結(jié)球甘藍遺傳圖譜的構(gòu)建及抗黑腐病QTL定位

樂祥慶,鐘雄輝,崔 建,韓 睿,宋旭朦,頡建明,康俊根

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,北京 100097)

結(jié)球甘藍(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.,2n=18)是2年生草本植物,為十字花科蕓薹屬[1],在我國種植廣泛[2],年種植面積高達90萬hm2[3],在蔬菜供應(yīng)和出口中發(fā)揮重要作用。目前,在世界范圍內(nèi)黑腐病、枯萎病和根腫病是危害甘藍產(chǎn)量和品質(zhì)的三大主要病害,其中,黑腐病的危害最為嚴重。甘藍黑腐病是一種細菌性病害,由野油菜黃單胞桿菌(Xanthomonascampestrispv.campestris)侵染所造成,發(fā)病后葉片出現(xiàn)“V”字型病斑[4],結(jié)球松散,葉球腐爛。由于黑腐病主要發(fā)生在葉片上,它對以葉片為主要產(chǎn)品和食用器官的作物影響都較大[5]。黑腐病是植物學(xué)家和昆蟲學(xué)家哈里森于1898年在美國首次發(fā)現(xiàn)[6],隨后在世界多個種植甘藍的國家和地區(qū)陸續(xù)有發(fā)現(xiàn)。20世紀中后期,在我國的北京、天津、山西、內(nèi)蒙古等地區(qū)有少面積的甘藍黑腐病病害發(fā)生,但是隨著甘藍種植面積的增加,黑腐病對甘藍品質(zhì)和產(chǎn)量的威脅越來越大。

結(jié)球甘藍的大多數(shù)農(nóng)藝性狀都屬于數(shù)量性狀,定位困難,研究效率低,其中最主要的因素是缺少適合數(shù)量性狀研究的群體[7]。數(shù)量性狀位點(Quantitative trait locus,QTL)指的是影響植物基因組上所有數(shù)量性狀特征的基因的相對位置。許多重要的性狀都是以數(shù)量遺傳和持續(xù)變異為特點的多個基因所決定的。通過利用分子標記構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜對相關(guān)性狀進行QTL定位,可以在連鎖群中鑒定控制數(shù)量性狀的多個基因座及基因座間的相互作用關(guān)系。因此,分子標記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建在遺傳育種學(xué)理論和功能基因克隆中具有重要的地位。遺傳圖譜廣泛地應(yīng)用于基因定位中,同時也為分子標記輔助選擇和圖位克隆提供了一個基礎(chǔ)平臺[8]。目前,國內(nèi)外對甘藍黑腐病QTL定位研究的報道比較少。Camargo[9]通過對甘藍苗期及成株期的黑腐病抗性鑒定得到4個抗病QTL位點,分布在1,2,9號連鎖群上,其中在2號連鎖群有2個位點只與苗期的抗病性有關(guān),其余2個位點與苗期及成株期的抗病性都相關(guān)。Tonu等[10]利用黑腐病感病材料GCP09和抗病材料Reiho P01構(gòu)建的F2群體鑒定得到3個分別位于5,8,9號連鎖群上的QTL位點,在8號連鎖群上定位到1個主效位點,LOD值為7.7,最高可解釋34%的貢獻率。孔樅樅[11]利用抗病和感病材料構(gòu)建F2群體,使用黑腐病1號生理小種并結(jié)合QTL-seq技術(shù)在3號連鎖群上定位到抗病位點。

