長枝木霉菌非核糖體肽合成酶基因啟動子NP249的克隆及功能驗證

官萌嬌,孫旭杰,夏卓林,任愛芝,趙培寶

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,山東 聊城 252000)

木霉菌(Trichodermaspp.)屬半知菌亞門,多數(shù)菌株進行無性繁殖,有性階段為肉座菌,是重要的生防真菌。對環(huán)境適應(yīng)性強,生防機制多樣,已被廣泛應(yīng)用于防治由真菌、細(xì)菌和線蟲引起的植物病害[1-2]。木霉菌對植物也有一定的促生作用,能夠提高植物對逆境的適應(yīng)能力,最終促進植物的生長。木霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物及抗生素在生防過程中起著重要的作用。

木霉菌次生代謝產(chǎn)物多樣,Peptaibols是真菌的次生代謝產(chǎn)物之一,是由非核糖體多肽合成酶(Nonribosomal peptide synthetase,NRPS)合成的多肽類抗菌物質(zhì),具有抗病毒、抗真菌和抗癌等多種生物學(xué)活性[3-6]。長枝木霉SMF2(TrichodermaLongibrachiatumSMF2)為一株高產(chǎn)Peptaibols的菌株,該菌株能夠產(chǎn)生Peptaibols類抗菌素康寧霉素(Trichokonins,TKs),其中Trichokonin VI含量最高[7]。Trichokonin VI能夠抑制革蘭氏陽性細(xì)菌枯草芽孢桿菌的生長[8],對臭椿苗期病害以及灰葡萄孢菌引起的蝴蝶蘭灰霉病也有一定的防治效果[9-10];激活水楊酸信號途徑,增加大白菜對軟腐病的抗性[11];通過激活多條防御信號通路增加煙草對煙草花葉病毒侵染的防御反應(yīng)和系統(tǒng)抗性,誘導(dǎo)煙草體內(nèi)ROS的產(chǎn)生、施藥部位酚類化合物的積累和對病毒的抗性[12]。由此可見,Trichokonin VI在生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景,但其合成機制尚不清楚,因此,研究其合成機制,提高Trichokonin VI產(chǎn)量使其在生物防治中發(fā)揮作用是至關(guān)重要的。隨著長枝木霉SMF2基因組序列的公布,長枝木霉SMF2合成Peptaibols機制的研究揭開了新篇章,除了添加特定氨基酸和調(diào)控培養(yǎng)基的碳氮源配比等條件來調(diào)控Peptaibols的產(chǎn)生,Peptaibols的生物合成還受到多種基因的調(diào)控。Peptaibols是一類由非核糖體合成酶系統(tǒng)合成的多肽,其氨基酸序列分別與NRPS上的各個組件相對應(yīng),這就為Peptaibols的分子改造提供了可能[13]。通過對長枝木霉菌 SMF2 菌株產(chǎn)生的抗菌素進行深入研究,明確了該菌株產(chǎn)生的Peptaibols短肽TrichokoninVI,由 NRPS 基因簇TPX1合成[14]。

為進一步探究非核糖體肽類抗菌素的合成機制,本研究以長枝木霉SMF2菌株為材料,克隆了NRPS的啟動區(qū)域,構(gòu)建綠色熒光表達載體,采用REMI介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,將重組的攜帶GFP基因的質(zhì)粒pCX-62-GFP-249轉(zhuǎn)入長枝木霉SMF2野生型菌株中,驗證啟動子功能。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與引物 長枝木霉SMF2由聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院趙培寶實驗室保存;綠色熒光蛋白GFP基因來自pCX-62-GFP由本實驗室前期構(gòu)建;引物249-1:5′-ATGTGGGAAATAGCGAGAT-3′(60);249-4:5′-GGGCTGCCAGGTCTTTT-3′(NRPS22);249-1B:5′-CGGGATCCATGTGGGAAATAGCGAGTA-3′;249-4X:5′-TCCCCCCGGGCTTGGCGGGTTGGGCG-3′,由上海生工合成。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、真菌基因組DNA提取試劑盒百泰克(BioTeke)公司;T4DNA連接酶、XmaⅠ、BamH Ⅰ、pMD-18T載體等購自寶生物(TaKaRa)公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 將長枝木霉轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d,刮取菌絲烘干。烘干后加入液氮研磨,使用真菌基因組DNA試劑盒提取DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 啟動子預(yù)測 采用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)、TFSEARCH(http://www.Gene-regulation.com)等在線軟件,參考EPD(Eukaryotic promoter database,http://www.epd.Isb-sib.ch/)、TRANSFAC(http://www.Gene-regulation.com)等啟動子數(shù)據(jù)庫,并結(jié)合真菌啟動子的結(jié)構(gòu)特征,對NRPS基因TPX1上游DNA序列進行分析,尋找其順式元件,例如TATA盒、CAAT盒、GC盒及其他可能的調(diào)控元件,并結(jié)合熒光蛋白GFP等報告基因的融合與表達分析來確定啟動子。

