并聯(lián)聯(lián)合診斷敏感性為96.2%，三者并聯(lián)陰性預(yù)測值為91.7%，三者并聯(lián)診斷結(jié)核性胸腔積液效果最佳。同時PCR 有較高的特異度，單獨診斷結(jié)核性胸腔積液可顯著避免可能的誤診，在區(qū)分結(jié)核病和非結(jié)核病具有較大的潛力。PCR 在臨床應(yīng)用及普及方面存在一定局限性，無法對死菌與活菌有效區(qū)分，同時在檢測中可對異煙肼、利福平兩種藥物的耐藥基因進行檢測，而在檢測時部分特殊的異煙肼、利福平耐藥相關(guān)基因突變會對檢測結(jié)果造成影響。本實驗存在一定的局限性，病例數(shù)較少，同時未對非結(jié)核組進行具體亞組分組來進一步論證本研究結(jié)果，樣本選擇存在一定的偏倚，后期可擴大樣本量進一步研究。