目前,國際上對甘藍黑腐病菌致病力劃分標準比較常用的是Vicente等[12]的劃分標準。國內(nèi)關(guān)于甘藍黑腐病菌致病力劃分標準的研究較少,有一些黑腐病致病力分化的研究。例如,翟文慧等[13]從11個地區(qū)采集黑腐病病樣并進行分離鑒定,結(jié)果表明61株菌株均為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種,其中1號生理小種占主導(dǎo)地位,為54.1%,4號生理小種占其次為36.1%,3號生理小種占比最少,沒有發(fā)現(xiàn)2,5,6號生理小種。據(jù)統(tǒng)計表明,華北、東北等北方地區(qū)1,4號生理小種比例相當,1號生理小種主要在南方、西南、沿海地區(qū)[14]。本研究以結(jié)球甘藍高抗黑腐病1號生理小種的自交系4674與高感黑腐病的自交系4673為親本,構(gòu)建F2分離群體為作圖群體。通過苗期接種1號黑腐病生理小種對結(jié)球甘藍進行抗病性鑒定,篩選多態(tài)性好的SSR和InDel標記,構(gòu)建結(jié)球甘藍遺傳圖譜,并在此基礎(chǔ)上進行甘藍抗黑腐病QTL定位。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以結(jié)球甘藍4674為父本,4673為母本雜交獲得F1,F1自交得到F2,構(gòu)建了包含152個單株的F2群體。2021年9月中旬將該群體種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心農(nóng)場。4674是黑腐病抗性較好的自交系,4673是農(nóng)藝和品質(zhì)性狀優(yōu)良但對黑腐病是高度感病的材料。本試驗利用結(jié)球甘藍4673和4674雜交獲得F2群體進行遺傳圖譜構(gòu)建和黑腐病抗性QTL定位。本研究所用病原菌為野油菜黃單胞桿菌(Xanthomonascampestrispv.campestris)1號生理小種。以上材料均來自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所甘藍課題組。

1.2 病原菌培養(yǎng)

本試驗所用黑腐病原菌為課題組在北京通州、海淀區(qū)四季青農(nóng)場與中心基地采集的春季自然生長狀態(tài)下甘藍不同品種黑腐病感病葉片,隨后對病原菌進行分離、純化和鑒定。

用滅菌蒸餾水將黑腐病感病葉片清理干凈,隨后用75%酒精將葉片沖洗2遍,置于超凈工作臺中并用滅菌水將病葉再次清洗3～5次,將葉片表面水分吹干,用手術(shù)刀切割發(fā)病部位與正常組織間的部分,并將其切成小塊。之后將切碎葉片轉(zhuǎn)移到裝有1.5 mL、pH=7.4的磷酸緩沖鹽溶液的離心管中,置于28 ℃、150 r/min的搖床上進行黑腐病菌分離,分離時間為1 h。

菌種活化:振蕩分離1 h后,取出離心管并將其置于超凈工作臺上,利用滅菌后的接菌環(huán)分別蘸取黑腐病菌的PBS緩沖液,在沒有添加任何抗生素的LB固體培養(yǎng)基上進行劃線。隨后將其密封并置于28 ℃培養(yǎng)箱中,待培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃色圓形黑腐病菌斑后,置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 人工接種 根據(jù)張鑫鑫等[15]研究報道,三葉一心期為甘藍接病最佳時期,接種前需要根據(jù)單株數(shù)量確定病原菌的用量。利用分光光度計將菌液濃度稀釋到1×108cfu/mL(OD600=0.2),供接種使用。為了增加菌液附著性,使菌液更有效地吸附到葉片上,每升菌液中加入2 mL吐溫20,最后利用噴霧器均勻噴灑在F2群體的每個單株上。

1.3.2 病害鑒定 研究表明[15],甘藍苗期和成株期抗病性基本相同,但苗期鑒定獲得結(jié)果快,而且苗期鑒定可以在室內(nèi)進行,以便更有效地控制生長所需條件。在苗期接種12～14 d后,按照甘藍苗期鑒定方法及劃分標準進行調(diào)查[16],逐一對每個單株的發(fā)病情況進行統(tǒng)計,并參照陳果等[17]的分級標準對F2群體進行病情分級和抗病性歸類。發(fā)病指數(shù)(DI)=∑(病級葉數(shù)×該病級值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級值)×100。按各株系發(fā)病指數(shù)確定其抗病類型,依據(jù)發(fā)病指數(shù)大小將各株系共分為以下5種類型:高抗:發(fā)病指數(shù)=0;抗病:0<發(fā)病指數(shù)≤10;中抗:10<發(fā)病指數(shù)≤30;感病:30<發(fā)病指數(shù)≤50;高感:50<發(fā)病指數(shù)。