1.2.3 啟動區(qū)擴增 以長枝木霉SMF2的DNA為模板,249-1和249-4為引物進行PCR擴增,95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃最終延伸10 min。得到1 204 bp的目的基因249的片段,送去測序。

測序后的片段與pCX-62所含的酶切位點相比較分析,在249-1和249-4的5′端添加酶切位點和保護堿基設(shè)計帶有酶切位點的引物249-1B和249-4X。PCR擴增以擴增出的片段為模板,249-1B和249-4X為引物進行PCR擴增,95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,68 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃最終延伸10 min。

膠回收純化后得到NP249基因啟動子片段,將目的片段DNA連接到pMD-18T載體上,在PCR儀內(nèi)過夜連接得到重組載體NP249-pMD-18T,通過大腸桿菌熱激法轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒249-pMD-18T轉(zhuǎn)化至DH5α菌體內(nèi)實現(xiàn)重組質(zhì)粒的擴增。

1.2.4 GFP融合載體構(gòu)建 用XmaⅠ、BamH Ⅰ對pCX-62-GFP和249-pMD-18T進行酶切,T4DNA連接酶16 ℃過夜連接,將連接后的質(zhì)粒通過大腸桿菌熱激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。以菌液為模板,249-1B和249-4X為引物,進行PCR擴增驗證菌液是否為陽性,菌液PCR結(jié)果為陽性后提取重組質(zhì)粒249-pCX-62-GFP雙酶切鑒定。

1.2.5 遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選 制備長枝木霉SMF2原生質(zhì)體,保存的長枝木霉菌SMF2轉(zhuǎn)接于PDA上,28 ℃培養(yǎng)3～5 d后刮取孢子,置于50 mL PDB培養(yǎng)基中,28 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。等量分裝于25 mL離心管中,放入高速冷凍離心機中,4 000 r/min,4 ℃離心10 min,收集菌絲。加入10 mL 0.7 mol/L NaCl溶液沖洗菌絲,4 000 r/min,4 ℃離心10 min,棄上清液,后重復(fù)此步驟1次。稱取0.1 g溶壁酶與4 mL 0.7 mol/L NaCl溶液混合,混勻后用0.22 μm水相針式濾器過濾,過濾后的溶液加入收集菌絲的離心管內(nèi),混合均勻,置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃,150 r/min培養(yǎng)3.5 h得到原生質(zhì)體。制備好的原生質(zhì)體中加入28 mL 0.7 mol/L的NaCl溶液,用3層擦鏡紙過濾至新的離心管中,4 000 r/min,4 ℃離心7 min,收集原生質(zhì)體。

使用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(REMI)技術(shù)對長枝木霉SMF2原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化,在含原生質(zhì)體的離心管內(nèi)加入10 mL STC溶液沖洗離心棄掉上清液,加入150 μL STC備用。將50 μL STC溶液、50 μL線性化質(zhì)粒、2 μL限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ加入1.5 mL離心管中,混合均勻后加入上述含150 μL STC的原生質(zhì)體中,冰浴20 min。加入2 mL預(yù)冷的PTC,冰浴20 min,室溫20 min。加入20 mL STC,4 000 r/min,4 ℃離心7 min,棄掉上清液,加入2 mL再生PDB置于28 ℃過夜培養(yǎng),將過夜培養(yǎng)的長枝木霉原生質(zhì)體與再生PDA混合均勻倒平板,待長出微菌落后覆上10 mL含100 μg/mL潮霉素的0.7%水瓊脂,28 ℃培養(yǎng)。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子篩選 待長出轉(zhuǎn)化子后將長出的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含潮霉素抗性的培養(yǎng)基上,連續(xù)轉(zhuǎn)接3代篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子,提取轉(zhuǎn)化子DNA,以Hph1和Hph2為引物進行PCR驗證。挑取轉(zhuǎn)化子的菌絲置于熒光顯微鏡下檢測熒光表達狀態(tài),驗證啟動子功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子預(yù)測

通過網(wǎng)站獲取TPX1基因轉(zhuǎn)錄起始點上游1 204 bp作為啟動子序列,根據(jù)啟動子預(yù)測結(jié)果(圖1),可見大號的A是酶轉(zhuǎn)錄起始堿基,上游30 bp處有一個TATA box。

圖1 啟動子預(yù)測Fig.1 Promoter predictions

2.2 啟動區(qū)的擴增

以長枝木霉SMF2基因組DNA為模板進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物回收測序結(jié)果顯示成功克隆NP249啟動子序列(圖2)。將測序正確的片段連接到pMD-18T載體上,提取質(zhì)粒,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析可見目的基因條帶,大小與預(yù)期一致(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker;1,2.NP249基因片段。M.DL2000 DNA Marker;1,2.NP249 gene fragment.