1.3.3 DNA提取 取父本4674、母本4673及F2群體各單株大小約1 cm2的葉片放入2 mL離心管中,低溫干燥器凍干后,采用改良后的CTAB法[18]提取各單株DNA,DNA濃度及質(zhì)量通過Nanodrop 2000儀器檢測,-20 ℃保存。

1.3.4 PCR鏈式反應(yīng)體系與反應(yīng)程序 PCR反應(yīng)總體系為10 μL:DNA模板5 μL(30～50 ng/μL)、左右引物各0.5 μL、PCR mix 4 μL(包括TaqDNA聚合酶,dNTP,染料及PCR反應(yīng)所需的緩沖液,由北京博邁德基因技術(shù)有限公司購入)。PCR反應(yīng)程序步驟和參數(shù)設(shè)置參照朱洪運[19]的方法,反應(yīng)產(chǎn)物利用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

以父母本作對照,統(tǒng)計F2群體基因型數(shù)據(jù),與甘藍4673帶型一致的記作a;與甘藍4674帶型一致的記作b;雜合記作h;無帶或帶型不清晰的記作—,將數(shù)據(jù)統(tǒng)計到Excel 2016表中。

1.5 甘藍遺傳圖譜的構(gòu)建

利用Joinmap 4.0構(gòu)建遺傳連鎖圖譜,遺傳距離計算采用Kosambi函數(shù)進行并用厘摩(cM)表示,LOD大于5.0,其他為默認參數(shù)。使用Joinmap 4.0構(gòu)建遺傳圖譜,具體操作步驟參照朱洪運等[20]的方法。連鎖群的命名方法參照已公布的甘藍遺傳連鎖圖C1～C9依次進行命名。利用本課題組基于全基因組測序[21]自主開發(fā)的CA-CK系列的InDel標記,并結(jié)合本實驗室已報道定位于染色體上的已知其他類型標記系列位置[22],將至少有3個自主開發(fā)或已知標記位于同一條連鎖群上作為確定這一連鎖群對應(yīng)染色體的認定標準。

1.6 QTL定位及分析

利用定位軟件MapQTL 6.0,結(jié)合各株系表型和遺傳圖譜對黑腐病群體進行定位,參照劉澤慈[23]將LOD值≥1.5作為QTL入選的標準,LOD值≥3.0則認為此處存在1個主效QTL,并依次在各染色體檢測QTL的分布情況,并根據(jù)區(qū)間作圖法對性狀和基因型進行分析計算,估算出基因位點性狀表型LOD值及加性效應(yīng)等參數(shù)。與單標記作圖法相比,其具有所需群體較小、能估計出QTL的位置與定位誤差小等特點。參照朱洪運等[24]的命名方法進行命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

選取本實驗室基于全基因組測序自主開發(fā)的CA-CK系列的InDel標記及參考Wang等[25]、陳琛等[26]、Lü等[27]的文獻設(shè)計的8C、M、BOSF、BOE等系列的InDel標記及本實驗室前期設(shè)計的SSR標記,共404對分子標記。利用雙親4673和4674對404對分子標記進行PCR擴增與多態(tài)性篩選,對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測,并進行2次重復(fù)對照,最終得到175對條帶清晰,差異明顯且重復(fù)性好的標記,標記多態(tài)性占比為43.3%。

2.2 高密度遺傳圖譜

利用篩選得到的175對差異顯著的SSR和InDel標記和包含152個單株的F2群體構(gòu)建遺傳連鎖圖(圖1)。有154對標記(Indel標記110對,SSR標記44對)分布到9條連鎖群中,平均每條染色體上有17個標記。劃分的連鎖群數(shù)量與甘藍基因組中9條染色體的數(shù)量一致。該圖譜全長為714.29 cM(表1),9條連鎖群長度為61.24～129.47 cM,分子標記數(shù)量為10～33個,遺傳圖譜的標記間平均圖距為4.64 cM,其中參考Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫得知甘藍基因組大小為630 Mb,因此,構(gòu)建的圖譜上對應(yīng)的平均圖距與物理距離分別是4.64 cM,4.09 Mb。在這9條連鎖群中,5號染色體最長,為129.47 cM,標記間平均圖距為8.09 cM,標記間最大空隙為19.3 cM。8號染色體最短,為61.24 cM,標記間平均圖距為3.60 cM。