M.DL5000 DNA Marker;1.pMD-18T重組質(zhì)粒。M.DL5000 DNA Marker;1.pMD-18T recombinant plasmid.

2.3 融合載體的構(gòu)建

連接過夜的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),菌液PCR驗證為陽性(圖4)。249-pCX-62-GFP的雙酶切(XmaⅠ、BamH Ⅰ)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見2條條帶,載體條帶和目的基因條帶,大小與預(yù)期一致,表明獲得了249啟動子的GFP融合載體(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker;1.目的片段;2.GFP融合載體菌液PCR。M.DL2000 DNA Marker;1.Target fragment;2.GFP fusion vector bacterial solution PCR.

M.DL5000 DNA Marker;1.GFP融合載體雙酶切。M.DL5000 DNA Marker;1.Double enzyme digestion of GFP fusion vector.

2.4 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測

提取轉(zhuǎn)化子DNA,進行PCR擴增,擴增得到潮霉素抗性條帶(圖6),表明載體已整合到基因組中。使用熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)化子菌絲進行熒光檢測,檢測到GFP熒光信號(圖7),表明克隆到的基因啟動子能夠啟動GFP的表達,具有啟動子功能。

M.DL2000 DNA Marker;1.野生型長枝木霉SMF2 DNA;2,3.轉(zhuǎn)化子DNA。M.DL2000 DNA Marker;1.DNA of Trichoderma longibrachiatum SMF2;2,3.DNA of transformants.

圖7 轉(zhuǎn)化子菌絲熒光檢測Fig.7 Fluorescent detection of transformant hypha

3 結(jié)論與討論

綜上所述,本試驗擴增到的1 204 bp大小的NRPS啟動子序列能夠啟動GFP的表達,具有啟動子的功能。該啟動子的克隆為進一步研究NRPS合成Peptaibols的機制奠定了基礎(chǔ)。

Peptaibols是木霉最主要的次級代謝產(chǎn)物之一,是由NRPS催化單個氨基酸殘基添加至肽鏈合成的非核糖體肽類。非核糖體合成酶合成多肽過程遵循共線性裝配規(guī)則,非核糖體合成酶途徑通過利用除20種氨基酸外的稀有氨基酸或脂肪酸為原料,在多酶或多結(jié)構(gòu)域合成系統(tǒng)的參與下合成非核糖體肽(Nonribosomal Peptides,NRPs),合成機理為多載體巰基化模板[15]。

NRPSs是一種分子量巨大的多功能酶系,是合成NRPs的關(guān)鍵。它由一系列模塊按順序排列作為多肽合成的模板,因而模塊的種類、數(shù)量和空間排列順序決定了多肽的特異性,且模塊在基因組上成簇排列。每一個模塊由負(fù)責(zé)識別并活化特定底物為相應(yīng)的腺苷酸化合物的腺苷酸化結(jié)構(gòu)域(Adenylation,A)、起反應(yīng)中間物硫脂固定作用的巰基化結(jié)構(gòu)域(Thiolation,T)和負(fù)責(zé)肽鍵形成的縮合結(jié)構(gòu)域(Condensation,C)共同組成,從而實現(xiàn)將一種氨基酸整合至產(chǎn)物骨架中[16-20]。鞏志廷[21]發(fā)現(xiàn),在長枝木霉SMF2中,TPX1和TPX2基因分別控制含有20個氨基酸殘基和12 個氨基酸殘基的Peptaibols的生物合成;Zhou等[22]通過敲除TISTP1基因使Trichokonin A的產(chǎn)量增加了5倍,Trichokonin B的產(chǎn)量增加了2.6倍;Shi等[23]發(fā)現(xiàn)敲除偏甲基轉(zhuǎn)移酶基因TLIae1下調(diào)了Tlx1和Tlx2的表達,抑制了Trichokonin A和Trichokonin B的產(chǎn)生。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在長枝木霉SMF2中有NRPSs的同源基因,該基因可能與NRPSs合成Peptaibols相關(guān),但對其如何發(fā)揮作用還不清楚。

通過對啟動子進行克隆明確該基因具有啟動子功能,繼而尋找反式作用因子,來研究NRPS基因表達調(diào)控方式,為NRPS轉(zhuǎn)錄調(diào)控,高水平合成非核糖體抗菌肽提供幫助。