表1 SSR標記在遺傳圖譜上的分布Tab.1 Distribution of SSR markers on genetic map

圖1 結(jié)球甘藍遺傳連鎖圖及黑腐病抗性定位區(qū)間Fig.1 Genetic linkage map and QTLs for resistance to black rot in cabbage

此外,在同一條染色體中也存在著標記分布不均勻現(xiàn)象,例如在分子標記分布最密集的C7染色體,相鄰標記最小空隙為0.1 cM,最大空隙為12.5 cM,二者相差懸殊。其余幾條染色體也同樣存在標記分布不均勻特征。除了C8、C9連鎖群外,其他連鎖群均出現(xiàn)了大于10 cM最大相鄰標記間隙。同時與許多其他作物一樣,構(gòu)建得到的圖譜在連鎖群上也出現(xiàn)了DNA分子標記聚集現(xiàn)象,由于開發(fā)標記時,在7號染色體上開發(fā)的標記多,所以在C7連鎖群上可明顯發(fā)現(xiàn)標記成簇狀分布。

2.3 表型變異及遺傳分析

利用Excel 2016對父母本及F2群體各單株病情進行分級統(tǒng)計分析,獲得黑腐病親本及F2群體抗性鑒定病情分級統(tǒng)計表(表2)及病情指數(shù)抗性分級柱狀圖(圖2),從中可以看出兩親本中親值為3.5,F2群體中病級平均值為3.23,介于兩親本之間,表現(xiàn)為中抗。F2群體病情等級為0～7級,其中抗黑腐病的病級多為1級,感黑腐病的病級多為5級,并且偏度為0.28,峰度為-0.98,這說明F2單株病級呈正態(tài)分布,符合QTL定位基本要求。由圖3分析發(fā)現(xiàn),F2群體的152個單株中黑腐病抗性為中抗的有51株,占比34%,因此,推測在抗病親本4674中存在抗病的主效QTL。

表2 親本及F2群體的黑腐病抗性鑒定病情分級Tab.2 Disease classification for identification of resistance to black rot of parents and F2 population

圖2 F2群體苗期接種對黑腐病的抗性鑒定Fig.2 Identification of resistance of black rot in F2 individual young plants

圖3 F2群體黑腐病抗病QTL結(jié)果Fig.3 Results of QTL for resistance to black rot in F2 population

2.4 QTL定位分析

利用MapQTL 6.0軟件進行黑腐病抗性QTL定位(圖3),以LOD值≥1.5為QTL入選標準,LOD值≥3.0則認為此處存在1個主效QTL位點。共檢測到7個抗黑腐病QTL位點(表3),分別位于4,6,7號連鎖群上,LOD值為1.63～5.75,加性效應(yīng)值為-0.54～0.92,可解釋的表型貢獻率為4.8%～16.0%。其中,在6號連鎖群有1個QTL位點,遺傳效應(yīng)為負向;4號和7號連鎖群各有3個QTL位點,遺傳效應(yīng)均為正向;LOD值大于3.0的QTL位點有3個,在4號連鎖群的CD838151～BOE417區(qū)間內(nèi)有1個位點,LOD值為3.47,可解釋的表型貢獻率為10.0%,7號連鎖群上有2個位點,分別位于CG842110～CG842482和M29～M39,LOD值分別為5.75和3.20,可解釋的表型貢獻率為16.0%和9.2%。在檢測到7個抗黑腐病位點中CG842110～CG842482區(qū)域內(nèi)的LOD峰值最高,可解釋的表型變異貢獻率也最大。

表3 甘藍抗黑腐病性狀QTL定位Tab.3 QTL mapping of resistance to black rot in cabbage

3 結(jié)論與討論

3.1 分子標記遺傳圖譜的構(gòu)建

QTL定位所用的群體一般有單雙倍體(DH)、重組自交系(RIL)等永久性群體和F2、回交(BC)等暫時性群體。本試驗所使用的為F2群體,雖然其具有可重復(fù)性較低,不易保存等缺點[28],但其優(yōu)點是形成時間短,并且可以獲得豐富的遺傳信息;另外,F2群體內(nèi)既存在純合又有雜合基因型,所以F2群體既可以估算加性效應(yīng),又可以估算顯性效應(yīng)。永久性群體雖然具有穩(wěn)定的遺傳組成,可以重復(fù)試驗,但是不能估算顯性效應(yīng),而且構(gòu)建費時費力,所以在圖譜構(gòu)建中大多采用F2群體。F2群體的大小對圖譜的分辨率和準確性都有一定的影響,并且隨著群體中個體數(shù)量的增加,其結(jié)果的可靠性也能得到一定的提高。F2群體在檢測與重要性狀緊密相連的基因位點時可以通過擴大群體降低誤差來提高定位精度[29]。然而,如果數(shù)量太大,工作量和試驗成本將大大增加。所以,在構(gòu)建圖譜過程中群體數(shù)量大小是至關(guān)重要的[30]。Li等[31]認為,對于100～200個單株定位群體,每個標記的間隔約為10 cM,就足以進行QTL初定位。本研究所用的F2群體包含152個單株,標記間平均密度為4.64 cM,表明該群體適合做定位。

分子標記遺傳圖譜的構(gòu)建一般要求標記分布均勻且連鎖群與染色體數(shù)量一致[32]。屠德鵬[33]認為,遺傳圖譜中分子標記的距離在10～20 cM為最佳,如果要用于數(shù)量性狀基因定位,平均圖距應(yīng)小于10 cM。本試驗是以構(gòu)建甘藍遺傳連鎖圖為基礎(chǔ),目的是為了進行結(jié)球甘藍抗黑腐病QTL定位。本研究構(gòu)建的圖譜平均圖距為4.64 cM,其小于QTL定位所要求的平均圖距10 cM,這表明該圖譜可以用于甘藍抗黑腐病QTL定位。在前人的報道中,遺傳圖譜大部分采用的是RFLP、ALFP等標記,而對SSR和InDel標記使用得較少,本研究所采用的SSR和InDel標記,大部分都是基于甘藍重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的標記,具有明確的物理圖譜位置,可以直接把遺傳圖譜和物理圖譜對應(yīng)起來,為進一步的基因定位和克隆提供便利;而且這類標記數(shù)量多揭示的多態(tài)性高、具有多等位基因提供的信息量大、以孟德爾方式遺傳共顯性及成本低等優(yōu)點,多用于QTL初步定位[34]。本研究構(gòu)建的遺傳圖譜共有9條連鎖群,總長度為714.29 cM,包含154個分子標記,標記之間的平均圖距為4.64 cM,在圖譜長度方面優(yōu)于繆體云[35](圖譜總長度為655.00 cM,包含458個標記)的研究;同時在標記數(shù)量和長度方面均優(yōu)于李梅[36](圖譜總長度677.70 cM,包含113個標記)的研究。本圖譜雖然可以提高甘藍遺傳圖譜的飽和度,但要進行精細定位和基因克隆還需要增加標記數(shù)量來提高該遺傳圖譜的密度。

3.2 結(jié)球甘藍抗黑腐病QTL定位

在甘藍抗黑腐病的研究中,苗期噴霧法常用于甘藍黑腐病菌接種。劉澤慈[23]利用田間分離的黑腐病3號生理小種對結(jié)球甘藍RILs與CSSLs群體進行噴霧法接病鑒定,共定位到分布在甘藍第1,2,7和8號染色體上的11個抗黑腐病QTL,其中于7號染色體M35～M25區(qū)域在2次定位過程中表現(xiàn)出較強抗性,為穩(wěn)定的QTL位點,可解釋16.0%的表型貢獻率。Doullah等[37]在2,3,7,9號連鎖群上共鑒定到4個QTL位點,在2,9號連鎖群上定位到的是2個主效的QTL位點,可以為選育抗黑腐病品種提供標記輔助選擇,但由于構(gòu)建圖譜時只使用了92對分子標記,所以在定位的可信度上還缺乏說服力。其中,在7號染色體上檢測到位于IPI～FLC3,LOD為2.25,解釋了14.7%的表型貢獻率。Kifuji等[38]利用甘藍富士早生抗病品種和青花菜感病品種構(gòu)建了1個F2群體,并新開發(fā)了161個EST-SNP標記,用于黃單胞菌黑腐病抗性的QTL分析,使得能夠開發(fā)在甘藍黑腐病抗性育種中有用的SNP標記提供了參考。鑒定得到3個位于2,4,5號連鎖群上QTL位點,其中包含1個主效的位點QTL-1,位于2號染色體,最高可解釋的表型貢獻率為15.05%;同時在4號染色體的bocl4271s～bocl2635s標記間存在1個主效QTL位點,LOD值為4.86,可解釋12.21%的表型貢獻率。Lee等[39]通過在2個具有不同抗黑腐病能力的甘藍自交系上開發(fā)dCAPS標記,并結(jié)合之前的圖譜,在1,3,6號染色體上共檢測到4個QTL位點,其中在3次的重復(fù)試驗中BRQTL-Cl2位點都有被檢測到,為穩(wěn)定的QTL位點,可解釋的表型貢獻率為15.1%～27.3%,在6號染色體的sR12387～BnGMS353標記區(qū)間內(nèi)有1個QTL位點,LOD值為3.847,可解釋的表型貢獻率為19.6%。本研究主要在4,6,7號染色體上檢測到抗黑腐病QTL位點,前人的報道中,在這些染色體上也檢測到了QTL位點,進一步說明了本研究結(jié)果的可靠性。但由于所用材料的不同,在相同染色體上定位的區(qū)間也有所不同,由此可以說明,影響QTL定位的因素有很多,雙親材料及群體類型、接病所用的黑腐病生理小種、分子標記、表型鑒定標準的不同及環(huán)境因素的影響都會導(dǎo)致定位結(jié)果存在異同。本試驗在7號染色體CG842110～CG842482標記間定位到1個QTL位點qBR-7-2,這個位點是定位到的3個位點中效應(yīng)最大的位點,LOD值為5.75,可解釋的表型貢獻率為16.0%,且這2個標記間距離只有0.3 cM,此區(qū)域有很高的研究價值,在后續(xù)的研究中可以以該區(qū)域為重點去開展試驗,為主效QTL的精細定位奠定了良好基礎(chǔ)。

本研究利用Joinmap 4.0構(gòu)建結(jié)球甘藍F2群體遺傳連鎖圖譜,并對黑腐病抗性進行QTL定位。構(gòu)建的遺傳圖譜有9條連鎖群組成,共有154對分子標記(110對InDel標記,44對SSR標記),全長714.29 cM,平均圖距為4.64 cM。利用MapQTL 6.0以LOD≥1.5作為入選標準,共檢測出7個QTL位點,對黑腐病抗性的可解釋表型貢獻率為4.8%～16.0%。其中,有3個LOD值≥3.0為抗黑腐病的主效位點,有2個位點qBR-7-2和qBR-7-3分別在7號染色體上CG842110～CG842482及M29～M39標記間,另1個則位于4號染色體上的qBR-4-3在CD838151～BOE417標記間,3個主效QTL的LOD值分別為5.75,3.20和3.47,可解釋的表型貢獻率分別為16.0%,9.2%,10.0%,該研究結(jié)果可以為甘藍抗黑腐病基因克隆及抗黑腐病品種的分子標記輔助選擇提供理論指導(dǎo)。